氨基酸的分离鉴定—纸层析法

氨基酸的分离鉴定纸层析法引言：氨基酸是构成蛋白质的基本组成单元，对于生物体的正常生理功能至关重要。

因此，准确地分离鉴定氨基酸成分对于研究蛋白质结构和功能具有重要意义。

纸层析法是一种简单而有效的分离和鉴定氨基酸的方法。

本文将介绍氨基酸的分离鉴定纸层析法并探讨其应用。

一、纸层析法的原理纸层析法是利用气相平衡原理进行物质分离的一种方法，其原理是根据物质在纸上各组分的相对亲疏性，通过运动距离的差异来分离物质。

在氨基酸的分离鉴定中，纸层析法通过将待测氨基酸溶液滴于纸上，然后将纸立起来，将纸的下端浸入相应的溶剂中，使得溶剂上升，通过毛细作用将氨基酸上提，最终实现氨基酸的分离和鉴定。

二、纸层析法的步骤1. 准备工作：制备纸层析板和显色剂。

2. 样品处理：将待测氨基酸溶解于适量的溶剂中，使其浓度适宜，然后滴于纸层析板上。

3. 运行纸层析：将纸层析板立起，纸的下端浸入相应的溶剂中，待溶剂上升到一定高度后，取出纸层析板。

4. 显色：将纸层析板放置于显色剂中，通过氨基酸与显色剂的反应，使得氨基酸在纸上显色。

5. 结果鉴定：根据显色的位置、颜色和强度等特征，对氨基酸进行鉴定和定量分析。

三、纸层析法的应用1. 氨基酸组成分析：纸层析法可用于分析蛋白质中氨基酸的组成，从而揭示蛋白质的结构和功能。

2. 质量控制：纸层析法可用于对食品、药品等中氨基酸含量的快速检测，保证产品质量和安全性。

3. 生物体内氨基酸代谢研究：纸层析法可用于研究生物体内氨基酸的代谢途径和代谢产物。

四、纸层析法的优缺点纸层析法作为一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法，具有以下优点：1. 简单易行：操作简单，不需要复杂的仪器设备，成本低廉。

2. 分离效果好：对于氨基酸的分离效果较好，可以得到较为准确的结果。

3. 易于观察：通过显色剂的反应，可以直观地观察到氨基酸在纸上的分离和鉴定结果。

然而，纸层析法也存在一些缺点：1. 分离效果有限：对于某些结构相似的氨基酸，纸层析法的分离效果不佳，难以实现准确鉴定。

实验七氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、目的通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。

二、?原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。

惰性支持物是新华一号滤纸，其上含有很多的羟基，与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。

水相因此称为静止相（固定相），有机溶剂称为流动相。

展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成，它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相，另一相是以有机溶剂饱和了的水相。

分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。

当用滤纸进行分配层析时，流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。

不同的氨基酸在一定的条件下，有其一定的Rf值，故可根据Rf值定性鉴定氨基酸，但通常用已知的标准氨基酸层析作对照，本实验就是如此。

●纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。

●层析溶剂由有机溶剂和水组成物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移值）来表示的：Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

本实验利用纸层析法分离氨基酸。

三、材料与方法（1）、材料：层析缸；毛细管；喷雾器；培养皿；层析滤纸；正丁醇；冰醋酸；分液漏斗；烧杯；培养皿；赖氨酸；脯氨酸；氨酸；苯丙氨酸；亮氨酸；茚三酮（2）操作步骤1.配置层析液置于密闭的层析缸中。

