红曲霉菌种的筛选

红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究红曲霉（Monascus）是一种重要的食品、药用真菌，具有制作红曹和红曲色素的能力。

红曲霉色素是一种天然的食品着色剂，被广泛应用于食品加工和制药工业。

而红曲霉也是一种可以用于生物转化生产脂质和多糖等重要化合物的微生物。

红曲霉高产菌株的筛选及固态发酵研究对于提高红曲霉发酵产物的产量和质量具有重要意义。

一、红曲霉高产菌株筛选1. 优良菌株的选择红曲霉菌株的筛选是红曲生物技术研究的关键之一。

目前，常用的筛选方法是通过对菌株的培养条件、生理生化特性以及代谢产物等进行评价，从中选取表现出高产、高效、高稳定性的优良菌株。

在筛选过程中，需要考虑到不同菌株之间的遗传变异、发酵产物的生产能力等因素，综合评价后确定优良菌株。

2. 根据菌株代谢产物进行筛选红曲霉菌株具备多样的代谢产物，包括红曲素、黄酮素、黄酮甾醇和多糖等。

在筛选优良菌株时，可以通过检测这些代谢产物的合成能力，选择产量高、纯度高、质量好的优良菌株。

还可以采用高通量筛选技术，如基因组学、代谢组学和蛋白质组学等方法，加快筛选速度，提高筛选效率，为选取优良菌株提供科学依据。

3. 利用基因工程技术筛选优良菌株利用基因工程技术，可以对红曲霉的代谢途径进行调控和优化，从而提高其生产产物的能力。

通过转录组分析和基因功能鉴定，可以筛选出与产物合成相关的关键基因，并通过基因工程技术对这些基因进行改造、调控，从而提高产物的产量和质量。

二、红曲霉固态发酵研究1. 固态发酵的基本原理固态发酵是指微生物在不同有机物基质中进行生长和代谢过程。

相比于液态发酵，固态发酵具有体系复杂、生物多样性丰富、营养物质丰富等优点。

对于红曲霉来说，固态发酵可以有效提高产物的产量和质量，加快生长速度，促进代谢物的生成，增强抗胁迫能力。

2. 固态发酵的工艺优化固态发酵的工艺优化是红曲霉生物技术研究的重中之重。

优化工艺可以从发酵基质的选择、培养基成分、发酵条件等方面入手，通过对各项参数进行调控和优化，提高红曲霉的产物产量和质量。

高产红曲色素菌株筛选李永波;宋丽莎;肖国学;邓功成;李静【摘要】本实验以民间收集的红曲米为材料,分别从三个方面对红曲霉进行了研究:(1)将红曲霉进行初步选育和紫外线诱变后,选育出高产红曲色素的菌株,其紫外线诱变的垂直距离为30cm时,最佳照射时间为15 min,选育后其色价为910 U/g,比原菌株色价高105 U/g.(2)对单因子KNO3、钙镁片、Vb&Vc对红曲霉生长速度和产色素的能力作了初步的研究,结果表明:Vb&Vc 可以促进红曲霉的生长和色素的产生,KNO3 也可以促进红曲霉的生长和色素的产生,但效果不显著.在三者当中,Vb&Vc对红曲霉生长和产色的影响最大.【期刊名称】《黔南民族师范学院学报》【年(卷),期】2010(030)006【总页数】5页(P43-47)【关键词】红曲霉;诱变;色素【作者】李永波;宋丽莎;肖国学;邓功成;李静【作者单位】黔南民族师范学院,生命科学系,贵州,都匀,558000;黔南民族师范学院,生命科学系,贵州,都匀,558000;黔南民族师范学院,生命科学系,贵州,都匀,558000;黔南民族师范学院,生命科学系,贵州,都匀,558000;黔南民族师范学院,生命科学系,贵州,都匀,558000【正文语种】中文【中图分类】TQ925红曲霉 (Mononscus)是小型丝状好气性腐生真菌,属真菌界 (Eumycophyta)、子囊菌门 (Ascomycetes)、真子囊菌纲 (Euasco mycetes)散子囊菌 (Eurotiales)、红曲菌科 (Monascaceae)、红曲霉属 (Monascus)。

[1〗其能产生大量天然色素,是目前世界上唯一工业化生产食用色素的微生物。

[2〗红曲米是红曲霉寄生在米饭上发酵繁殖,经干燥后一种具紫红色的干米粒,又称红曲、丹曲、赤曲等。

[2〗它不仅具有较好的营养价值和一定的防腐作用,[3〗还具有降低血脂、降血压、降血糖、抑瘤抗癌、提高人体免疫力等药用功效,[4][5]长期使用对人体有益无害。

红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究一、红曲霉高产菌株筛选红曲霉高产菌株的筛选是通过对红曲霉种群中的亚种和突变株进行筛选鉴定，选择出产麹酸效率较高的优良菌种，以提高发酵产品的产量和品质。

