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DNS-氨基酸的制备和鉴定——学习指南l 学习重点1. 掌握薄膜层析的基本原理和操作。
2. 学习DNS-标记法在氨基酸、肽和蛋白质分析中的应用。
l 知识要点1. 层析：利用混合物的各组分在固定相和流动相分配系数的差异，从而达到分离的目的。
根据支持介质的不同，层析可分为纸层析、薄膜层析、薄层层析和柱层析等。
本实验采用双向层析法，I 向和II 向展层选用不同的溶剂系统，可获得更好的分离效果。
2. 迁移率R f 值：样品点移动距离与溶剂移动距离的比值。
在同一展层系统中，R f 值差异越大，分离效果越好。
3. 聚酰胺：己二酸和己二胺的高聚物，含有大量酰胺基团，能与多种极性基团，如氨基酸的羧基和侧链基团形成氢键。
化合物中不同分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜之间的分配系数不同，以达到分离的目的。
(CH 2)6C O(CH 2)4COn4. DNS-Cl ：又称5-二甲氨基-1-萘磺酰氯，是一种荧光试剂。
在弱碱性条件下可与氨基酸的α-氨基反应，生成DNS-氨基酸。
在紫外光照射下，DNS-氨基酸可产生黄绿色荧光，具有很高的检测灵敏度。
黄绿色荧光l 试剂1. 2.5mg/mL DNS-Cl 丙酮溶液。
2. 三种氨基酸混合液（Gly 、Phe 、His ）。
3. 三乙胺。
4. 展层液I ：苯:冰醋酸（V/V ）=9:1； 展层液II ：甲酸:水（V/V ）=1.5:100。
l 仪器聚酰胺薄膜、毛细点样管、旋涡混合仪、层析缸、恒温水浴锅、电吹风、紫外分析仪 l 操作l 注意事项1. 严格控制点样位置以及点样直径，点样点应始终保持在展层溶剂液面以上，点样需少量分次，保证点样点小且圆。
2. I 向层析结束后，注意聚酰胺薄膜转动的方向，便于和标准图谱对照。
3. 苯对人身体有害，实验应在通风橱中进行并保持室内通风良好。
实验一氨基酸的分离与鉴定——滤纸层析法目的要求（1）通过实验，了解氨基酸滤纸层析法的原理。
（2）掌握氨基酸滤纸层析的操作方法。
原理滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析（它也并存着吸附和离子交换作用）。
滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。
有机溶剂自上而下流动称为下行层析，自下而上流动称为上行层析。
流动相流经支持物时，与固定相之间连续抽提，使物质在两相间不断分配而得到分离。
溶质在滤纸上的移动速率用R f值表示：溶质结构、溶剂系统物质组成与比例、pH值、选用滤纸质地和温度等因素都会影响R f 值。
此外，样品中的盐分、其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。
无色物质的纸层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定。
氨基酸纸层析图谱常用的显色剂为茚三酮或吲哚醌，本实验采用茚三酮为显色剂。
本实验用单向上行层析法作标准氨基酸的标准曲线，用双向上行纸层析法作几种已知氨基酸的层析图谱。
然后将其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量测定。
试剂和器材一、试剂（1）8×10-3mol/L谷氨酸和8×10-3mol/L天冬氨酸混合液。
（2）谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸和丙氨酸混合液（已知氨基酸混合液）。
将以上氨基酸分别配制成8×10-3mol/L的浓度，然后混合之。
（3）茚三酮重结晶方法：茚三酮有时由于包装不好或放置不当常带微红色，需重结晶方可使用。
5g茚三酮溶于15mL热水，加入0.25g活性炭轻轻搅动，若溶液太浓不易操作，可酌量加5—10mL热水，加热30min后趁热过滤（用热滤漏斗，以免茚三酮遇冷结晶而损失），滤液置冰箱内过夜，次日晨即见黄白色结晶出现，过滤，再以1mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色瓶内保存。
（4）0.1%硫酸铜（CuSO4·5H2O）：75%乙醇=2 ：38硫酸铜难溶于乙醇，将硫酸铜直接用75%乙醇溶解不能得到澄清溶液，如将硫酸铜溶液和乙醇混合后，放置过久则会有沉淀析出，因此，必须在临用前按比例混合。
dns紫外分光光度法DNS紫外分光光度法是一种广泛应用于分子生物学领域的分析技术，其能够准确测定DNA、RNA以及蛋白质等生物大分子物质的浓度和纯度。
本文将从以下几个方面进行介绍。
一、DNS紫外分光光度法的原理DNS紫外分光光度法是利用生物大分子物质对紫外光的吸收来测定其浓度和纯度的方法。
在285-300nm波长范围内，DNA、RNA和蛋白质等分子会吸收较多的紫外光。
DNS试剂在这样的紫外光照射下被物质还原为DNB，且DNB的产生与样品中丝氨酸、组氨酸、酪氨酸等氨基酸的含量成正比。
这样，通过对样品与标准品在波长范围内的吸收值进行比较，可计算出样品中的生物大分子物质的浓度和纯度。
二、DNS紫外分光光度法的步骤1. 制备DNS试剂：将1g 3,5-二硝基水杨酸溶于100ml浓硫酸中，加入冰水中，使其在冰水中降温结晶，将产生的白色晶体过滤、清洗并干燥，即得到DNS试剂。