2．准备滤纸：取层析滤纸一张。

在纸的一端距边缘2cm处用铅笔划一直线，在直线上每间隔2cm做一记号，标出5个原点。

3．点样：用毛细管将各氨基酸样品点在5个原点上，用量10～20μl，每点在纸上扩散的直径，最大不超过3mm，边点样边用电吹风吹干，越小越好。

干后再点一次。

4．扩展??用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。

氨基酸的分离鉴定——纸层析氨基酸是构成蛋白质的基本单元，其在生物体内的作用极为重要。

因此对氨基酸的分离和鉴定具有重要的研究意义。

纸层析是一种常用于分离和鉴定氨基酸的方法。

其原理是利用氨基酸在纸层析板上的运动速度不同，根据氨基酸之间的相互作用，分离出各种氨基酸。

实验步骤：1. 纸层析板的制备将一张高分子量纸，如Whatman No.1滤纸，剪成所需要的大小，并用铅笔在纸上画出氨基酸移行的标线。

2. 氨基酸样品的制备将所需的氨基酸样品溶解在适量的水中，浓度应为0.2-2%。

3. 样品的上样将氨基酸溶液利用微量注射器沿着标线往上移行。

在上样后，将纸层析板放在带有盖子的玻璃罩中，罩中放置一些饱和度为70%的异丙醇-水溶液，保持相对湿度为70%，使其充分展开。

5. 鉴定氨基酸将经过分离的氨基酸溶液阴性反应的氨基酸用二乙酰胺-丙酮混合溶液鉴定。

将0.2ml 二乙酰胺-丙酮混合溶液加入几滴氨基酸样品中，加热60℃-80℃，5分钟。

加入0.1ml氯仿，振荡混合，分离出上清液，上清液加入干燥瓶中，用喷雾器喷洒Ninhydrin试剂，加热于热水中1分钟，在冷水中快速降温附着氨基酸的部位呈现紫色。

注：二乙酰胺-丙酮混合溶液的组成为45%二乙酰胺，45％丙酮和10%水。

6. 结果的解释根据氨基酸在纸层析板上的运动速度和比色反应的颜色，确定样品中的氨基酸种类及含量。

优点：纸层析方法简便易行，无需昂贵的仪器设备，适用于小样品分析，能分离不同种类的氨基酸，并且结果清晰，操作简单。

限制：纸层析分离结果受到氢键作用和酸碱度等因素的影响，需要控制好上样的数量和浓度。

此外，纸层析无法分离胶原氨基酸和类似结构的氨基酸，且鉴定结果在颜色和色谱图谱方面有些模糊。

纸层析法分离鉴定氨基酸纸层析法是一种常用的分离和纯化化学物质的实验方法，被广泛应用于有机合成、生物化学和食品科学等领域。

本文将介绍纸层析法在氨基酸分析中的应用。

一、实验原理氨基酸的分离和鉴定是生物化学实验中常用的手段。

氨基酸分子中含有羧基和氨基，可以通过纸层析法实现其分离。

纸层析法是一种基于物质分子间不同的吸附性能而进行分离的方法。

在纸层析实验中，将试样涂在纸层析片（通常为滤纸）的一侧，并将其放入溶剂（通常为水、丙酮、甲醇等）中，溶剂会沿纸层析片向上移动，分离出不同物质组分。

氨基酸分子的羧基和氨基分别具有不同的亲水性和疏水性，因此在纸层析分离中会表现出不同的吸附行为。

例如，疏水性较强的疏水基团会被生物样品或溶剂吸附，从而较慢地从纸层析片上移动，这些氨基酸通常出现在较高位置；而亲水性较强的羧基团则会被水吸附，因此移动速度较快，这些氨基酸通常出现在较低位置。

二、实验步骤1、制备样品：取大约1mg的氨基酸标准品或被测样品，加入1mL的去离子水中，并轻轻搅拌，制成1mmol/L的溶液。

2、制备纸层析片：取一张长约50cm的滤纸，将其叠成4层，然后将中间部分剪成30cm的长条，每条的宽度为1cm左右，用铅笔在底部标记出位置，离开1cm到1.5cm的距离。

3、涂样：在每个标记位置上滴加不同氨基酸溶液，每次加约5µL。

所有样品均按照氨基酸的相对极性从小到大进行涂样，从左到右编号，以便于鉴定。

4、溶剂选择：选择一种适宜的溶剂，通常为水、丙酮、甲醇等。

将滤纸上端放入溶剂中，约1cm左右的位置即可。

5、开始实验：用三角架和夹子将滤纸张贴在玻璃板上，使其呈现较小的倾斜面。

在滤纸的底部悬挂一张白纸，以便于观察样品在纸层析上的位置变化。

待溶剂无法再升高时，实验结束。

6、结果读取：按照行（从上到下）顺序，观察样品的移动距离。

三、实验结果及分析纸层析法可以分离并识别出存在于试样中的氨基酸分子，在实验中，通过观察样品从纸层析片底部开始向上移动的情况，可以确认每个氨基酸的相对位置和含量。

生物化学实验二——纸层析法分离氨基酸实验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、实验目的1、掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待测样品的氨基酸成分。

2、学习用纸层析法分离、鉴定氨基酸二、实验原理⑴纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。

滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。

当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。

⑵溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：⑶Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离⑷在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