在红曲霉高产菌株筛选中，常用的方法有生化培养基筛选法、遗传工程策略筛选法等。

（一）生化培养基筛选法生化培养基筛选法是通过调整培养基成分，筛选出产麴酸效率较高的菌株。

由于不同的红曲霉菌株对培养基成分的需求不同，可以通过改变不同的碳源、氮源、矿物质盐等成分，以增强产麴酸菌株的生长和代谢能力。

利用这种方法，研究人员可以筛选出一些优良的红曲霉高产菌株，为固态发酵生产提供了重要的菌种资源。

（二）遗传工程策略筛选法遗传工程策略筛选法是利用分子生物学技术对红曲霉进行基因改造，通过引入外源基因或改变内源基因结构，从而增强产麴酸的合成能力。

通过这种策略，研究人员可以获得具有高产麴酸能力的红曲霉菌株，为固态发酵生产提供了新的途径和方法。

二、红曲霉固态发酵研究红曲霉固态发酵是一种利用红曲霉在固态培养基上生长和代谢的发酵工艺，广泛应用于食品工业和药品工业。

在固态发酵工艺中，红曲霉通过在固态培养基上生成麹酸、酶和其他有益物质，从而提高了产品的附加值和市场竞争力。

固态发酵研究对于红曲霉发酵产品的优化和改良具有重要的理论和实际价值。

（一）固态发酵工艺优化固态发酵工艺优化是通过调节发酵条件和控制因素，提高红曲霉在固态培养基上的生长和代谢效率。

固态发酵工艺优化主要包括温度、湿度、通气量、pH值等因素的控制和调节。

通过优化固态发酵工艺，可以获得具有高产麹酸能力的红曲霉菌株，从而提高产品的产量和品质。

（二）固态发酵产品改良固态发酵产品改良是通过调整固态培养基成分，提高红曲霉发酵产品的品质和功能。

固态发酵产品改良可以通过调整碳源、氮源、矿物质盐等成分，增强产品的营养价值和生物活性物质含量。

通过这种方法，可以获得具有更高附加值和更广市场应用前景的红曲霉固态发酵产品。

红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究红曲霉（Monascus spp.）是一种能够产生红色素的真菌，广泛应用于米酒、食品着色和制取红曲米等工业生产中。

红曲霉高产菌株的筛选和固态发酵研究对于提高红曲霉的生产效率和产品质量具有重要意义。

本文将对红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究进行探讨。

一、红曲霉高产菌株筛选1. 红曲霉高产菌株的选择红曲霉高产菌株的筛选是通过将已有的红曲霉菌株进行筛选和培养，以获得具有高产色素和其他相关代谢产物的菌株。

通常采用的方法有：采用可溶性淀粉或葡萄糖等作为碳源，进行培养和发酵实验；在不同的培养条件下，如温度、pH值等条件下进行培养实验，通过检测发酵产物的数量和质量来筛选出高产菌株。

2. 分子生物学方法在高产菌株筛选中的应用随着分子生物学技术的发展，如PCR、基因克隆、基因表达等技术的应用，可以通过对红曲霉菌株进行基因分析，筛选出具有高产色素和其他相关代谢产物的菌株。

分子生物学方法不仅可以准确地鉴定菌株类型，还可以帮助筛选出更加适合工业生产的高产菌株。

3. 发酵产物分析通过对红曲霉菌株的培养和发酵产物的分析，可以鉴定出产色素和其他相关代谢产物的菌株。

通过对产物的数量和质量的测定和分析，可以筛选出高产菌株。

二、红曲霉固态发酵研究1. 固态发酵培养基的优化固态发酵的培养基是影响红曲霉生长和代谢产物产生的重要因素。

常用的固态发酵培养基包括糯米、黄米、小麦等。

固态发酵培养基的优化可以通过调整碳源、氮源、微量元素和水分等因素，以提高红曲霉的生长和代谢产物的产量。

2. 发酵条件的优化在固态发酵过程中，温度、pH值、通气量等发酵条件对红曲霉的生长和代谢产物的产生有重要影响。

通过调整这些发酵条件，可以提高红曲霉的生产效率和产品质量。

3. 发酵产物的提取和分离固态发酵产生的红色素和其他相关代谢产物需要进行提取和分离。

常用的方法包括有机溶剂提取、分液柱色谱分离等。

通过这些方法，可以获取纯度较高的红色素和其他相关代谢产物。

粮食科技与经济Grain Science and Technology and Economy收稿日期：2019-05-11基金项目：西北民族大学国家级大学生创新创业训练计划项目（201810742117）。

作者简介：孙婷，女，本科在读，研究方向为食品科学与工程。

通信作者：欧阳霞辉，女，博士，副教授，研究方向为动物生殖与发育、生物信息学。

红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究孙婷1，黄彩桃1，吕晓航1，魏雯静2，欧阳霞辉1（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730124；2.西北民族大学化工学院，甘肃兰州730124）［摘要］红曲色素是一种天然色素，具有营养、无毒等特点，可作为食品添加剂应用于食品行业。

红曲色素由红曲霉发酵产生，但不同种的红曲霉菌株产色素能力有所差异，对高产红曲色素菌株的筛选十分必要。

固态发酵是红曲色素传统生产方法，与液态发酵相比具有独特的优点。

本文对高产红曲霉的菌株菌种与固态发酵条件进行分析，以期为高产菌株的筛选提供参考。

［关键词］红曲色素；红曲霉；高产菌株；固态发酵中图分类号：Q933文献标识码：A DOI：10.16465/431252ts.20190532在中国传统的饮食文化中，人们倾向于注意色、香、味的合理搭配，鲜艳亮丽的颜色能使人心情愉悦，增强食欲[1]。

