实验考马斯亮蓝测蛋白质含量

实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量实验目的本实验的目的是通过考马斯亮蓝G250法测定蛋白质的含量，并了解该方法的基本原理。

实验原理蛋白质含量的测定方法有很多，其中比较常用的是考马斯亮蓝G250法。

该方法的基本原理是：靶蛋白质与染料考马斯亮蓝G250反应生成蓝色沉淀，通过比色法测定沉淀的吸光度，即可计算出蛋白质的含量。

具体来说，该方法的操作步骤如下：1.将待测蛋白质样品制备成一定的浓度，并加入一定体积的考马斯亮蓝G250试剂。

2.在一定时间内使反应到达平衡，将反应液离心沉淀。

3.由于考马斯亮蓝G250和蛋白质的结合比较强，一般可以近似认为反应液中大多数考马斯亮蓝G250都与蛋白质结合在一起。

因此，剩余的考马斯亮蓝G250浓度可以通过测定上清液的吸光度得到。

4.根据标准曲线（一般为已知浓度的蛋白质样品的吸光度与浓度的对应关系），可以将上清液的吸光度转化为蛋白质的含量。

实验步骤实验前准备准备工具和试剂，包括：•96孔微孔板•分光光度计•移液器、吸头•加样器•蒸馏水•NaOH溶液（1mol/L）•BSA标准品（2mg/mL）实验操作1.准备5个稀释比例的BSA标准品，分别为0.1、0.2、0.5、1.0和2.0mg/mL。

2.将标准品和待测样品分别加入96孔板中，每个样品重复3次。

3.加入一定体积（如200μL）的考马斯亮蓝G250试剂，混匀。

4.在室温下暗置约5min，使反应充分发生。

5.离心沉淀至液面完全透明。

6.将上清液吸取到另一个96孔板中。

7.加入100μL NaOH溶液，混匀。

8.制备一条标准曲线，测量各标准品和待测样品的吸光度。

数据处理根据标准曲线计算待测样品中蛋白质的含量。

实验注意事项•操作时要注意洁净卫生，避免交叉污染。

•要精确控制试剂的使用量，避免误差。

•每项操作要根据标准程序认真进行，做到数据准确可靠。

实验结果分析通过考马斯亮蓝G250法测定了不同浓度的BSA标准品和待测样品中的蛋白质含量，得到了标准曲线和待测样品的吸光度值。

蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)一、目的考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue) G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，由Bradford于1976年建立，具有简便快捷，灵敏度高，稳定性好等特点，是一种较好的蛋白质定量测定常用方法。

通过本实验学习应用该法测定蛋白质含量的原理，复习分光光度计的使用及标准曲线的绘制等基本实验技能。

二、原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离态呈红色，与蛋白质结合后转变为青色。

在0~1000μg 范围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与蛋白质含量正相关，可用比色法测定。

三、仪器、试剂和材料1．仪器设备：(具塞刻度)试管吸管分光光度计2．试剂(1) 标准蛋白质溶液称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 1 mg/ml溶液。

(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入85% (m/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000 ml (此溶液在常温下可放置一个月)。

(3) 样品蛋白液(10~100 μg/ml)四、操作步骤1标准蛋白质含量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。

2．样品中蛋白质含量的测定取2支(具塞)试管，分别准确加入0.l ml样品蛋白液，再各加5 ml考马斯亮蓝G-50试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线0号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。

五、结果处理根据所测样品提取液的平均吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg/ml)六、思考题1．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？2．如何正确使用分光光度计？。

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量1. 前言嘿，朋友们，今天咱们聊聊一个有趣的话题——考马斯亮蓝法，听起来挺高大上的吧？其实这玩意儿就是用来测定蛋白质含量的，简单来说，就是看看你的食物里到底有多少“肌肉”的成分。

