分子生物学课件第六章 DNA的重组与转座

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DNA重组与转座精讲

二、特异位点重组
特异位点重组广泛存在于各类细胞中。起着十分特殊的作用。包括：某些基因表达的调节发育过程中程序性DNA重排病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。
此过程往往发生在一个特定的短的(20～200 bp) DNA序列内 (重组位点)，并且有特异的酶(重组酶)和辅助因子对其识别和作用。
有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很低，但在实验室中可以人工促使转化。例如大肠杆菌，用高浓度Ca2+处理，可诱导细胞成为感受态，重组质粒得以高效转化。
转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能。如：感受态因子、与膜结合的DNA结合蛋白、自溶素、多种核酸酶等。感受态因子诱导与感受态有关的蛋白质表达，自溶素使与膜结合的DNA结合蛋白和使核酸酶裸露出来，当游离DNA与膜结合的DNA结合蛋白结合后，核酸酶使其中一条链降解，另一条链被吸收，与染色体DNA重组。
1
插入序列插入序列是最小的转座因子。所有插入序列的两端都有反向重复 ( inverted repeats)，为转座酶识别所需，通常重复序列长度为15～25 bp。重复序列有时只是类似，并非完全相同。

4.细菌的细胞融合在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。在实验室中，用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使之成为原生质体，可人工促进原生质体的融合，由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。
(三) 重组有关的酶
大肠杆菌重组有关的酶: RecA：诱发SOS反应，促进DNA单链的同化 RecF、O、R：调节RecA纤丝的装配与拆卸 RecB、C、D：产生参与重组的DNA单链 RuvA、B、C：产生促进异源双链的形成和切开

分子生物学课件第六章DNA重组和转座

1.1 概述
1.1.1 重组与变异
变异是生物进化的重要因素之一，生物对环境的适应机制，自然选择的重要基础。可遗传的变异：突变（点突变，染色体变异）频率低，突变修复
遗传重组交换染色体的自由组合普遍发生染色单体间的交换自然界DNA分子均是重组体
分子克隆和转基因技术(in vitro) 分子生物学课件第六章DNA重组和转座
第六章 DNA的重组与转座
1 DNA的重组
1.1 概述 1.1.2 遗传重组的类型
根据的DNA序列和所需蛋白质因子的要求进行分类：
同源重组（homologous recombination）、位点专一性重组（site-specific recombination）和转座重组（transposition recombination）和异常重组（illegitimate recombination）
3’
5’
切割
5’
3’
Meselson-Radding模型单链入侵模型（链转移模型）
置换
侵入
同化异构化分支迁移
分子生物学课件第六章DNA重组和转座
双链断裂重组模型实验表明，两DNA分子必需具有75 bp以上的同源区才能发生同源重组，同源分区子生物小学课于件第六此章D数NA重值组和转将座显著降低重组率。
遗传重组：生物体内的基因交流。重组DNA技术：体外人为地将不同源的DNA组合在一起。
1.1.4 遗传重组的生物学意义
它能迅速增加群体的遗传多样性(diversity)；使有利突变与不利突变分开(separation)；通过优化组合(optimization)积累有意义的遗传信息。
分子生物学课件第六章DNA重组和转座

分子生物学DNA的重组与转座公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件

第8页
7.1.4 同源重组酶学机制
细菌接合、转化以及转导重组都是同源重组，并且这种重组是发生在一个完整环状双螺旋 DNA分子与一个双链或单链DNA分子片段之间。且重组需要RecA和RecBCD蛋白质。 Recombination
第9页
7.2 位点特异性重组
site-specific recombination
第11页
7.2.1 λ phage DNA整合与切除 1、实现机制：
均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间重组
2、特定位点-----附着位点（attachment site att）
E.coli attB 以BOB`表示，由 23bp λ phage attP 以 POP`表示
240bp ◘ 关键序列 “O”完全一致
第13页
溶菌周期（lysis）
溶源性细菌原噬菌体 (lysogen)
第14页
4、整合分子机制
◘ 关键序列O全长15bp，富含A-T
◘ 发生在O内重组互换位点相距 7bp
◘ attP位点负超螺旋为重组所必须---加强了Int和IHF亲和力 -----高剂量蛋白维持单链重组所必需结构
◘ 整合酶结合位点：attP 240bp、attB 23bp(二者作用不同)
◘ Int结合 ----关键序列反向位点（切割位置） ----结合在att臂上（臂与关键区靠近）
第15页
int IHF
Xis
第16页
◘ 整合体及其作用整合体（intasome）--Int和IHF结合到attP时复合物
◘ 整合体捕获attB，阐明-----
a、attB和attP最初辨认靠Int 辨认两序列能力
含有一个中心序列和位于两侧臂（arm）；除了和本身转座相关基因外，中心序列含有抗