2. 样品准备：将待测样品制备成一定浓度的溶液，一般为50～100μg/ml, 要求样品溶液中无酶及其他干扰物质。
同时，还需准备一系列标准样品。
3. 测定吸光度值：将样品与标准样品分别加入量刚好的稀释液中，然后在波长范围内进行吸光度测定，记录吸光度值。
4. 计算生物大分子物质的浓度和纯度：根据吸光度计算样品中生物大分子物质的浓度和纯度，并将其与标准品的吸光度值对比，判断样品是否纯度高、浓度精确。
三、DNS紫外分光光度法的应用DNS紫外分光光度法在蛋白质纯化、定量、质量控制等方面具有广泛应用。
它不仅可以用于测定DNA、RNA和蛋白质的浓度和纯度，还可以用于判断DNA、RNA的纯度以及分子量大小。
四、DNS紫外分光光度法的优缺点优点：具有简便操作、准确可靠、灵敏度高、测量速度快等优点，适用于大量样品的测定。
缺点：DNS试剂的稳定性差，易降解和硫酸等化学物品使用过程需要注意操作安全性与环保性等问题。
综上所述，DNS紫外分光光度法是一种简单而有效的生物大分子物质测定方法，其具有极高的应用价值以及很广的适用范围。
实验十九DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N—末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N—末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。
二、原理：DNS—Cl在碱性环境里蛋白质和肽的α-氨基酸的氨基起反应，生成带有荧光的、稳定的DNS-氨基酸（参看图19-1，19-2），其反应如下：蛋白质在水解前与DNS—Cl反应，产生DNS-蛋白质，它标记在N-末端氨基酸残基上，经水解和薄层层析而测知是何种氨基酸。
蛋白质水解后与DNS—Cl反应，标记的是蛋白质的氨基酸组成成分，如图19-1和图19-2所示。
这是一种较为简便的、适用的蛋白质的氨基酸组成成分分析的方法。
DNS-蛋白质水解产物中包括下列DNS-衍生物：相当于N-末端的α-DNS-氨基酸，从链内赖氨酸及酪氨酸残基形成的ε-DNS-赖氨酸和O-DNS-酪氨酸，这些衍生物相当稳定。
此外，DNS—Cl还与溶液中的氨起反应生成DNS—NH2，DNS-磺酰胺以及DNS—Cl水解生成的DNS—OH（DNS-磺酸）。
此法与氟二硝基苯法相比，有二个突出的优点，即水解产物无需提取，可用电泳或层析法直接鉴定氨基酸；另外就是灵敏度高，DNS-氨基酸的最大荧光激发值约为550nm，由于其荧光十分强烈，1—5n mol·L-1或0.2—1.0n mol·L-1 DNS-衍生物即可分别用电泳或薄层层析容易地检测。
DNS—Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物。
其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可与DNS—Cl生成双DNS-氨基酸衍生物。
这些氨基酸相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度达10—9—10—10摩尔水平。
比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的氟二硝基苯（FDNB）法高100倍。
DNS-蛋白质（或肽），在5.7mol·L-1 HCl，110℃水解16—20h，DNS-蛋白质的肽键被打开。
DNS-氨基酸的制备和鉴定实验目的1.了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理2.掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法实验原理荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-氨基酸再经酸水解可释放出DNS-氨基酸，其反应式如下：图1：DNS-氨基酸生成反应机理图2：单项层析结果示意图DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。
这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB 法高100倍。
将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。
DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即：图3：DNS-Cl在pH过高水解产生DNS-OH在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH2，即：图4：DNS-Cl过量产生DNS-NH2DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄绿色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分开。
DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug(相当于10—10mol)。
由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。