色素能够赋予食品鲜艳的色彩，满足人们消费需求，由于合成色素安全性低，而由微生物发酵生产的天然色素着色能力好、安全性高，越来越受到人们青睐[2]。

红曲色素是一种由红曲霉属的丝状真菌经发酵而成的优质天然食用色素，是以大米、大豆为主要原料，经红曲霉菌液体发酵培养、提取、浓缩、精制而成及以红曲米为原料，经萃取、浓缩、精制而成的天然红色色素，是天然的食品添加剂，广泛用于肉制品的着色[3-5]。

1红曲色素高产菌株的研究现状红曲色素产于红曲霉，红曲霉又称红曲、红糟、红大米，是我国重要的微生物资源。

红曲霉属真菌门、子囊菌纲、真子囊菌亚纲、红曲霉属，广分布于泡菜、大曲、酿酒醪液等多种基质中[6-8]。

高产酯化酶红曲霉菌株的筛选与诱变育种学生：陶清生物科学技术学院 08生物工程二班，学号 200842145213 摘要：为了获得具有高酯化能力的红曲霉菌株，通过从大曲中初筛选出9株红曲霉菌株，逐代处理后选出酯化酶产量高，特性好的菌株作为出发菌株，再对出发菌株进行紫外诱变，紫外与氯化锂复合诱变，硫酸二乙酯诱变等反复诱变，并进行筛选，结果得到酯化能力明显提高，遗传稳定，具有良好应用前景的菌株。

关键词：红曲霉；诱变育种；酯化能力；筛选前言：传统大曲浓香型白酒发酵周期长（40-50d)，出酒率低，是浓香型白酒生产的瓶颈，缩短发酵周期和提高浓香型白酒中的乙酸乙酯含量是提高浓香型白酒的产量与质量的关键。

一、红曲霉酿酒的研究背景浓香型白酒的主体香味物质是乙酸乙酯，窖香浓郁，绵甜甘洌，香味协调，尾净余长，是浓香型白酒的主要特征，深受广大消费者的喜爱，是我国生产量最大的白酒品种，传统的发酵方式具有多出不足导致白酒酿造的成本投入过大，而收益不高。

红曲霉在我国的应用历史悠久，红曲霉在发酵过程中能产生糖化酶，淀粉酶等一级代谢产物及色素，降胆固醇活性物质等次级代谢产物。

对其研究主要集中在食用色素，药用性次级代谢产物上[1]。

20世纪60年代初，中国科学院成都生物研究所吴衍庸教授从泸洒麦曲中分离到泸型酯化菌M101红曲霉菌株，为红曲在大曲白酒生产上的应用开拓了新途径，是我国白酒工业的一项重大创新[2]。

本研究志在在选育出具有高酯化能力，能够用于浓香型白酒生产的红曲霉菌株。

缩短浓香型白酒发酵周期，提高浓香型白酒质量和产量。

二、高产酯化酶的红曲霉的筛选（一）材料1、菌种大曲样品（采自四川某名酒厂）2、培养基糟浸液富集培养基：酒糟浸液10％；乙醇4％，麦芽汁调节糖度到10°Brix乳酸调节pH 到4．5。

糟浸液平板分离培养基：糟浸液10％；乙醇7％，麦芽汁调节糖度到10°Brix；琼脂2％，乳酸调节pH到4．5。

红曲霉高产水溶性色素菌株的筛选摘要通过紫外诱变筛选出一株高产水溶性色素的红曲霉菌株，并对其生长特性进行研究，为开拓红曲色素的应用领域奠定了基础。

关键词红曲霉；紫外诱变；水溶性；色价食品的色泽是影响消费者购买欲望的一个重要因素，开发具有诱人外观的产品一直是食品工业的一个重要目标。

食品行业通过使用着色剂从而改善食品的外观、迎合消费者的需求。

目前使用的食品着色剂有2种类型：人工合成着色剂和天然着色剂。

天然着色剂包括天然物质提取物和微生物代谢产物，有着悠久的应用历史。

近100年来，人工合成着色剂因色彩鲜艳、性质稳定、着色力强、可任意调配、成本低廉、使用方便等优点，应用较广。

但是，随着消费者对化学合成制品的安全意识的提高，一些原被作为食品添加剂的材料被限制甚至禁止使用。

消费者越来越倾向于以天然色素作为食品添加剂。

红曲色素作为天然着色剂在我国已有几千年的应用历史，其无毒无害、色泽鲜艳、性能稳定、染着性强等特点符合食用色素的要求。

但这类色素以醇溶性为主，仅仅应用于酒、肉及腐乳等为数不多的食品中，大大限制了其应用领域。

人们为了克服红曲色素的醇溶性，使之转化成水溶性色素，进行了广泛的研究，但其成效均不理想。

本文从液态发酵工艺出发，通过分离和诱变的方法，选取产色素高、性能稳定的红曲霉菌种，并研究了其发酵特性，为红曲色素的大规模工业化生产作好准备。

1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种。

本实验室保留菌种（记作S）、凤城老窖酒厂提供的红曲霉菌种（记作F）。

1.1.2培养基。

①平板分离培养基和斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；②种子培养基：大米粉8%、NH4NO3 0.4%、KH2PO4 0.2%、MgSO4 0.1%、ZnSO40.02%、MnSO4 0.04%。