想象一下，咱们吃的肉、蛋、豆腐，都是富含蛋白质的食物，咱们用这个方法可以精确地知道它们含有多少蛋白质，绝对是个好玩的实验，来吧，跟我一起揭开它的神秘面纱。

2. 什么是考马斯亮蓝法？2.1 简单介绍首先，咱们来聊聊什么是考马斯亮蓝法。

它其实是一种颜色变化的实验，听起来是不是有点像魔法？你只要把样品（比如说一小块肉或者一勺蛋白质粉）放在试管里，加点特殊的染料，这染料就叫考马斯亮蓝，之后再加点酸溶液，哇，你会发现颜色发生了变化。

更厉害的是，颜色的深浅就能告诉你蛋白质的含量，简直像变魔术一样！这就是为什么它受到许多科学家和实验室的青睐。

2.2 原理揭秘那么，这个颜色变化的背后，究竟有什么科学原理呢？嘿，别着急，听我慢慢说。

考马斯亮蓝这种染料会和蛋白质中的氨基酸发生反应，形成一种稳定的复合物。

这就像是小伙伴们在一起聚会，越多人参加，气氛就越热烈。

随着蛋白质的浓度增加，复合物的数量也就随之增加，所以颜色也会越来越深。

只要用仪器测量一下颜色的深度，咱们就能算出蛋白质的含量，真是既简单又方便。

3. 实验步骤3.1 准备工作想要在家里试一试这个方法，当然得先做好准备。

首先，你得准备好一些材料：考马斯亮蓝染料、酸性溶液（一般用盐酸就可以）、待测样品（不妨试试豆腐或者鸡肉），还有一些基本的实验器材，比如试管、比色皿、量筒等。

别小看这些东西，有时候实验的成功与否就看这些小玩意儿了。

3.2 操作步骤接下来，就是真正的实验时刻了！首先，咱们把待测样品处理一下，比如切成小块，然后用水萃取出蛋白质。

接着，把提取液倒入试管，加入考马斯亮蓝染料，搅拌均匀。

再倒入酸性溶液，注意，这里要控制好比例，不然可就要出乱子了。

然后，静置几分钟，让颜色充分反应。

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量欧阳学文一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。

因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。

最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。

2、移液管使用（）。

（三）、标准曲线制作：1、A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

1）、利用标准曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图，测出回归线性方程。

即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。

（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。

实验八考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量一实验目的学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量二实验原理考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高度的敏感性。

考马斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为595nm，考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。

在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后，在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。

三实验器材（1）旋涡混合器。

（2）试管1.5cm×15cm（×8）（3）吸管0.10ml（×1），0.50ml（×2），1.0ml（×2），2.0ml（×1），2.0ml（×1）。

（4）722型（或7220型）分光光度计。

（5）容量瓶1000ml（×1）。

（6）量筒100ml（×1）。

（7）电子分析天平。

四实验试剂1、9％NaCL溶液。

2、标准蛋白液；牛血清白蛋白（0.1mg/ml），准备称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl 溶液溶解并稀释至2000ml。

3、染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸，后加蒸馏水定容到1000ml。

4、样品液：取牛血清白蛋白（0.1mg/ml）溶液，用0.9%NaCl稀释至一定浓度。

五实验方法（一）标准曲线的制备1、取7支干净试管，按表15进行编号并加入试剂。

2、混匀，室温静置3min，以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，名标准液浓度（ug/ml）作为横坐标作图得标准曲线。

表15 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的制备（二）样品的测定另取一支干净试管，加入样品液1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。

标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质得含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质得含量。

因此,制作标准曲线就是生物检测分析得一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。

最终试剂中含0、01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4、7%(W/V)乙醇,8、5%(W/V)H3PO4。

2、标准蛋白质溶液:纯得牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0、15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

(二)、器材:1、722S型分光光度计使用及原理()。

2、移液管使用()。

(三)、标准曲线制作:1、2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。

1)、利用标准曲线查出回归方程。

2)、用公式计算回归方程。

3)、或用origin作图,测出回归线性方程。

即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0、999以上,至少2个9以上。

4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上得点应该在直线两侧。

(四)、蛋白质含量得测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品得A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品得A595nm值在0、1—0、05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。

(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。