《生化实验技术》综合设计性大实验共93页

生物化学实验教学内容（本部）实验内容与方法实验背景资料1：《小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定》实验背景资料过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。

人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。

小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。

溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。

本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。

2、3. 实验目的熟悉并掌握生化四大技术—离心、层析、比色、电泳。

熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。

4. 实验原理匀浆原理：分离纯化某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。

过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。

过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。

根据上述原理选择0.05mol/L，pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，部分杂蛋白则沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清液中，分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。

盐析原理：蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。

《生化实验技术与应用》实验设计方案实验项目：水果基因组DNA 的提取与转基因成分分析 专业：生物技术 班级：101 日期：3月1日 一、实验目的：1、掌握提取植物组织基因组DNA 的基本方法。

2、掌握二苯胺法和紫外分光光度法测定DNA 含量的原理和方法。

3、学会转基因植物转基因成分的分析4、学习DNA 的水平式琼脂糖凝胶电泳并学会操作。

5、掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪等仪器设备的使用。

二、实验原理：核酸是生物有机物体重的重要组成成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起。

核酸分为DNA 和RNA 两大类，前者主要存在于细胞核内，后者主要存在于细胞质及核仁里。

在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。

苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA 则溶于上层水相。

将氯仿与苯酚混合使用，可减少酚相中因水的存在而造成DNA 的少量溶解。

95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%的乙醇洗涤可以除一些盐分，经Rnase 降解RNA ，可得较纯的DNA 。

DNA 含量与纯度测定，目前常用紫外吸收法，利用核酸在260nm 有吸收峰，根据公式[DNA(μg /mL)=A260*50*稀释倍数]可计算出核酸DNA 的浓度。

由于蛋白质在280nm 有吸收峰，可根据比值判断DNA 纯度：A260／A280＜1.8时，表明蛋白质含量偏高；1.8＜A260／A280＜1.9时，表明样品较纯；A260／A280＞2.0时，表明RNA 或DNA 碎片较多。

二苯胺法定量测定DNA 的原理为：在强酸、加热条件下，可以使DNA 中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，产生嘌呤碱基、脱氧核糖与嘧啶核苷酸。

其中，2’-脱氧核糖在酸性环境中成为w-羟基-r-酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。

DNA在40-400ug范围内光吸收值与DNA 含量成正比。

在转基因技术中，外源基因导入到植物体中时，通常使用花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子启动下游编码基因的转录。

生化实验方法和技术嘿，你要是对生命的奥秘感兴趣，那生化实验方法和技术可就像一把神奇的钥匙，能打开那扇神秘的大门呢！我自己就曾经一头扎进这个奇妙的世界，和我的小伙伴们一起探索，那过程就像是一场刺激的冒险。

我记得有一次，我们要做蛋白质的提取实验。

这就好比是从一个大宝藏里，把最珍贵的宝石找出来。

我们先准备好材料，各种瓶瓶罐罐、试剂，那场面就像厨师准备做一道超级复杂的菜一样。

你看，新鲜的组织样本就像是做菜的食材，得小心翼翼地处理。

我们一边做，一边还互相打趣，“嘿，这要是搞砸了，可就像把好好的牛排煎糊了一样惨啊！”在生化实验里，电泳技术那可是相当酷的。

想象一下，那些蛋白质或者核酸分子就像一群小小的运动员，在凝胶这个跑道上赛跑。

我们给它们通上电，就像给运动员们吹起了起跑的哨子。

不同大小的分子跑得快慢不一样，这多有趣啊？我们几个眼睛都不敢眨一下，紧紧盯着那些条带，就盼着能看出点什么来。

“哇塞，你看这个条带，好清晰啊！”小伙伴兴奋地叫着，那感觉就像发现了新大陆一样。

还有PCR技术呢，这简直就是生化实验里的魔法。

它能把一小段DNA像变魔术一样复制好多好多份。

我们当时做的时候，感觉自己就像魔法师。

那些小小的引物就像是魔法咒语，能精准地找到要复制的DNA 片段。

这过程可不能有一点马虎，稍微出点差错，就像魔法失控了一样，结果可能就完全不对了。

我当时就特别紧张，一直念叨着：“可千万别出错啊，这就像走钢丝一样，一失足就完了。

”说到酶活性的测定实验，那也是很有意思的。

酶就像是一个个勤劳的小工匠，在生物体内不停地干活。

我们要测定它们的活性，就像是在考察这些小工匠的工作效率。

我们得精确地控制各种条件，温度啊，pH值啊，就像给小工匠们创造合适的工作环境一样。

有个小伙伴不小心把温度调错了一点，大家都着急了，“哎呀，这可不行啊，这就像让大冬天的建筑工人在冰天雪地里干活，效率肯定不行啊！”生化实验里的色谱技术，就像是一个超级精细的分拣机。

