制作胶体金试纸的硝酸纤维素膜选择及应用技巧完

免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。

免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。

而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。

1耗材的选择1.1不同型号膜的筛选。

硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。

不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。

膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。

用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。

1.2结合垫的选择。

结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。

1.3样品垫及吸水纸的选择。

样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。

试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。

如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。

胶体金硝酸纤维素膜吸水1. 引言1.1 胶体金介绍胶体金是一种具有广泛应用前景的纳米材料，其具有优异的光学性质和化学活性，使其在生物医学、催化剂、传感器等领域有着重要的应用。

胶体金的制备方法多样，包括溶剂热法、还原法等。

在溶液中，胶体金可以形成稳定的胶体颗粒，具有可调控的形貌和尺寸，因此被广泛用于制备各种功能性材料。

在材料科学领域，胶体金的研究备受关注，并展现出了极大的潜力。

1.2 硝酸纤维素膜介绍硝酸纤维素膜是一种由硝酸纤维素通过溶液浸渍、干燥而成的薄膜状材料。

硝酸纤维素是一种具有优良物理性质和生物相容性的天然高分子材料，具有很高的机械强度和热稳定性。

硝酸纤维素膜常被用于医疗领域，如制备生物支架、药物缓释等方面。

硝酸纤维素膜的制备通常通过湿法工艺，将硝酸纤维素溶解于适当的溶剂中，在基板上形成均匀的薄膜，并通过干燥或者其他方法使其固化。

硝酸纤维素膜的厚度、孔隙结构和表面化学性质可以根据应用需求进行调整和控制。

硝酸纤维素膜具有较大的比表面积和孔隙率，有利于吸附和扩散水分子。

其多孔结构和高度结晶化的形态使得硝酸纤维素膜具有较强的吸水性能，可以广泛应用于水处理、湿敷等领域。

与其他材料相比，硝酸纤维素膜不仅具有优异的吸水性能，还具有生物相容性好、可降解等优点，因此在生物医学、环境保护等领域具有潜在的广阔应用前景。

1.3 研究背景胶体金是一种具有优异光学性能和表面增强拉曼散射活性的纳米材料，广泛应用于传感、光催化和生物医学等领域。

硝酸纤维素膜是由硝酸纤维素纳米颗粒组成的薄膜，具有优异的透气性和可降解性，被广泛应用于药物包裹和食品包装等领域。

通过深入研究胶体金硝酸纤维素膜在吸水方面的性能特点和机制，可以为其在医疗、环境保护和工业生产等领域的实际应用提供理论基础。

对胶体金硝酸纤维素膜的吸水性能进行系统研究具有重要的科学意义和应用前景。

2. 正文2.1 制备胶体金硝酸纤维素膜制备胶体金硝酸纤维素膜是一个复杂而关键的过程。

免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。

免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。

而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。

1耗材的选择1.1不同型号膜的筛选。

硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。

不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。

膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。

用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。

1.2结合垫的选择。

结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。

1.3样品垫及吸水纸的选择。

样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。

试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。

如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。