1.2试验方法1.2.1出发菌株孢子悬液的制备。

将保藏的菌种在30℃下活化3h后，用10mL 无菌水冲洗，注入带玻璃球的小锥型瓶中振荡，纱布过滤，得孢子悬液。

1.2.2平板分离筛选。

红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究红曲霉是一种重要的发酵微生物，被广泛应用于食品和药物工业中。

在传统的红曲霉发酵过程中，往往需要筛选出高产菌株，以提高产品的产量和质量。

本文将介绍红曲霉高产菌株筛选及固态发酵研究的相关内容。

一、红曲霉高产菌株筛选红曲霉高产菌株的筛选是红曲霉研究中的重要环节。

在筛选高产菌株的过程中，通常会考察菌株的生长速度、产色能力和产物活力等指标。

为了实现高效的筛选过程，研究人员通常会采用以下方法：1. 传统筛选法传统筛选法是指通过培养基上的色素形成情况、抗生素活性等来筛选出优良的红曲霉菌株。

这种方法简单易行，成本低廉，但筛选周期长，效率低下。

2. 分子生物学筛选法分子生物学筛选法是指通过PCR技术、酶联免疫吸附试验（ELISA）等分子生物学方法，筛选出具有高产色素能力和活性成分的菌株。

这种方法可以提高筛选效率，但操作复杂，成本较高。

3. 遗传工程筛选法利用遗传工程技术改良红曲霉菌株，提高其产酶活力和产物活性。

这种方法能够直接对菌株进行改良，提高产物的质量和产量，但风险较大。

以上筛选方法各有优缺点，可以根据实际情况选择合适的筛选方法进行研究。

二、固态发酵研究红曲霉是一种优良的固态发酵微生物，其在固态发酵过程中可以产生丰富的生物活性成分，具有很高的应用价值。

固态发酵是一种通过微生物在固体底物上生长、代谢产物的过程，可以用于生产各种发酵食品和药品。

在红曲霉固态发酵研究中，通常会涉及到以下内容：1. 发酵底物的选择在固态发酵过程中，发酵底物的选择对产物的质量和产量有着重要影响。

通常情况下，发酵底物可以选择大豆、小麦、玉米等富含碳水化合物和氮源的材料，以供红曲霉进行生长和代谢产物。

2. 发酵条件的优化发酵条件的优化是红曲霉固态发酵研究中的关键环节。

发酵条件包括发酵温度、湿度、通气条件等，这些条件会直接影响红曲霉的生长和代谢产物的质量和产量。

通过对发酵条件的优化，可以提高固态发酵产物的质量和产量。

吉林农业大学学报　1997,19(3):85～90Journal of Jili n A gricult ural U niversity产Monacolin K红曲霉菌的筛选及发酵条件的研究高嘉安Ξ　郭　东ΞΞ　王德辉　陈淑杰(吉林农业大学食品工程学院　长春130118)摘　要　对12种42株红曲霉菌进行Monacoln K产生情况筛选。

其中16株发酵培养物中检测到该生理活性物质的存在,以M1ruber612菌株产量最高,可达4915μg/mL。

对此菌株的发酵条件进行研究,确定出最适碳源、氮源及C/N比,给出生产Monacolin K的工艺条件。

实验结果表明,培养基组成、温度对产生Monacolin K有制约作用。

关键词　红曲霉菌　Monacolin K　发酵条件中图分类号　TQ925Screening Monascus Producing Monacolin K and Studyingon I ts Fermentation ConditionG ao Jia′an et al.(Food Engeeri ng College,Jili n A grocult ural U niversity,Changchun130118)Abstract　42strains were studied for producing Monacolin K among12species1 Monacolin K was detected in16strain culture,and the content of Monacolin K inM1ruber612were the highest(4915μg/mL)among42strains1K ey Words:Monascus;Monacoli n K;f ermentation condition红曲霉(Monascus)长期以来被用做生产红曲酒、腐乳和天然红色素,近年来对其代谢物的生理活性物质的研究日渐活跃。

高安全性红曲色素生产菌种的筛选及在传统老抽着色中的应用盛明健; 万培耀; 刘兰晓【期刊名称】《《江苏调味副食品》》【年(卷),期】2019(000)003【总页数】5页(P10-14)【关键词】红曲; 老抽酱油; 桔霉素; 筛选【作者】盛明健; 万培耀; 刘兰晓【作者单位】湖州老恒和酿造有限公司浙江湖州313000【正文语种】中文【中图分类】TS2641 概述红曲菌(Monascus)凭借鲜艳色泽和独特的风味及丰富的水解酶系,在我国传统的发酵工艺中发挥了举足轻重的作用，在腐乳、米醋等生产中的应用早已为世人所知。

国内外研究表明,红曲菌还能产生莫纳可林K(Monacolin K),这是目前医学界公认的降低人体胆固醇的理想药物,具有高效、低毒、安全的特点。

红曲色素一直以来被认为是天然的、安全性较高的食用色素，是由化学结构不同、性质相近的橙、红、黄等色素组成的混合物质,色泽明艳。

橙、红、黄色素分子的主要结构见图1。

从其化学结构可以看出,红曲色素属于聚酮类色素[1]。

在1976—2011年的文献中已知结构的红曲色素分子就有51种[2]。

红曲色素耐热、耐酸碱[3-5],对Na+、Mg2+、K+、Al3+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+等离子的稳定性都比较好[6-7]。