DNA的重组与转座培训教材(PPT 93页)

酿酒酵母的rad 51基因与大肠杆菌recA基因
同源，二者功能相关。该基因的突变造成双链断裂积累，且无法形成正常的联合复合物，但此蛋白不能在体外与单链DNA形成纤丝，表明原核与真核的同源重组机制可能不同。
33
特异位点重组广泛存在于各类细胞，有关主要过程：
某些基因表达的调节；发育过程中程序性DNA重排；有些病毒和质粒复制中发生的整合与切除。
666666666666第............111112333111.........六同特D123331233...λ.N切章源异同异细细1243噬A除重位源源菌菌细遗细细菌重D组点重双基的菌传菌菌体组N重组链因特的转的的D技NA组的与转异接化转细术A的分基移位合导胞整子因与点作融重合模转重重用合与组型换组组与转6666666666666.............4444444454444座...........D逆12223462351..逆逆逆N转转转转转转真12A转转转录座座座座座核插复的座座座转子子子子引生入合转子子子座的的转转起物序转座的的的子概分座座遗的列座结作生念类的的传转(子I构用物S机特学座(T特机学因制征效因n点制意)子应子义)
发重组； ③断裂后形成单链3‘游离端，后者侵
入到双链DNA内，寻找同源区域并配对结合，产生短的链置换区； ④断裂单链游离端彼此交换，每条链与另一对应链连接，形成Holliday 中间体
9
⑤ 通过 RuvA和 RuvB 引发分支迁移，产生异源双链DNA； ⑥通过RuvC形成拆分口，将四链 DNA 复合体按不同方向拆分，形成片段重组体和拼接重组体。
选择
1、紫外线照射对DNA分子的损伤主要是: ( D )
A.碱基替换； B.磷酸酯键断裂； C.碱基丢失； D.形成共价连接的嘧啶二聚体。

分子生物学：DNA重组与转座

整合宿主因子
同源区域attP（）与attB（宿主）的重组
噬菌体从宿主基因组切除
Int、切除酶（Xis，的xis基因编码） IHF
整合的逆过程
附着（整合）位点（att sites）
attP与attB只在它们的中间区域有一小段同源序列（15 bp，称为O）
attP的必需序列为235 bp（从–152到+82,以O的中点为0），而attB 必需序列约为25 bp（从–12到+12 ）
A
G
B
A
A
B
a
C
b
a
T
b
A
G
b
A
A
b
a
C
B
a
T
B
Holliday 模型中，由于重组而产生的异源双链区存在不配对碱基，可被细胞内的修复系统能够识别并以一条链为模板进行切除修复：
(1). 两个杂种分子均未得到校正，有丝分裂后分离形成4:4 或 3:1:1:3的异常孢子分离比，属于半染色单体转变；
TNA家族
具有如下特征：（1）长度较长，2.5-20 kb；（2）两侧含有较长的反向重复序列；目标区域产生正向重复（3）内部含有一个或几个结构基因。常见的结构基因有：转座酶基因—tnpA，解离酶基因—tnpR和抗生素抗性基因。（4）转座完成以后可导致约5 bp长的靶位点序列加倍，从而在转座子两侧产生直接重复序列。
5 • 基因转换(conversion)发生的机率,随突变位点离DNA 交叉
点的距离增大，而表现逐渐变小的极性梯度的效应
酵母Arg4（ 1989年，JackSzostak ） 7 multip—alleles (非全同等位基因)
Nsph I,Acc-I, R-V, Bel-I, Dra-III,Aha-II, Bgl-II 在杂合二倍体中，基因转换频率从5’ 3’极性递减