一、实验目的1. 掌握从生物组织中提取DNA的基本原理和方法。

2. 学习使用酚-氯仿法进行DNA的粗提取和纯化。

3. 熟悉DNA的鉴定方法。

二、实验原理DNA是生物体内的重要遗传物质，具有独特的碱基序列。

在提取过程中，利用DNA与蛋白质、RNA等物质的溶解性差异，通过适当的化学试剂和操作步骤，将DNA从细胞中分离出来。

三、实验材料与仪器1. 材料：鸡血、无菌生理盐水、无水乙醇、氯化钠、酚-氯仿、NaCl溶液、DNA标准样品等。

2. 仪器：离心机、玻璃棒、量筒、烧杯、滴管、吸管、移液器、酒精灯、显微镜等。

四、实验步骤1. 鸡血采集：取鸡血2ml，加入10ml无菌生理盐水，充分混匀。

2. 细胞裂解：取2ml鸡血混合液，加入等体积的酚-氯仿，充分混匀后静置5分钟。

3. DNA沉淀：取上述混合液，加入2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后静置10分钟。

4. DNA纯化：将上述混合液转移到离心管中，离心5分钟（8000r/min），弃去上清液。

5. DNA溶解：将沉淀用50μl NaCl溶液溶解，混匀。

6. DNA鉴定：取少量溶解后的DNA溶液，加入2μl DNA标准样品，观察颜色变化。

五、实验结果1. 在实验过程中，观察到鸡血混合液与酚-氯仿混合后分层，上层为红色，下层为无色。

2. 在DNA沉淀过程中，观察到白色沉淀形成。

3. 在DNA溶解过程中，观察到溶液颜色由白色变为无色。

4. 在DNA鉴定过程中，观察到溶液颜色与DNA标准样品颜色相似。

六、实验结论1. 成功从鸡血中提取了DNA。

2. 酚-氯仿法是提取DNA的有效方法。

3. DNA在生物组织中的提取具有实际应用价值。

七、实验讨论1. 实验过程中，酚-氯仿的加入有助于细胞裂解和DNA的提取。

2. 无水乙醇的加入有助于DNA的沉淀。

3. NaCl溶液的加入有助于DNA的溶解。

4. 实验过程中，注意操作规范，避免污染。

5. DNA提取过程中，温度、pH值等条件对实验结果有影响。

生物化学实验技能大赛实验设计书【最新精选】邻二氮菲法测定蔬菜中铁的含量摘要用邻二氮菲分光光度法直接测定蔬菜中的铁含量，方法简便、快速、准确，为指导人们合理食用蔬菜进行补铁及进一步开发蔬菜产品提供了可靠的理论依据[1 2]。

关键词蔬菜铁含量邻二氮菲1. 前言铁作为必需的微量金属元素，对于人体的健康十分重要。

铁是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素及其它酶系统的主要组分，可协助氧的运输，还能促进脂肪的氧化。

蔬菜是人们摄取微量铁的主要途径之一，缺铁可造成贫血并容易疲劳，而过多则会导致急性中毒。

所以，蔬菜中铁含量的测定具有重要的营养学意义，可为指导人们合理食用蔬菜进行补铁以防治缺铁性贫血，提供可靠的理论依据。

2. 实验目的综合运用所学知识，用仪器分析法测定金属元素含量;练习灵活运用各种基本操作和查阅资料的能力。

3. 实验原理蔬菜中金属元素常与有机物结合成难溶或难于解离的物质，常采用有机物破坏法是被测的金属元素以氧化物或无机盐的形式残留下来，以便测定。

本实验采用有机物破坏法(干法)，即在高温下加入氧化剂，使有机物质分解。

根据不同浓度的物质具有不同的吸光度，采用分光光度法来测定蔬菜中的铁含量。

在pH值4,6的条件下，以盐酸羟胺将三价铁还原为二价铁，二价铁再与邻二氮菲(phen)生成桔红色络合物,3,，用分光光度计在510nm测定蔬菜中铁的含量。

盐酸羟胺还原三价铁的反应如下:3+2++- 2 Fe+2NHOH?HCl?2 Fe+N+2HO+4H+2Cl222邻二氮菲与二价铁的反应式如下:2+Fe + 3(phen) =Fe(phen) 34. 实验器材722型分光光度计(1台)，电子天平(1台)蒸发皿(4个)，100mL容量瓶(4个)，150mL容量瓶(16个)，500mL试剂瓶(7个)，大烧杯(4个)，量筒(1个)，胶头滴管(4个)，玻璃棒(4个)，1.5mL移液管(2个)，5mL移液管(8个)，10mL移液管(1个)，25mL移液管(1个)，漏斗(4个)，酒精灯(4个)，洗瓶(1个)，马弗炉(1个)，电磁炉(1台)，石棉网，三角架，铁架台/电炉，剪刀(1把)，火柴(1盒)，标签若干等。