色素的种类和侧链结构不同,导致红曲的颜色有差异。

如:具有代表性的橙色素的结构见图1B,黄色素结构见图1C,红色素结构见图1D。

总体来看,随着共轭双键的数目增多,色泽渐深。

红曲色素具有多种功能:(1)抑菌性,可对蜡样芽孢杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用,从而可以有效延长食品的保质期;(2)抗氧化性,可以有效清除氧自由基,避免食品快速氧化和人体受活性氧的危害;(3)降血脂,可以降低血清中的胆固醇、甘油三酯和LDL水平,保护心血管系统;(4)抗炎、减肥和抗肿瘤。

要使老抽色度达到2000(EBC),就必须在浸淋头套油的基础上添加一定色度和色泽的红曲色素作为着色剂。

高产胞外多糖红曲菌株的筛选及形态学鉴定汪鹏荣;刘伟芬;蒋冬花;周琴;嵇豪【摘要】从浙江省各地采集到的红曲米中分离纯化得到111株红曲菌,通过摇瓶发酵实验初步筛选出胞外多糖产量在5.0g/L以上的6株红曲菌,并对它们进行了形态学分类鉴定.通过3次重复液体发酵实验,结合平板上菌丝的生长速度和液体发酵菌丝体的生物量,最终筛选出一株胞外多糖产量高达5.28g/L的红曲菌株MP-66.%111 Monascus strains were isolated and purified from red rice collected from different places of Zhejiang province.Through shake flask test, six Monascus strains with exopolysaccharide production in the 5.0 g/L or more were screened out and their morphological classification and identification were tested.Finally,through three times of shake flask test, combing with the growth rate of mycelium on the plate and mycelium biomass of liquid-fermentation, strain MP-66 with the highest-yield exopolysaccharide of 5.28 g/L was screened out.【期刊名称】《浙江师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(034)002【总页数】6页(P211-216)【关键词】胞外多糖;红曲菌;筛选;鉴定【作者】汪鹏荣;刘伟芬;蒋冬花;周琴;嵇豪【作者单位】浙江师范大学,化学与生命科学学院,浙江,金华,321004;浙江师范大学,化学与生命科学学院,浙江,金华,321004;浙江师范大学,化学与生命科学学院,浙江,金华,321004;浙江师范大学,化学与生命科学学院,浙江,金华,321004;浙江师范大学,化学与生命科学学院,浙江,金华,321004【正文语种】中文【中图分类】Q939.9真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的由 10个分子以上单糖通过糖苷键连接而成的高分子多聚物,是一类可以控制细胞分裂分化、调节细胞生长和衰老的活性多糖,是当今医药和食品工业界共同关注的焦点[1].糖生物学已成为生命科学研究领域的新前沿,糖链也被称为生命科学中的第 3条链[2].红曲菌 (M onascus)是一属小型丝状腐生真菌,属子囊菌亚门 (Ascomycotina)不整囊菌纲(Plectomycetes)散囊菌目 (Eurotiales)红曲科 (Monascaceae)[3],是一种常用的药用真菌.我国是世界上红曲菌生产和应用最早的国家,其中福建古田的红曲最为有名,浙江、台湾、两广等地区也有生产,特别是浙江省近几年来在红曲的生产和应用上有很大的发展.当今国内外对红曲菌的研究很多,主要集中在莫纳卡林K(Monacolin K)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)和红曲色素上,但对红曲菌的另一功能性成分——红曲多糖的研究却很少.目前,国内外对灵芝多糖、香菇多糖、虫草多糖等进行了广泛而深入的研究,虽然已有报道表明红曲多糖同灵芝多糖、香菇多糖、虫草多糖具有相似的生物学功能,但国内对红曲多糖的发酵生产工艺的研究较少,尚处于探索阶段,而国内相关研究报道的初筛红曲菌株产胞外多糖的产量均处于较低的水平.本研究希望从浙江省不同地区分布的红曲米中筛选出高产多糖的红曲菌株.红曲菌属种传统的鉴定是以培养特征和显微形态为主要依据的[4],分类标准的研究有很多.