层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
DNS-氨基酸的制备和鉴定
实验目的
1.了解并掌握DNS-氨基酸的制备和鉴定的原理
2.掌握制备Dansyl氨基酸和聚酰胺薄膜层析法的操作和方法
实验原理
荧光试剂5-二甲氨基-1-萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-Cl)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-氨基酸再经酸水解可释放出DNS-氨基酸，其反应式如下：
图1：DNS-氨基酸生成反应机理图2：单项层析结果示意图DNS-Cl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。
这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB 法高100倍。
将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。
DNS-Cl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即：
图3：DNS-Cl在pH过高水解产生DNS-OH
在DNS-Cl过量时，会产生DNS-NH
2
，即：
图4：DNS-Cl过量产生DNS-NH
2
DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄绿色荧光，而DNS-OH和DNS-NH
2
产生蓝色荧光，可彼此区分开。
DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0.01ug(相当于10—10mol)。
由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。
层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，即各组分所受的固定相的阻力和流动相的推力影响不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
聚酰胺是—类化学纤维原料，由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。
因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。
它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。
如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类<如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。
被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。
在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。
因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。
实验器材
1.聚酰胺薄膜（7×7cm）
2.电吹风一个
3.紫外灯一台
4.点样管（4支）
5.吸管
6.量筒
7.烧杯（500ml）8.铅笔
实验试剂
1.DNS-Cl丙酮溶液
2.展层液： V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:100
3.氨基酸样品：标准Gly、Phe、His溶液
4.混合氨基酸溶液
实验操作
1.DNS标记：
取4个小离心管，分别加入氨基酸30ul，再各加入30ulDNS-Cl丙酮溶液，混合均匀后置于37℃水浴中1小时；
2.点样：
在距聚酰胺薄膜底端1cm处用铅笔画一条直线，以这条直线为基准，分别取四个离心管中液体用四个不同的点样管在聚酰胺薄膜上点样，直径不宜超过2mm，，重复2-3次，最多不宜超过5次；
3.展层：
1)配制展层液(V(甲酸)：V(蒸馏水)=1.5:100)100ml，可两个小组共同配制使用；
2)将展层液置于培养皿盖（加12-13ml）或底（加10ml）中，将已点样的聚酰胺薄膜用皮筋
套上可使其站立后放入展层液中，盖上500ml烧杯；
3)待展层液上升到距顶端大约0.5cm时展层结束，将其取出，冷风吹干；
4.透射：
将冷风吹干的聚酰胺薄膜放在紫外灯下，用铅笔将黄绿色斑点圈出。
注意事项
1.严格控制点样位置以及点样直径，点样时直径不宜超过2mm，不宜点在边缘，点样后马上用吹
风机冷风吹干，重复2-3次以保证点样量足够，点样不能太用力，防止聚酰胺薄膜断裂而影响展层；
2.展层液要现配现用，需混合均匀，用量既不可不足，又不可过量而导致把点样点没过；
3.展层后必须经电吹风将膜吹干；
4.使用紫外照射时要注意使用时间短。
实验结果
1.下面是我在本次试验中所得到的聚酰胺薄膜，由于实验中第一次点样过大，所以将聚酰胺薄膜
的左下角与其它区域分割开，以免影响展层结果。
从左到右依次为丙氨酸（Ala）、苯丙氨酸（Phe）赖氨酸（Lys）和混合氨基酸。
2.Rf值计算：
注：X为色斑中心至原点中心的距离，Y为溶剂前缘至原点中心的距离,其中Y值均相同为5.10cm。
