2016年秋季学期微生物学实验报告1、了解医学微生物学主要的研究方法和手段，掌握基本技能和基本原理。
2、熟悉常见病原性球菌及常见肠道致病菌的检查程序，掌握各检查实验操作。
3、了解脓汁和粪便标本中病原菌的检测的临床应用及临床意义。
4、熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。
5、熟悉抗生素对于不同细菌的作用机理。
6、树立牢固的无菌观念。
二、实验器材：1、培养基：营养琼脂平板、伊红美兰平板、斜面、营养肉汤、半固体琼脂2、标本：脓汁标本、粪便标本、空气细菌培养物、手指皮肤细菌培养物、细菌分离培养物、斜面培养物、营养肉汤培养物、药敏试验培养物3、器材：1）培养基的制备：天平、称量皿、药勺、锥形瓶、量筒、试管、试管架、刻度吸管、洗耳球、棉塞、牛皮纸、橡皮筋、干粉培养基、酒精灯、火机。
2）细菌的分离培养：碘酒棉球，酒精棉球、眼科镊子、接种环。
3）细菌的纯培养: 接种环。
4）细菌的形态学检查：生理盐水、镜油瓶、拭镜纸、吸水纸、载玻片、结晶紫染液、芦戈氏碘液、95%酒精、稀释石炭酸复红、染色架、接种环。
5）细菌的生化试验:糖发酵管、抗菌素（青霉素、链霉素、庆大霉素）纸片、眼科镊子、接种针、接种环、小砂轮、葡萄糖发酵微量管、乳糖发酵微量管、兔血浆、生理盐水、载玻片。
6）结果分析：尺子。
三、方法与步骤1、营养肉汤培养基的制备取1.1g营养肉汤粉末于锥形瓶中，加入50ml蒸馏水，摇晃锥形瓶使其几乎完全溶解。
将锥形瓶置于电陶炉上加热至沸腾，观察固体是否完全溶解，冷却后分装至试管内。
2、细菌的分离培养（平板划线分离法）甲→脓汁标本→营养琼脂平板乙→脓汁标本→营养琼脂平板丙→粪便标本→伊红美蓝平板丁→粪便标本→伊红美蓝平板1）接种环烧灼灭菌，以免污染标本。
2）取标本3～5ul。
3）转动平板，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。
4）接种环与平板呈30～40度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条5）甲、乙烧掉接种环上多余的标本。
6）转动平板，通过第一区5～7次，使接种环重新沾上少量细菌，同样的方法划第二区。
7）转动平板，接种环通过第二区1次，划第三区，同样的方法划第四、五区。
注意：每区划线不少于30条，整个平板划线不少于150条线。
上下两条线重叠不影响分离结果。
3、细菌的纯培养（斜面接种法）甲→普通平板→黄色菌落→1支斜面乙→普通平板→白色菌落→1支斜面丙→ EMB平板→紫黑菌落→1支斜面丁→ EMB平板→粉红菌落→1支斜面1）接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉一条细菌接种线。
2）再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线。
3）细菌涂布接种在斜面培养基的表面。
注意：斜面正面上2/3作标记：组号 + 金黄、白色、紫黑、粉红。
接种时，接种杆连接部不能碰到斜面培养基。
4、细菌的形态学检查（革兰染色法）甲→金黄、紫黑乙→白色、粉红丙→金黄、紫黑丁→白色、粉红涂片→干燥→固定→染色1）涂片：用取液枪取生理盐水于洁净的载玻片上。
接种环烧灼灭菌，取菌苔少许与盐水混匀，涂成大于1cm2均匀涂膜。
涂毕，环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌，进行第二次涂片。
2）干燥：静置干燥或将其置于酒精灯上方加热干燥。
3）固定：手持载玻片一端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2～3秒钟。
4）染色：结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈氏碘液→媒染1分钟→水洗→95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗→稀释品红→复染1分钟→水洗→吸干,镜检注意:取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。