分子生物学课件DNA的修复和转座

DNA修复和转座：在生物技术中具有重要的研究价值，如基因表达调控、基因进化等
汇报人：
转座子元件（Transposable element）：可移动的DNA序列，可在基因组中插入和删除
转座子复合体（Transposon complex）：由转座子和转座酶组成的复合体，可在基因组中插入和删除
转座子家族（Transposon family）：具有相似序列和功能的转座子集合
转座子：一பைடு நூலகம்可以在基因组中移动的DNA序列
光修复：通过光修复酶修复受损的DNA
核酸内切酶：切割DNA双链，形成单链缺口
DNA聚合酶：填补单链缺口，形成新的DNA双链
连接酶：连接 DNA双链，形成完整的DNA分子
拓扑异构酶：改变 DNA拓扑结构，使 DNA能够顺利复制和转录
识别损伤：识别 DNA损伤的位置和类型
切除损伤：切除损伤的DNA片段
端粒缩短： DNA端粒缩短，导致细胞衰老和死亡
碱基切除修复：切除受损的碱基，再通过 DNA聚合酶填补空缺
核苷酸切除修复：切除受损的核苷酸，再通过DNA聚合酶填补空缺
重组修复：通过同源重组修复受损的DNA
非同源末端连接修复：通过非同源末端连接酶修复受损的DNA
错配修复：通过错配修复酶修复受损的DNA
DNA修复：保持遗传信息的稳定性，避免
突变积累
DNA转座：增加基因多样性，促进生物进化
修复和转座：共同作用，推
动生物进化
修复和转座：对生物适应环境变化具有重
要意义
DNA修复和转座是细胞正常生理过程的一部分，如果发生异常，可能导致疾病发生。
DNA修复和转座异常可能导致基因突变，从而引发癌症等疾病。

DNA的重组与转座PPT课件

DNA的重组与转座
7
➢细菌的接合作用（Bacterial Conjugation) Sex pillus
Extra genetic material
Genome of the recipient
F-factor for cleavage the circular DNA
DNA的重组与转座
8
▪ Transformation
Ruv A (DNA 重组与修复蛋白）
RuvB
rec F
与双链DNA和单链DNA结合
rec O
促进互补的单链DNA的复性
rec R
参与DNA的修复与重组
recB, rec C, 1.依赖于ATP的外切酶的活性；
rec D
2.可被ATP增强的内切酶的活性；
3. ATP依赖的解旋酶的活性。
ruv A
DNA解旋酶。特异的作用于Holliday衔接点，并与RuvB 相互作用，促进Ruv A 及RuvB沿着DNA链移动及双链 DNA的解旋。
DNA的重组与转座
26
➢转座引起的遗传学效应
1.引起插入突变 2.在插入位置染色体DNA重排而出现新基因 3.影响插入邻近基因的表达，使宿主表型改变 4.转座子插入染色体后引起两侧染色体畸形
DNA的重组与转座
27
➢真核生物的转座因子(The Transposable element in Eukaryote)
DNA的重组与转座
1
同源重组（Homologous recombination）
同源重组:在有相同或近于相同碱基序列（75bp以上）的DNA分子之间的遗传交换，发生在减数分裂过程。
同源重组具备的条件： 1）两条同源双链DNA分子紧密结合； 2）两个DNA链上同一个部位的单链断裂

第6章DNA的重组与转座PPT文档95页

END
第6章DNA的重组与转座
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只在愚人的字典中找得到。--拿破仑。 37、不要生气要争极，不要心动要行动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要素。(注意：传统观念认为勤奋和机会是成功的要素，但是经过统计学和成功人士的分析得出，乐观是成功的第三要素。
39、没有不老的誓言，没有不变的承诺，踏上旅途，义无反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识的人，决不会坚韧勤勉。
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃

第六章_DNA的重组与转座

目录
RuvB是一种解螺旋酶，通过水解ATP而推动分支移动(图4-4)。RuvAB复合物的移动速度约为10～20 bp/s。同源重组最后由 RuvC将Holliday联结体切开，并由DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复合成。 RuvC是一种核酸内切酶，特异识别 Holliday联结体并将其切开。它识别不对称的四核苷酸ATTG，此序列因而成为切开 Holliday联结体的热点，并决定
目录
不同生物体内同源重组的具体过程可以有许多变化，但基本步骤大致相同。同源性并不意味序列完全相同。两DNA分子只要含有一段碱基序列大体类似的同源区，即使相互间略有差异，仍然可以发生重组。同源重组是最基本的重组方式，它参与各种重要的生物学过程。复制、重组和重组修复三个过程是密切相关.
目录
目录
4
在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组。在实验室中，用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使之成为原生质体，可人工促进原生质体的融合，由此使两菌株的 DNA 发生广泛的重组。
目录
(三) 重组有关的酶
已经分离并鉴定了原核生物和真核生物促进同源重组各步骤有关的酶，研究最多的还是大肠杆菌的酶。在大肠杆菌中， RecA蛋白参与重组是最关键的步骤。 RecA有两个主要的功能：诱发SOS反应和促进DNA单链的同化(assimilation)。
5´
DNA 连接酶
3´ 3´
DNA 连接酶
3´ 3´
5´
5´
5´3´ 3´
5´ 3´
5´
3´
目录
DNA同源重组是一个十分精确的过程，哪怕只有一个核苷酸的差错都会造成基因失活。同源重组的分子基础是链间的配对，通过碱基配对才能找到正确位置，进行链的交换。当两同源DNA分子之一发生双链断裂，经核酸酶和解螺旋酶作用，产生具有3′末端的单链，它在另一DNA分子的同源区寻找互补链并与之配对。相对应的链则被置换出来，与原来断裂