本实验利用纸层析法分离氨基酸。

三、实验器材a)大烧杯（5000mL）：1只/组b)毛细管。

c)喷雾器：公用。

d)培养皿：1只/组。

e)层析滤纸（长22cm、宽14cm的新华一号滤纸）：1张/组。

f)直尺、铅笔：自备。

g)电吹风：1只/组。

h)托盘、针、白线：1套/组。

i)手套：1双/组。

j)塑料薄膜：公用。

k)小烧杯：50mL，1只/组。

四、实验试剂（1）扩展剂：将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与5体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。

（2）氨基酸溶液：0.5%的已知氨基酸溶液3种（亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸，脯氨酸氨酸），0.5%的待测氨基酸液1种。

（3）显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

五、实验操作检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。

（1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。

（2）规划：带上手套，取宽约14cm、高约22cm的层析滤纸一张。

在纸的下端距边缘2cm 处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。

实验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法实验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法【实验目的】1.学习氨基酸纸层析法的基本原理2.掌握氨基酸纸层析的操作技术【实验原理】纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法，其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的有机溶溶剂是流动相。

在层析时，将样品点在距滤纸一端约2～3cm 的某一处，该点称为原点；然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层，这样混合氨基酸在两相中不断分配，由于分配系数（Kd）不同，结果它们分布在滤纸的不同位置上。

物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值（rate of flow, Rf）来表示。

所谓Rf，是指在纸层析中，从原点至氨基酸停留点（又称为层析点）中心的距离（X）与原点至溶剂前沿的距离（Y）的比值：在一定条件下某种物质的Rf值是常数。

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。

【器材与试剂】（一）器材1.层析缸2.点样毛细管3.小烧杯4.培养皿5.量筒6.喷雾器7.吹风机（或烘箱）8.层析滤纸（新华一号）9.直尺及铅笔(二) 试剂1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液)将正丁醇和乙酸以体积比4∶1在分液漏斗中进行混合，所得混合液再按体积比5∶3与蒸馏水混合；充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。

2. 氨基酸溶液0.5%赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液（各组份均为0.5%）。

?3. 显色剂0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

【实验步骤】1.准备滤纸取层析滤纸（长22㎝、宽14㎝）一张，在纸的一端距边缘2～3㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔3㎝作一记号，如右图所示。

纸层析法——氨基酸的分离与鉴定一、 实验目的1、 了解纸层析法的使用原理。

2、掌握用纸层析法分离蛋白质的操作步骤。

二、 实验原理1、 纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的分配层析方法，滤纸上的纤维具有羟基，是亲水基团，滤纸吸附水作为固定相，其上流经的有机溶剂即展层剂作为流动相。

当展层剂流经固定相时，固定相上的样品由于亲水、疏水能力不同，在两相之间不断分配，疏水能力强的多溶于流动相，随流动相移动距离较远，亲水能力强的移动距离则较近。

2、 所有的氨基酸的α碳上均连接一个氢原子和两个亲水基团羧基（—COOH ）与氨基（—NH 2），唯一的不同则在于R 基团。

因此R 基团在氨基酸的亲水疏水能力对比中起到了决定性的作用。

本实验采用丙氨酸，苯丙氨酸，天冬氨酸，其R 基团分别是—CH 3，—CH 2—C 6H 5，—CH 2—COOH ，其亲水疏水能力迥异，能在滤纸上明显分开。

3、 Rf 值表示原点中心至显色斑点中心的距离与原点中心至流动相前沿的距离比。

在一定条件下，Rf 值为定值，其影响的因素有物质本身的性质，溶剂的性质，PH 值，温度，滤纸的性质等等，本实验不予探究。

在测量原点中心至显色斑点中心的距离时，由于斑点的形状不规范（近似圆形），所以，一般取斑点的重心，测量出重心与起点的距离即可。

4、 显色原理：茚三酮在弱碱性溶液中与α—氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氧，脱羧反应，最后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。

Y X R f ==原点到溶剂前沿的距离离原点到层析点中心的距三、试剂（一）提前配制试剂8*10-3mol/L丙氨酸溶液：精确称取0.356g晶体，溶解后定容到500ml。

8*10-3mol/L苯丙氨酸溶液：精确称取0.661g晶体，溶解后定容到500ml。

8*10-3mol/L天冬氨酸溶液：精确称取0.532g晶体，溶解后定容到500ml。

（将上述三种溶液装于小瓶中实验时，每两组共用一组试剂）正丁醇88%甲酸蒸馏水茚三酮晶体注：实验时，以上试剂均为每两组同学共用一组试剂。

实验一：氨基酸的分离鉴定--纸层析法一、目的：通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。

二、原理：层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。

层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。

如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。

层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。

纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。

纸层析属于分配层析法。

分配层析法是一种连续抽提法，利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。

纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。

水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相：由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。