影响革兰染色的关键步骤是涂片和脱色。
5、细菌的生化试验细菌的糖发酵实验甲→紫黑→①葡萄糖乙→紫黑→②乳糖丙→粉红→③葡萄糖丁→粉红→④乳糖1）砂轮在糖发酵管液面上方2～3cm处切割，然后，向切口外侧分离掰断，管口烧灼灭菌。
2）接种针针尖斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。
退出接种针，烧灼灭菌。
3）管口朝向相同，放置在平皿内。
抗菌素敏感性试验（纸片扩散法）甲→金黄菌液乙→白色菌液丙→紫黑菌液丁→粉红菌液1）取菌液在平板上划出“十字形”细菌接种线。
2）在平板上半部，作连续来回密集划线，划二分之一平板。
3）旋转平板90度角，二次密集划线，重复三次。
4）设计三点，呈等边三角距离，点距离平板边缘约15mm。
分别作标记：青霉素、头孢曲松、庆大霉素。
5）镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，镊子火焰消毒。
凝固酶实验1）取两滴兔血浆(rabbit plasma)置于洁净的玻片上。
2）分别用接种环取白色和金黄色菌苔(约2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合成直径8～10mm的一层薄菌膜，立即观察结果。
3）菌液出现明显凝块者为阳性，否则为阴性。
细菌动力学实验（半固体穿刺接种法）甲→紫黑乙→紫黑丙→粉红丁→粉红接种针斜面取菌，从半固体中心,垂直刺入，到达培养基底部五分之四处，再循原来的路线,退出接种针。
管口、接种针经火焰烧灼灭菌。
6、玻片凝集试验1）取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。
远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul。
2）用接种环分别取粉红色菌苔，约1～2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀。
四、结果与讨论1、营养肉汤培养基的制备现象：加入蒸馏水后，粉末几乎完全溶解。
加热至沸腾后，粉末完全溶解，有香味。
2、细菌的分离培养（平板划线分离法）图1 甲→脓汁标本→营养琼脂平板图2 乙→脓汁标本→营养琼脂平板图3 丙→粪便标本→伊红美蓝平板图4 丁→粪便标本→伊红美蓝平板结果观察：见图1圆圈，脓汁标本在营养琼脂平板上有金黄色和白色两种菌落，菌落直径2mm左右，圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，不透明。
见图4圆圈，粪便标本在伊红美蓝平板上有紫黑色和粉红色两种菌落。
紫黑色菌落较大，圆形，隆起，不透明，在光下能见金属光泽。
粉红色菌落直径2mm左右，圆形，隆起，半透明。
分析讨论：金黄色菌落和白色菌落的颜色是自身产生脂溶性色素并使菌落着色。
紫黑色菌落（大肠埃希菌）发酵乳糖，产酸并产气，当细菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。
粉红色菌落（福氏志贺菌）在碱性环境中不分解乳糖产酸，伊红和美蓝不能结合，故在伊红美蓝培养基上呈无色半透明菌落，而伊红美蓝培养基本身为红色，因此菌落呈现粉红色。
若培养时间过长，会导致大肠埃希菌由紫黑色菌落转为粉红色菌落。
错误操作分析：乙划线过于稀疏，导致最终分离效果不理想。
丙可能是划线时用力太轻，细菌没有接种成功。
3、细菌的纯培养（斜面接种法）图5 细菌的纯培养实验结果从左往右依次为甲→普通平板→黄色菌落乙→普通平板→白色菌落丙→ EMB平板→紫黑菌落丁→ EMB平板→粉红菌落结果观察：金黄色菌落和白色菌落在斜面培养基上仍呈现原本的颜色，而紫黑菌落和粉红菌落不再是紫黑色和粉红色，而是呈现灰白色。