制作胶体金试纸的硝酸纤维素膜选择及应用技巧(完)?硝酸纤维素膜又称为NC膜, 在胶体金试纸中用做C/T线的承载体,同时也是免疫反应的发生处.所以NC膜成为该试验中最重要的耗材,而由于其属于非标准器件,基本上每个项目开始阶段都会遇到如何选择合适的NC膜的问题.同时也存在是否要对NC膜进行后期处理及如何处理的讨论.一. NC膜的生产原理这个虽然看上去属于生产厂商的事情,但是GMP有个观点是强调对过程的控制才会有好的结果.那么只有了解NC膜的大致生产过程和基本原理才能更好的掌握这种材料的特性,最终制作出满意的试纸.你了解吗首先,匀浆配比购买回的原料硝酸纤维素粒子是一种非常普遍的有机化学物,溶解形成混浆,在该浆体内,会加入一定比例的试剂来调整最后形成的膜的性质,一般是一个试剂配方,主要包含表面活性剂/高分子聚合物/盐离子/成型剂等溶解在一个缓冲体系内. 不同的厂家加入的溶液配方不一样,直接导致了在产品的差异.其次,滚筒铺膜配好的匀浆通过滚筒,形成了一张薄膜,平摊在十分光滑的平面载体上.这个和造纸的过程是非常相似的.最后,成型在匀浆内的成型剂开始挥发,膜逐步干燥成型.同时在这个过程中由于温度比较高,有些厂家在这个过程采取了在密闭腔体内成型,同时补充配方溶液的形式,来避免一些有效成分的蒸发.切割出产品通过以上步骤生产出来的膜是呈一个宽度极大的产品,宽度的大小直接和滚筒的大小相关,滚筒越大生产越方便,但设备的成本也越高.宽膜要经过切割才能成为我们购买到的25mm或18mm(或20mm)宽,而长度上,成品卷膜和宽膜的长度是相同的.理论上可以让厂家切成你需要的任意宽度,但这样会造成原料的浪费和人力成本的增加,后来厂商在和试纸生产厂家的协调过程中,综合用料成本和生产便利性基本确定了上面说的宽度,以次为标准.关于不同宽度的用途差异,稍后详述.从生产的过程,我们可以得知, NC膜本身是已经添加了表面活性剂来改善亲水能力,而且已经存在有一定的缓冲系统(虽然对纸条测试影响不会很大).对后面谈到的一些问题就比较容易理解.二.NC膜的供应商及现状现在有销售的NC膜品牌型号如下:MILLIPORE(美国), M135(有背衬/无背衬两种) M180(有背衬/无背衬两种)WHATMAN and S&S, Immunopore RP, 100 sec/4cm, 带被衬, CT线不会扩散, 很集中, 背景干净. 适用于各种test. (只有25mm x 50M); PuraBind R, 140sec/4cm, 不带被衬, 适用于小分子竞争test等. (20/25mm x 50M)SARTORIUS(德国), CN140伊能(国产), 8um 6umMDI(印度), 8um 6um说到这些供应商,不得不谈谈发展的历史. S&S是膜行业的鼻祖,这点所有的膜公司都承认.millipore,SARTORIUS和whatman都是后辈, 我的理解是S&S在市场竞争的过程中经营方式落后,最后被whatman收购. 就产品质量来说S&S的AE99和AE98是非常优良的.而MDI是近年才出现的一个膜公司,可能也是与印度胶体金试纸生产行业的快速发展密切相关,其所有的产品都是在印度生产,经营者为父子两人,父亲负责技术,儿子进行经营.03年我曾测试过其样品,结果发现在跑板方面有不均匀波浪现象,且加速稳定性试验结果很不理想.今年初我又收到了一些样品,情况仍然没有太大改善,后来就不再考虑使用了.国产膜伊能是在去年开始进入市场的,主要特点是能降低成本,样品我也试测了几批,性能已经与进口膜很接近,经过一些有针对性的优化后可以用在HCG产品的生产.但不是所有的工厂都能购轻易的完成这个优化工作.膜的国产化是一个趋势,但进口厂家要实现国产化还面临很大的问题,其中厂房设备的搬迁就是一个非常大的问题.几家供应商的国内联络人和技术支持分别是MILLIPORE(美国), Mrs Yang, harryWHATMAN and S&S, Clark, kevinSARTORIUS(德国), Mr Xu, Iric伊能(国产), connie, Mr YangMDI(印度), Ashawant Gupta销售模式都是直销式,少量购买的情况下要通过代理商走一下帐.价格上MILLIPORE与WHATMAN相当,SARTORIUS便宜一些,国产膜更便宜一些.印度膜和SARTORIUS价格相同,基本不用考虑. 在科研市场,MILLIPORE使用最多.科研市场由于仅用来试验,所以膜需求量小,不被供应商重视. 生产客户中,MILLIPORE,WHATMAN,SARTORIUS占有量相当,伊能现在也开始有一些工厂客户了,MDI量最小投诉也最多.三.膜的选择以上谈了该行业的一些发展现状,那么我们大致了解后,回到最关心的问题,如何选择膜经常会遇到的问题是,我是做**项目的,我该选择那类膜这里涉及到一个膜的分类标准问题,一个供应商可能提供这个膜是8um,但另一个供应商告诉你膜是135s的.这之间的区别与联系是什么um指的是膜孔径,而从上面膜的生产过程,我们可以看出,膜的孔径实际上是没有办法界定的.由于干燥成型等过程的非绝对均一,膜的孔径也是非均一的.膜孔径的说法实际上是沿用了一直以来的一个形象称呼.而以秒为单位的定义为,每4cm膜,水的层析时间是***s.该单位已经越来越被各大厂商所接受,成为了一个通用的比较标准.以下我们将采用s单位来进行交流.换算情况大致为: 8um=135s; 6um=180s.不同秒数的膜对反应有什么影响呢首先,我们分析一下液体在膜上的运动过程. 一张长度为4cm的膜, 每隔1cm做一个标记, 当液体运动过标记处时记录时间点. 那么你将会发现液体在膜上的运动是呈减速前行的. 而两张不同秒数的膜(例如135s, 180s)在同一时间标记点处的运动速度不同.这个试验用清水做不好观察,可以考虑用色素水溶液,非常明显. 那么从这个试验可以看出,在通过同一T线喷点位置时, 金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜. 