生化实验技术实验设计实验设计题目：高效液相色谱-质谱联用技术测定大米中农药的残留课程：生物学实验技术概述专业：生物化学与分子生物学学号：2015116105姓名：杨洁舒高效液相色谱-质谱联用技术测定大米中农药的残留一、方案必要性与可行性分析我国是水稻种植大国，大米是我国人民的主食，占口粮消费的63％以上。

大米除被制成米饭直接食用外，还被加工成米粉、甜点及酒精饮料等。

我国大米人均年消费量在140kg以上。

水稻生产中为了保证水稻的高产，往往不可避免地需要使用各种农药。

据报道，在农药的使用过程中，真正起作用的仅占喷施量的0.1%，其余99.9%的农药都分散于环境中，中国每年受农药污染的农田面积达到6.67×106hm2。

因此，在大米的进出口中，世界各主要农业大国都对大米的农药残留制定了严格的限量标准。

研究大米中农药残留的检测方法，既是保障人类健康的需要，又是促进进出口贸易的需要。

为了保证水稻的产量，种植者施用大量的化学农药，不仅造成环境污染，而且直接影响大米的食用安全，威胁人们的健康。

鉴于上述原因，世界各国严格规定了包括大米在内的食品中农药最大残留限（MRLs）和每日最大摄入量。

目前大部分实验室监测食品中农药残留的方法是采用经典的气相色谱法，选择性检测器包括电子捕获检测器（ECD）、氮磷检测器（NPD）和火焰光度检测器（FPD），然而这些检测器限制了农药残留的检测范围。

其原因是萃取共存物的干扰存在假阳性和不准确性，用单一方法检测呈阳性后，还必须做确证试验。

此外，经典的预处理方法操作复杂，耗时且溶剂消耗量大，因此，有必要研究新的样品预处理及检测方法。

随着联用技术的日趋完善,高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）逐渐成为最热门的分析手段之一。

特别是在分子水平上可以进行蛋白质、多肤、核酸的分子量确认,氨基酸和碱基对的序列测定及翻译后的修饰工作等,这在HPLC-MS联用之前都是难以实现的。

HPLC一MS 作为已经比较成熟的技术,目前国内外己在生化分析、天然产物分析、药物和保健食品分析以及环境污染物分析等许多领域得到了广泛的应用。

第1篇一、实验目的1. 掌握生化反应的基本原理和操作方法。

2. 通过实验验证不同生化反应的特性和规律。

3. 提高实验操作技能和数据分析能力。

二、实验原理生化反应是指生物体内发生的化学反应，主要包括酶促反应、非酶促反应等。

本实验选取了以下几种生化反应进行探究：1. 酶促反应：以淀粉酶催化淀粉水解为例，研究酶促反应的特性和影响因素。

2. 非酶促反应：以蛋白质变性为例，研究非酶促反应的特性和影响因素。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 淀粉酶- 淀粉- 碘液- 氢氧化钠- 蛋白质溶液- 乙醇- 硫酸铜- 水浴锅- 试管- 移液枪- 滴管- 研钵- 研杵2. 实验仪器：- 恒温水浴锅- 酶标仪- 紫外可见分光光度计- 精密天平- 移液枪- 试管架- 移液器四、实验方法1. 酶促反应实验：（1）将淀粉酶与淀粉按一定比例混合，加入适量水，置于恒温水浴锅中，在一定温度下反应一段时间。

（2）取一定量的反应液，加入碘液，观察颜色变化。

（3）以未加淀粉酶的反应液为对照组，分析酶促反应的特性和影响因素。

2. 非酶促反应实验：（1）将蛋白质溶液与氢氧化钠按一定比例混合，观察颜色变化。

（2）将混合液加入乙醇，观察沉淀形成情况。

（3）将沉淀加入硫酸铜溶液，观察颜色变化。

（4）以未加氢氧化钠的反应液为对照组，分析非酶促反应的特性和影响因素。

五、实验结果与分析1. 酶促反应实验结果：通过实验观察，加入淀粉酶的反应液颜色逐渐变浅，说明淀粉被水解。

在对照组中，未加淀粉酶的反应液颜色未发生变化。

这说明淀粉酶具有催化淀粉水解的作用。

2. 非酶促反应实验结果：通过实验观察，加入氢氧化钠的反应液颜色逐渐变深，说明蛋白质发生变性。

在对照组中，未加氢氧化钠的反应液颜色未发生变化。

这说明氢氧化钠可以导致蛋白质变性。

六、实验结论1. 酶促反应具有高效、专一性等特点，是生物体内重要的化学反应类型。

2. 非酶促反应也具有重要的作用，如蛋白质变性等。