分析讨论：进一步证明金黄色菌落和白色菌落颜色为自身产生的脂溶性色素，而紫黑菌落和粉红菌落颜色非自身色素。
4、细菌的形态学检查（革兰染色法）图6 金黄色菌、白色菌染色结果图7 粉红色菌、紫黑色菌染色结果镜下观察：油镜下，金黄色菌和白色菌均为G+菌，球形，呈葡萄串状排列。
粉红色菌和紫黑色菌均为G-菌，杆状。
分析讨论：结合菌落色素，猜测金黄色菌为金黄色葡萄球菌，白色菌为白色葡萄球菌。
粉红色菌和紫黑色菌尚未知具体菌种，需进行生化试验进一步检验。
5、细菌的生化试验细菌的糖发酵实验图8 细菌的糖发酵实验结果从左往右依次为：甲→紫黑→①葡萄糖乙→紫黑→②乳糖丙→粉红→③葡萄糖丁→粉红→④乳糖编号菌苔糖发酵管反应现象结果描述符号甲紫黑①葡萄糖发酵管变黄色有气泡分解葡萄糖产酸产气⊕乙紫黑②乳糖发酵管变黄色有气泡分解乳糖产酸产气⊕丙粉红③葡萄糖发酵管变黄色无气泡分解葡萄糖产酸不产气+ 丁粉红④乳糖发酵管无变色无气泡不分解乳糖-表1 糖发酵实验结果注：+：产酸或阳性⊕：产酸产气-：阴性错误操作分析：4号发酵管的上端变成了黄色。
由于3号发酵管无气泡，因此培养时间过长导致大肠埃希菌由紫黑色菌落转为粉红色菌落的可能性较小。
可能是有杂菌污染。
抗菌素敏感性试验（纸片扩散法）图9 抗菌素敏感性试验结果甲→金黄菌液乙→白色菌液丙→紫黑菌液丁→粉红菌液编号菌苔抗生素青霉素头孢曲松庆大霉素甲金黄+（42mm）+（27mm）+（30mm）乙白色-（18mm）-（18mm）+（21mm）丙紫黑-（0mm）+（32mm）+（28mm）丁粉红-（0mm）+（40mm）+（24mm）表2 药敏试验结果分析（录入）注：耐药-，中度敏感±，敏感+；括号内为抑菌圈直径。
分析讨论：理论上G+球菌对青霉素敏感，G-杆菌对青霉素耐药。
G+球菌和G-杆菌对头孢曲松和庆大霉素都敏感。
而实验中发现白葡菌对青霉素和头孢曲松均为耐药，可能是白葡菌产生了耐药性。
PBPs（青霉素结合蛋白）是青霉素的作用靶位。
葡萄球菌可以改变PBPs的性质，大大降低其与青霉素的亲和力，从而表现出耐药性。
这种耐药机制一旦产生，葡萄球菌可以对几乎所有的β-内酰胺类抗生素（青霉素类、头孢菌素类等）耐药。
错误操作分析：甲的抗生素纸片放置点距离中心太近，而金葡菌对这三种抗生素都非常敏感，导致三个抑菌圈重叠过多，难以测量抑菌圈直径。
凝固酶实验图10 凝固酶实验结果左为金黄色菌右为白色菌结果观察：金黄色菌很快凝固，出现明显凝块。
白色菌不易凝固，容易涂抹均匀。
错误操作分析：实验结果不明显，可能是菌液不够多或研磨混合不充分。
细菌动力学实验（半固体穿刺接种法）图11 细菌动力学实验结果从左往右依次为：乙→紫黑甲→紫黑丁→粉红丙→粉红编号菌苔实验现象结果描述符号甲紫黑细菌自接种部位向四周移动、扩散生长，培养基呈云雾状或根须状混浊状态细菌有鞭毛+乙紫黑细菌自接种部位向四周移动、扩散生长，培养基呈云雾状或根须状混浊状态细菌有鞭毛+丙粉红沿着接种线生长，培养基清澈透明细菌无鞭毛-丁粉红沿着接种线生长，培养基清澈透明细菌无鞭毛-表3 动力试验结果注：+有鞭毛 -无鞭毛错误操作分析：乙和丙在接种时没有沿着原来的路线拔出接种针，导致接种部位较宽。
6、玻片凝集试验图12 玻片凝集试验结果左为对照区，右为实验区结果观察：对照区菌液均匀混浊，实验区菌液凝集，出现大量凝块。
分析讨论：在适量电解质存在的情况下，颗粒性抗原(细菌)与特异性抗体结合，如果比例合适，则出现肉眼可见的凝集块。
编号菌苔葡萄糖乳糖半固体甲紫黑⊕+乙紫黑⊕+丙粉红+ -丁粉红- -表4 细菌生化反应结果分析（结果录入）7、实验总结标本菌落形态血浆凝固酶葡乳半福痢血清青头庆结论脓汁金黄G+球++ + + 金黄色葡萄球菌脓汁白色G+球- - - + 白色葡萄球菌（可能耐药）粪便紫黑G-杆⊕⊕+ - + + 大肠埃希菌粪便粉红G-杆+ - - ++ - + + 福氏志贺菌表5 脓汁和粪便标本细菌检测结果分析讨论：采用平板划线分离法，从脓汁标本中可分离出金黄色菌和白色菌。