分子生物学：重组和转座共35页

45、法律的制定是为了保证每一个人自由发挥自己的才能，而不是为了束缚他的才能。—— 罗伯斯庇尔
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。—1、实际上，我们想要的不是针对犯罪的法律，而是针对疯狂的法律。 ——马克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就像影子跟随着身体一样。— —贝卡利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进步。— —杰弗逊 44、人类受制于法律，法律受制于情理。— —托·富勒

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置换
侵入
同化异构化分支迁移
双链断裂重组模型
实验表明， DNA分子必需具有75 bp以上的同源区以上的同源区才实验表明，两DNA分子必需具有75 bp以上的同源区才分子必需具有能发生同源重组，同源区小于此数值将显著降低重组率。能发生同源重组，同源区小于此数值将显著降低重组率。
1.2.1 同源重组的分子机制 Holliday模型 ⑶ Holliday模型
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座
DNA的重组 1 DNA的重组
1.2 同源重组 1.2.1 同源重组的分子机制断裂重接模型（Breakage—rejoining rejoining） ⑴ 断裂重接模型（Breakage rejoining） a A b B
1930 Darlington)
特征
◘ 涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大涉及同源序列间的联会配对，涉及DNA DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生 ◘ 涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程异源双链区的生成 ◘ 存在重组热点 ◘ 需要重组酶单链DNA分子或单链DNA DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号 ◘ 单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号
DNA的重组 1 DNA的重组
DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合， DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称 recombination),或者或者基因重排为遗传重组 (genetic recombination),或者基因重排重组产物为重组体重组体DNA (gene rearrangement) 。重组产物为重组体DNA (recombinant DNA) 。
产生重组体
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座
Holliday 中间体
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座
DNA的重组 1 DNA的重组 1.2 同源重组 1.2.2 细菌的基因转移与重组细菌基因转移主要有四种机制：接合(conjugation)、细菌基因转移主要有四种机制：接合(conjugation)、 (conjugation) 转化(transformation) 转导(transduction) (transformation)、 (transduction)和转化(transformation)、转导(transduction)和细胞融合 fusion)。进入受体细胞(recipient cell)的外源基因 (cell fusion)。进入受体细胞(recipient cell)的外源基因通常有四种结果：降解、暂时保留、通常有四种结果：降解、暂时保留、与内源基因置换和发生整合。和发生整合。共同特点是：共同特点是：单方向转移； ⑴ 单方向转移；产生部分二倍体（ diploid）； ⑵ 产生部分二倍体（partial diploid）； ⑶ 基因只有整合到环状染色体上才能稳定地遗传。地遗传。
a A
B b
⑵模板选择复制模型（copy-choice ）模板选择复制模型（copy-
(1931 Belling)
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座
1.2.1 同源重组的分子机制 Holliday模型 ⑶ Holliday模型
1964年美国学者Robin Holliday提 1964年美国学者Robin Holliday提年美国学者出了著名的Holiday模型。 Holiday模型出了著名的Holiday模型。 Holliday结构 ◘ Holliday结构同源重组中连接两个DNA DNA双链同源重组中连接两个DNA双链的交换中间物,含有4 DNA链的交换中间物,含有4股DNA链，在连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点。的连接点。 Holliday结构形成的分子机制结构形成的分子机制（ ◘ Holliday结构形成的分子机制（断裂复合起始机制）起始机制）
分枝迁移（ migaration） ◘ 分枝迁移（branch migaration）－－双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散－－双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座