在混合氨基酸中：
1.对于丙氨酸：X=
2.62cm,Rf=2.62/5.10=0.51
2. 对于苯丙氨酸：X=0.95cm，Rf=0.95/5.10=0.19
各个标准氨基酸与混合氨基酸中的对应成分Rf值相同。
分析总结
从实验结果分析可得以下几条结论：
1.由实验原理可知，氨基酸的氨基与DNS-Cl反应后是黄绿色荧光。
而Lys含有两个氨基，因
此L ys带有两个黄绿色荧光标记。
又由于DNS-Cl主要与α-氨基反应，由此可判断最上方的少量黄绿色荧光的是Lys的δ-氨基反应后的DNS-Lys。
2.DNS-丙氨酸的相对分子质量体积最小,非极性最强，形成氢键最弱，展层速度最快，因而在
最上方；而Lys由于与聚酰胺表面形成2个氢键，极性强，所以展层速度慢；Phe的极性处于两者之间，因而展层速度也在两者之间。
所以本实验的结果主要与氨基酸的极性和所形成的氢键有关。
3.聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。
混合物随展层液通过聚酰胺薄膜时，由于被分离
氨基酸与薄膜形成氢键，而各氨基酸形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。
导致所展示的层析结果。
4.展层液与被分离氨基酸在聚酰胺离子表面竞争形成氢键，展层液使被分离氨基酸在展层液
与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有较大差异。
易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。
5.从实验结果分析可得：混合氨基酸中应同时含有丙氨酸和苯丙氨酸两种。
实验中可导致误差出现的几点：
1.在聚酰胺薄膜上点样时用力过大，很可能会使聚酰胺薄膜断裂，影响层析结果，可能会导
致心形黄绿色荧光斑出现，我在点样时就出现这种情况，导致混合氨基酸的荧光斑的其中
一个出现心形；
2.点样时不及时吹干，致使点样液扩散，会在很大程度上影响实验结果，因严格控制点样点
的大小，最好不要超过2mm；还有点样时应重复2-3次，防止点样液成分不足；
3.点样时若两点之间间隔过小，也会影响实验结果，本次实验宜控制在1cm左右。
思考题
聚酰胺薄膜层析法中对层析液有什么要求，层析液应具备什么特点？
就拿本实验来讲，聚酰胺薄膜层析法在分析氨基酸时展层液应具备以下特点：
1.能不同氨基酸形成不同程度的氢键，保证展层过程的顺利完成；
2.展层速度快，单层层析（7×7cm）一般只需15-20min；
3.不会将氨基酸或者聚酰胺薄膜破坏，影响实验结果。
影响Rf值的主要因素
1.物质结构对于Rf值的影响：
极性物质易溶于极性溶剂(水)中，非极性物质易溶于非极性溶剂(有机溶剂)中。
所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。
例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。
所以前者在水(固定相)中分配较多，因此Rf值低于后者。
2.溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响：
这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。
溶质与溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响就很大。
3.pH对Rf值的影响：
这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。
弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大，解离度越大，极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分配时，偏向于极性强的一相，这样，改变pH就会同时改变分配系数，从而使Rf也会相应变化。
4.滤纸对Rf值的影响：
滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大，所以不同的滤纸得到不同的Rf值及不同的斑点形状。
纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异，质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致，随着纤维的纹理流动紊乱，另一方面纸的含水量不均一，也不能得到理想的分离效果。
5.温度对 Rf值的影响：
Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密切关系。
温度对Rf 值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相之间的分配随温度的变化而不同。
随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同，因此有些溶剂系统对温度的敏感程度强些，有些则差些。
敏感程度强的对温度的要求就严格，敏感程度差的对温度的要求就不太严格。
温度改变使溶剂系统中的溶解度改变，所以 Rf值也改变。
一般层析展层是在恒温室中进行的，室温可在20℃至40℃，温度改变不超过±0.5℃。