当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相而进入无溶质的区域，这时，又重新分配，一部分溶质从有机相进入水相。

当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断分配。

溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。

纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从有样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。

在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。

实验二氨基酸的分离鉴定——纸层析法一、实验目的1、掌握氨基酸纸层析的方法和原理，学会分析待测样品的氨基酸成分。

2、学习用纸层析法分离、鉴定氨基酸二、实验原理⑴纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。

滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。

当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。

⑵溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：⑶Rf=原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离⑷在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。

Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

本实验利用纸层析法分离氨基酸。

三、实验器材a)大烧杯（5000mL）：1只/组b)毛细管。

c)喷雾器：公用。

d)培养皿：1只/组。

e)层析滤纸（长22cm、宽14cm的新华一号滤纸）：1张/组。

f)直尺、铅笔：自备。

g)电吹风：1只/组。

h)托盘、针、白线：1套/组。

i)手套：1双/组。

j)塑料薄膜：公用。

k)小烧杯：50mL，1只/组。

四、实验试剂（1）扩展剂：将4体积正丁醇和1体积冰醋酸放入分液漏斗中，与5体积水混合，充分振荡，静置后分层，弃去下层水层。

（2）氨基酸溶液：0.5%的已知氨基酸溶液3种（亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸，脯氨酸氨酸），0.5%的待测氨基酸液1种。

（3）显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。

五、实验操作检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。

（1）平衡：剪一大块塑料薄膜铺在桌面上，将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上，再把盛有约20mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中，用塑料薄膜密封起来，平衡20min。

（2）规划：带上手套，取宽约14cm、高约22cm的层析滤纸一张。

在纸的下端距边缘2cm 处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。

另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位），参见左图。

实验一：氨基酸的分离鉴定--纸层析法一、目的:通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。

二、原理:层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。

层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。

如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。

层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。

纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。

纸层析属于分配层析法。

分配层析法是一种连续抽提法，利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。

纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。

水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相：由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。

当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上的溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相而进入无溶质的区域，这时，又重新分配，一部分溶质从有机相进入水相。

当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断分配。

溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。

纸上层析法的一般操作是将混合物点到纸上，干后让溶剂从有样品的一端经毛细作用流到纸的另一端。

在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。

氨基酸的分离鉴定——纸层析法实验目的: 1.学习纸层析法的基本原理；2.掌握纸层析法分离氨基酸的操作技术。

实验原理:纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法, 它是利用不同的氨基酸在展层溶剂中的分配系数不同而得以分离的一种方法。

惰性支持物是新华一号滤纸, 其上含有很多的羟基, 与水有较强的亲和力因此把它看成是含有静止水相的惰性支持物。

水相因此称为静止相（固定相）, 有机溶剂称为流动相。

展层溶剂由两个互不相溶的有机溶剂和水组成, 它们互相混合时便分成两相：一相是以水饱和了的有机相, 另一相是以有机溶剂饱和了的水相。

分配系数(α)＝溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。

当用滤纸进行分配层析时, 流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提, 使氨基酸在两相之间不断分配而得以分离。

分配层析的原理可用一个模式解释（英国Martin等）：把滤纸看成是一个层析柱, 可以分成若干层板, 设层板的物质为A、B；且A 和B的分配系数（α）分别为1和1/3；又设固定相为S, 流动相为L, 两相互相接触但不相混溶。

当第一层流动相中加入一定量的 A.B两项物质后, 溶质根据各自的分配系数在第一层的两相中分配, 流动相继续在流动, 此时第一层固定相与新流到的流动相之间以及原来第一层流动相与第二层固定相之间进行第二次分配, 以此类推三次分配即可看出A与B最浓部分以分开, A在第二层最浓, B在第三层最浓, 如果继续抽提下去, 经过若干此后, A.B两物质便可完全分开。

显然, 分配系数越大的物质就越容易分开。

模式图如下所示:图中的第二层流动相中的溶质A为1/2, B为27/32；第三层流动相中的溶质A为1/8, B为27/64；第三层●抽提一定时间后, 溶剂流到接近滤液前沿1～2cm时。

层析完毕, 将滤液取出、干燥、用显色剂显色即可看到氨基酸在滤纸上的位置, 此位置用Rf表示。

●不同的氨基酸在一定的条件下, 有其一定的Rf值, 故可根据Rf值定性鉴定氨基酸, 但通常用已知的标准氨基酸层析作对照, 本实验就是如此。