本实验从浙江省各地采集到的红曲米中分离纯化得到 111株红曲菌,通过摇瓶发酵筛选出 6株多糖产量相对较高且遗传稳定性好的红曲菌菌种,并对其进行了形态学鉴定,以其对后续研究奠定基础.1 材料和方法1.1 菌种及来源111株红曲菌的纯培养,分离自浙江省各地(温州、义乌、东阳、金华、杭州等)收集到的红曲米.1.2 培养基1)PDA培养基马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,琼脂粉 18 g,水 1 000 mL,pH自然.2)查氏合成培养基葡萄糖 30 g,NaNO3 3 g,酵母提取物 1 g,K2HPO41 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,琼脂粉18 g,水1 000 mL,pH 6.00.3)液体发酵培养基蔗糖 40 g/L,酵母粉4.5 g/L,KH2P O4·3H2O 3.5g/L,MgSO40.4 g/L,发酵液起始 pH 5.0[5].4)CYA培养基蔗糖 30 g,NaNO33 g,酵母提取物 5 g,K2HPO41 g,KCl 0.5g,MgSO4·7H2O 0.05 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,琼脂 18 g,水 1 000 mL,pH 6.0[6].5)G25N培养基 NaNO33.0 g,酵母提取物5.0 g,K2HPO41 g,KCl 0.5g,MgSO4·7H2O 0.05 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,琼脂 15 g,补水至1 000 mL,待琼脂溶化后加入 25%甘油,pH 6.0[6].6)MEA培养基麦芽浸出粉 20 g,蛋白胨1 g,葡萄糖 2 g,琼脂 15 g,补水至 1 000 mL,pH 6.0[6].1.3 红曲菌的分离纯化分别取各地采集的红曲米 0.5 g,用研钵研磨成粉状,取少量均匀地洒入 PDA培养基表面,30℃培养 48 h左右,待白色绒毛状菌丝长出后挑取少许菌丝转接于另一 PDA 培养基上继续培养,培养 1周后重复上述分离纯化操作,经 3次纯化后即可得到红曲菌的纯培养,将所获各菌株编号,置4℃冰箱中保存,备用.1.4 红曲多糖的提取1.4.1 工艺流程[7]菌种→斜面培养→摇瓶培养→离心除杂→上清液→减压浓缩→醇沉→离心→沉淀→鼓风干燥→红曲粗多糖.1.4.2 种子液的制备用打孔器 (直径 0.8 cm)分别取30℃培养5 d的平板菌种 (5块)接种到查氏合成培养基(250 mL三角瓶装入 50 mL查氏液体培养基)中,在30℃,转速为 200 r/min的旋转式摇床培养48 h.1.4.3 红曲菌的发酵培养将上述种子液接种到液体发酵培养基中,接种量为 8%,250 mL三角瓶中装 100 mL 培养液,在180 r/min,30℃下培养 96 h.1.4.4 红曲粗多糖的测定采用质量法[8].将发酵滤液定容至 100 mL,取 15 mL加入 60 mL无水乙醇中,在5℃下静置8 h,过滤,在80℃烘干 12 h至恒重,称量.1.4.5 生物量的测定[8]红曲菌经摇床培养后,用 8层纱布过滤,得到的菌体在80℃下烘干 12 h至恒重,称量.1.5 不同菌株菌丝生长速度的比较采用 PDA斜面培养基,每个菌株接 3个平板,30℃恒温培养,5 d后测量各菌株的菌落直径,取平均值作为不同菌株的菌丝生长速度.1.6 高产多糖红曲菌株生理生化特征的检测1.6.1 生长温度将红曲菌株分别用打孔器接种到麦芽汁琼脂培养基上,培养温度分别为 20,25,30,35和40℃,培养 5 d后观察菌落直径大小.1.6.2 生长 pH条件配制 pH分别为 3,4,5,6,7,8的查氏固体培养基.将红曲菌株分别用打孔器接种到查氏固体培养基上,30℃培养箱培养 5 d后观察菌落直径大小.1.6.3 碳源以不含糖的查氏培养基为基础培养基,供试糖分别为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、番薯粉、可溶性淀粉、甘油,各种糖的加量均为 3%,配制好培养基后灭菌接种,30℃培养箱中培养 5 d后观察结果.1.6.4 氮源以不含NaNO3的查氏培养基为基础培养基,供试氮源为 (NH4)2SO4,NaNO3,蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉,在基础培养基中分别加入不同氮源,加量为 0.3%,配制好培养基后灭菌接种,30℃培养箱中培养 5 d后观察结果.1.7 红曲菌属种鉴定将摇瓶发酵筛选出的 6株高产胞外多糖红曲菌菌种分别接种在上述MEA,CYA和G25N培养基中,在25℃培养 7,14和 25 d后观察记录菌落生长特征 (如:大小、颜色、表面结构、气生菌丝、基内菌丝、边缘特征、生长与否、培养基内可溶性色素等).根据文献 [4]中红曲菌分种检索表,并参考叶砚等[9]和郭红珍等[10]的描述,对筛选的 6株高产多糖菌株进行形态学鉴定.2 结果与分析2.1 红曲菌种的分离纯化经分离纯化,获得 111株红曲菌.大部分红曲菌菌落大而疏松,表层有气生菌丝,呈绒垫状,少数为皮膜状;菌落大多色泽橙红,少数为白色;菌落边缘为白色,或淡黄色,背面颜色为深红色.2.2 产多糖红曲菌的初筛按上述多糖提取方法,对 111株红曲菌进行产多糖的初筛,结果见图 1.由图 1可知,大多数红曲菌胞外多糖产量都较低,多为 1.0～3.0 g/L(占 72.7%).