Holliday的异构化 Holliday的异构化 Holliday结构一经生成即可 Holliday结构一经生成即可不断地处于异构化－－－－异源双链不断地处于异构化－－异源双链 heteroduplex DNA
1.1 概述 1.1.1 重组与变异
变异是生物进化的重要因素之一，生物对环境的适变异是生物进化的重要因素之一，应机制，自然选择的重要基础。应机制，自然选择的重要基础。可遗传的变异：可遗传的变异：点突变，染色体变异）频率低，突变（点突变，染色体变异）频率低，突变修复遗传重组交换染色体的自由组合普遍发生自然界DNA DNA分子均是重组体染色单体间的交换自然界DNA分子均是重组体分子克隆和转基因技术(in 分子克隆和转基因技术(in vitro)
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座
1.2.2 细菌的基因转移与重组 ⑴ 接合作用细菌的细胞相互接触时遗传信息可以由一个细胞转移到另一个细胞。细胞转移到另一个细胞。
性因子或F因子：编码与接合功能有关的蛋白质，性因子或F因子：编码与接合功能有关的蛋白质，能够促使染色体基因转移的质粒称为致育因子、性因子或F 使染色体基因转移的质粒称为致育因子、性因子或F因子
有双链侵入模型、单链侵入模型、有双链侵入模型、单链侵入模型、双链断裂修复模型
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座
5‘ 5‘
双链侵入模型
（1））
（2））
3’ 5’ 5’ 3’
切割
Meselson-Radding模型 Meselson-Radding模型单链入侵模型（链转移模型）单链入侵模型（链转移模型）
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座
DNA的重组 1 DNA的重组
1.2 同源重组
同源重组又称一般性重组。同源重组发生在DNA的同源重组又称一般性重组。同源重组发生在DNA的同又称一般性重组 DNA 源序列之间真核生物非姊妹染色单体的交换，之间，非姊妹染色单体的交换源序列之间，真核生物非姊妹染色单体的交换，姊妹染色单体的交换，细菌及某些低等真核生物的转化，细菌色单体的交换，细菌及某些低等真核生物的转化，的交换转化转导、接合等都属于这类型。等都属于这—类型的转导、接合等都属于这类型。
1.1.4 遗传重组的生物学意义
它能迅速增加群体的遗传多样性(diversity)；它能迅速增加群体的遗传多样性(diversity)； (diversity) 使有利突变与不利突变分开(separation) (separation)；使有利突变与不利突变分开(separation)；通过优化组合(optimization)积累有意义的遗传信息。 (optimization)积累有意义的遗传信息通过优化组合(optimization)积累有意义的遗传信息。
IS3 δ IS3 O IS2
P
OriT
OriV
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座
复
制
区
1.2.2 细菌的基因转移与重组 ⑴ 接合作用
表 8-3 F 因子与转移功能有关的基因及功能基因基因产物的功能 tre M 衣壳蛋白，可能涉及对受体 F -细胞的识别 tra J 是 tre M 和 tra 操纵子转录的正调控因子 fin P 是 tra J 的反向转录调节物 tra Y 内切酶，在 oriT 附近产生缺口 tra A 编码性伞毛蛋白 tra 性伞毛的装配和修饰 L,E,K ,B,V,C ,W trb C ,tra U ,F,H ,G 性伞毛的装配和交配接合物的稳定 tra N 同上 tra S,T 表面排斥阻止和 F＋接合 tra D 是 F ＋的内膜蛋白。接合时涉及 DNA 转运，可能是孔道部分。 tra I 解旋酶性质的复制蛋白，可切开 Ori T 的 nic 位点。
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座
1 DNA的重组 DNA的重组
1.1 概述 1.1.2 遗传重组的类型
根据的DNA序列和所需蛋白质因子的要求进行分类：根据的DNA序列和所需蛋白质因子的要求进行分类： DNA序列和所需蛋白质因子的要求进行分类同源重组（ recombination）、）、位点专一同源重组（homologous recombination）、位点专一性重组（siterecombination）性重组（site-specific recombination）和转座重组 recombination）（transposition recombination）和异常重组 recombination）（illegitimate recombination）大肠杆菌中四种遗传重组的一般特征是否需要序列同源性同源重组是位点专一性重组是转座重组否异常重组否类型是否需要是否需要序 RecA蛋白质 RecA蛋白质列特异性酶否是否是否是否？
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座
DNA的重组 1 DNA的重组
1.1 概述遗传重组与重组DNA DNA技术 1.1.3 遗传重组与重组DNA技术
遗传重组：生物体内的基因交流。遗传重组：生物体内的基因交流。重组DNA技术：体外人为地将不同源的DNA组合在一起。 DNA技术 DNA组合在一起重组DNA技术：体外人为地将不同源的DNA组合在一起。
第六章 DNA的重组与转座的重组与转座