其中多糖产量在5.0 g/L以上的只有 6株,分别为编号 MP-25,MP-45,MP-66,MP-70,MP-85和MP-99的菌株.图 1 111株红曲菌胞外粗多糖产量的分布图2.3 高产胞外多糖红曲菌株的复筛对初筛出的 6株高产胞外多糖的红曲菌株进行了 3次重复摇瓶发酵实验,结果 (见表 1)表明:仅菌株MP-66胞外多糖产量最高为 5.28 g/L;而且在重复实验中发现菌株MP-66的多糖产量稳定在 5.00 g/L以上,而其他 5株初筛高产多糖菌株的胞外多糖产量不是很稳定,有较大幅度波动.因此,选定菌株MP-66为后续实验的目的菌株.表 1 6株高产胞外多糖红曲菌株的平均多糖产量注:多糖产量为 3次重复测定的平均值.images/BZ_352_196_2429_2054_2558.png2.4 菌丝生长速度和生物量的比较对 6株初筛高产胞外多糖的红曲菌株在平板培养基上的菌丝生长速度和在发酵液中菌丝体生物量的比较结果 (见表 2)表明:不同菌株在平板和液体培养基中的生长性能存在明显的差异,有 3个菌株 (MP-25,MP-66和MP-85)在平板培养基上的生长速率较其他菌株快;而在发酵液的生物量方面,菌株MP-45最高达 14.04 g/L,其次为菌株MP-66和MP-25.因此,从菌株的生长速度和生物量方面考虑,并结合其胞外多糖的产量,选取高产胞外多糖的红曲菌株MP-66用于今后进一步的研究.表 2 6株高产多糖红曲菌株平板培养基上生长速度和液体发酵菌丝体生物量的比较images/BZ_353_196_350_2054_417.png菌丝生长速度/(mm·d-1) 6.86 6.71 5.04 4.38 3.89 3.86菌丝体生物量/(g·L-1) 11.40 9.12 10.98 14.04 9.02 9.86 2.5 高产多糖红曲菌株生理生化特征的比较2.5.1 菌株生长温度从表 3可以看出:6株高产多糖的红曲菌株在20～40℃均能生长;在 30～35℃生长最快;在20℃下生长缓慢;大多数菌株在40℃下生长很缓慢,而 MP-66和 MP-70在40℃仍能较好地生长.由此可见,MP-66和MP-70可能属于耐高温型红曲菌.2.5.2 菌株生长 pH从表 4可知,6株高产多糖的红曲菌株在 pH 3～8均能生长,其最适生长 pH为 5～6.因此,红曲菌一般在弱酸性环境下培养最好.2.5.3 菌株碳源利用由表 5可知:6株高产多糖的红曲菌株均能较好地利用蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉和番薯粉,其中 5株红曲菌能很好地利用乳糖和番薯粉,只有MP-85的最适碳源为麦芽糖;而对于葡萄糖,这 6株红曲菌都未能达到最佳生长状态,原因可能是葡萄糖在灭菌过程中发生了焦糖化作用.MP-25和MP-70能在甘油中生长,其他 4个菌株在甘油中不能生长或者生长得不好.因此,红曲菌株对甘油的利用情况在红曲菌的分类鉴定上有一定的参考价值.表 3 不同温度下 6株高产多糖菌株的生长情况注:“+++”为生长良好;“++”为生长较好;“+”为生长一般;“±”为略有生长.images/BZ_353_1171_1075_2083_1142.pngMP-25 + ++ +++ ++ ±MP-45 + + +++ ++ +MP-66 + + +++ +++ ++MP-70 + ++ +++ +++ ++MP-85 + ++ +++ ++ ±MP-99 + ++ +++ ++ +表 4 6株高产多糖红曲菌株在不同 pH条件下的生长情况注:“+++”为生长良好;“++”为生长较好;“+”为生长一般;“±”为略有生长.images/BZ_353_196_1663_2054_1729.pngMP-25 + ++ +++ ++ + +MP-45 ++ ++ +++ ++ ++ ++MP-66 + + ++ +++ ++ +MP-70 + ++ +++ ++ + +MP-85 + ++ +++ +++ + +MP-99 + + ++ +++ ++ +表 5 6株高产多糖红曲菌株的碳源利用实验结果注:“+++”为生长良好;“++”为生长较好;“+”为生长一般;“±”为略有生长;“-”为不能生长.images/BZ_353_196_2213_2054_2279.pngMP-25 ++ ++ +++ ++ +++ +++ +MP-45 + +++ +++ ++ ++ +++ -MP-66 ++ ++ +++ ++ ++ +++ -MP-70 ++ +++ +++ ++ +++ +++ +MP-85 ++ ++ ++ +++ ++ ++ ±MP-99 + ++ +++ ++ ++ +++ ±2.5.4 菌株氮源利用由表 6可知,6株高产多糖的红曲菌株对氮源的利用差别不大,均能利用表 6中的 5种氮源,但它们在有机氮源中明显较无机氮源中生长更好.2.6 高产多糖菌株菌落特征和显微特征的比较6株高产多糖的红曲菌株在 CYA,MEA和G25N培养基上25℃培养 7,14 d后观察记录菌落特征.6株红曲菌在MEA和 CYA培养基上培养 14 d的代表性菌落特征见表 7;在 CYA,MEA,PDA培养基上的代表性菌落特征见图 2.表 6 6株高产多糖红曲菌株的氮源利用实验结果注:“+++”为生长良好;“++”为生长较好;“+”为生长一般.images/BZ_354_212_413_2037_479.pngMP-25 + + ++ ++ +++MP-45 + ++ ++ +++ +++MP-66 ++ + ++ +++ +++MP-70 ++ ++ ++ +++ +++MP-85 ++ ++ +++ +++ +++MP-99 + + ++ +++ +++表 7 6株高产多糖红曲菌在MEA和 CYA培养基上的菌落特征 (14d)images/BZ_354_196_946_2054_1079.png MP-25 18～23 15～18 圆形,绒垫状不规则,绒垫状淡黄色橙色有无MP-45 17 14～21 圆形,绒垫状不规则,绒垫状黄色橙色不明显无MP-66 14～19 15～21 圆形,皮膜状不规则,绒垫状粉红色橙色不明显无MP-70 18～28 28～40 圆形,绒垫状圆形,绒垫状白色浅橙色不明显无MP-85 19～25 18～20 圆形,绒垫状圆形,绒垫状淡黄色黄色有无MP-99 16～25 13～16 圆形,绒垫状绒垫状红褐色边缘黄色,中间深橙色无无圆形,图 2 6株高产多糖红曲菌株在 CYA,MEA,PDA培养基上的菌落特征(a)MP-25菌株在 PDA上;(b)MP-45菌株在MEA上;(c)MP-66菌株在 CYA上(d)MP-70菌株在CYA上;(e)MP-85菌株在 PDA上;(f)MP-99菌株在MEA上6株高产多糖红曲菌株在30℃下 PDA培养基中培养 7 d,显微镜观察菌丝形态、分生孢子形态及着生方式、闭囊壳特征等显微形态特征,部分代表性结果如图 3所示. 由图 3可见红曲菌各菌株的典型显微形态特征:闭囊壳为椭球形 (见图 3(a)),直径为20～50 μm,闭囊壳内散生众多子囊,成熟后子囊壁解体,孢子剩留在薄壁的子囊壳内;分生孢子梗由菌丝生出,在其顶部产生分生孢子 (见图 3(b)),形状为梨形;菌丝直径2～7μm,具横隔,分枝状,含有空泡和一些色素颗粒 (见图 3(c)).图 3 红曲菌显微形态特征根据 6株高产多糖的红曲菌株菌落特征和显微特征,初步将 6株高产多糖的红曲菌株鉴定为表 8所列的 4个种.表 8 6株高产多糖红曲菌株的鉴定结果images/BZ_355_158_1254_1088_1321.pngMP-70,MP-99 丛毛红曲菌M.pilosus MP-25,MP-85 橙色红曲菌M.aurantiacus MP-45 红色红曲菌M.ruber MP-66 紫色红曲菌M.purpureus3 讨论本实验从 111株红曲菌中最终筛选出一株多糖产量稳定在 5.0 g/L以上的高产多糖红曲菌株,其平均胞外多糖产量为 5.28 g/L,比目前国内相关文献报道的高,而且该菌株在平板和摇瓶培养基中的生长速度快,在工业化生产中可以缩短发酵周期、节约生产成本.今后,本课题还将对该高产多糖红曲菌株进一步研究,提高多糖产量,确定其最佳发酵条件和最佳培养基配方,以期对红参考文献:曲多糖的工业化生产奠定基础.虽然本文结合了较多的红曲菌形态学鉴定资料并参考生理生化实验结果,最终将高产多糖的红曲菌株MP-66鉴定为紫色红曲菌,但形态学鉴定由于受环境因素的影响较大,存在一定的主观性,因此本课题还将从分子水平对该菌株进行属种的确认.目前市售的很多保健产品中都含有多糖成分,但大多集中在灵芝多糖和香菇多糖等少数食用菌多糖上.张建峰[11]对红曲多糖的免疫活性进行了探索,结果表明红曲多糖同其他真菌多糖一样具有提高免疫力、保肝解毒等作用.浙江省是国内红曲分布较多的省份,因此,我们可以充分利用浙江省的红曲资源,分离纯化出高产多糖的红曲菌菌株,并对其进行属种的鉴定,为今后进一步研究红曲多糖的结构和功能的关系、浙江省红曲菌资源的分布及多样性打下基础.[1]郝瑞芳,景浩.真菌多糖的研究进展[J].中国食物与营养,2008(4):19-20.[2]张树政.糖生物学——生命科学的新前沿[J].生命的化学,1999,19(3):104-105.[3]陈义光,彭德姣,田宏现.红曲及红曲霉的研究与应用[J].湖北农学院学报,2000,20(2):188-191.[4]李钟庆,郭芳.红曲菌的形态与分类学[M].北京:中国轻工业出版社,2003.[5]李霞姣,夏永军,王铁军,等.红曲多糖液态发酵工艺条件的优化[J].生物加工过程,2009,7(2):13-17.[6]L I Zhongqing,GUO Fang.A further studies on the species ofM onsacus[J].Mycosystema,2004,23(1):1-6.[7]陈运中.红曲色素、多糖与核酸的联合制备的研究[J].中国酿造,2002(1):26-27.[8]赵振锋,方惠英,诸葛健.红曲霉发酵产胞外多糖工艺的优化[J].无锡轻工大学学报,2002,2(3):289-295.[9]叶砚,蒋冬花,缪存影.红曲米和红腐乳中红曲菌种的分类与鉴定[J].工业微生物,2009,39(6):38-44.[10]郭红珍.山西老陈醋大曲红曲霉分离鉴定及生物学特性研究[D].太谷:山西农业大学,2004.[11]张建峰.红曲多糖高产菌株的诱变筛选及其提取纯化免疫活性研究[D].长春:吉林农业大学,2005.。