那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短, 读数快, 那么灵敏度也就越低. 反之, 反应时间长, 读数慢,也就灵敏度高. 同时还有一个问题是, 反应时间越长, 发生非特异性结合的可能性就越大, 所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度. 所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡.其实我们并没有那么多选择. 经过使用实践, 各供应商一般都只提供两个型号, 就是135s和180s. 虽然看到有些厂家的产品目录上型号种类繁多,但这两个型号的定货量就占了95%以上, 其他型号供货上也就远不如这两个型号来得顺利. 135s一般用在双抗体夹心法, 180s一般用在竞争法. 你所要做的是,先选择其中的一个型号, 然后比较不同供应商同一个型号的差异, 由于前面说的添加配方与你的试验条件配合的不同,这个差异可能大也可能小. 具体要根据试验结果来确定最后的选择.我个人不建议地毯式的测试不同规格/不同厂家的膜, 这样成本高, 成功的几率也小.四.膜的质控方式本节适合用膜量较大的公司用户参考.对于一卷膜可以用上几个月的用户来说, 厂家的质控标准已经完全能满足你的要求,而不需要自己再做相关的质控.膜的质控虽属于原辅料QC职能, 但由于其专业性强, 一般都由小样调试人员来执行. 膜入原料库后需要进行如下检验工作:1. 查收COA在购买时, 供应商会随产品为每个lot的膜提供一张纸质的出厂质量证书, 该证书被称为COA. 如果你已经购买某一批次的膜, 而没有索取相应的证书, 如果有需要可提供批号向厂家要求补发. 其实在很多行业都有厂商为自己的产品附上COA的习惯.COA一般只提供给大客户, 对小客户是没有意义的.其内容主要是厂家在产品出厂时做过一些测试的罗列. 作用可以理解为质量凭证和测试数据参考.2. 检查物理性能膜的物理性能主要是2个参数, 膜厚度和宽度. 长度不需要检测. 使用中可以关注长度上是否有断面重接现象, 断面多费料则多, 少数发生.厚度, 由螺旋测微尺,选择几个测量点检测后算平均. 膜生产的必测参数. 主要表现为厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能, 点出来的C/T线宽窄不一. 另外也影响爬速.宽度, 普通直尺测量.物理性能一般都不会有什么大问题. 毕竟检测标准客观, 易把握. 没有条件执行的厂家可省略.3. 跑水性能样本采用含有有色食用色素的水溶液, 目的是容易观测. 需制作一个简易支架.操作: 注入足够溶液到下部槽内, 将不同批次膜每隔1cm做一次标记(总长大于4cm)并放到倾斜支架, 整个支架下端放入溶液槽, 膜开始吸液, 计时. 记录每个标记处的通过时刻, 并与对照组比较.跑板时, 理论上溶液呈水平线形式上吸, 观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象.4. 点样测试C/T线出线时间, 其他试验条件相同情况下, 记录和比较C/T线出现时间是否与对照有差异.灵敏度, 比较不同样本浓度情况下, T线的变化是否和对照组同. 一般每批次膜取前端一段用来测试即可. 由于制造过程的不均一性, 不同批号的灵敏度会有一定差异, 当大批量使用时, 这种差异影响是非常大的, 那么就要按照灵敏度表现将不同批号的膜进行分类. 在膜的STOCK中要能够轻易的分辨出来. 当进入后期生产调用时, 就能根据这些分类, 按照订单要求取用不同批号的膜, 或者用强灵敏度的原料和差灵敏度的膜来搭配.关于膜的批内差. 批内差是肯定存在的,只是差距大小的问题,依据一般的测试条件是很困难获得详细的数值,因为你不可能对每一卷膜的每一段都做详细的测试. 减小膜批内差的最有效方法是不购入边缘膜带. 前面说过膜的生产方式,生产出的半成品是宽幅很大的一个膜面,要通过截面裁切才能获得25mm或者20mm 的宽度.那么就有中间部分,和边缘部分之分.越靠近中间部分,膜的均匀性越好,边缘部分则相对要差,就造成了批内差. 一般可以通过COA获得具体位置信息,例如MILLIPORE就在切割后用字母A,B,C……来表示切出的窄膜在宽幅膜中的位置.如果是试用某个型号的膜小样, 还需要在以上检测后加入膜加速老化试验. 包括膜单独的老化试验和点好膜后产品的老化试验, 具体试验方法请参看我以前写的研发思路一文.五.膜的深入探讨和应用技巧从本节开始,我们开始对膜进行深入讨论和谈一些应用技巧.1. 蛋白与膜的结合原理蛋白与膜的结合原理, 已知的结合力包括疏水作用力\H键\静电作用力等,确切的结合原理并不明确,主要靠假说来支撑.主要有两种假说:1) 首先两者靠静电作用力结合, 然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合.2) 首先两者靠疏水作用结合, 然后靠静电作用来维持长时间结合.两条假说, 都表明其结合过程分为两步, 首先结合和后面长时间结合.由于结合原理的不明确性, 导致在这方面的工作非常依赖实践经验.2. 膜对结合的影响1)膜孔径有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜,但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品,如果是不同厂家的产品,这种比较是无意义的. 膜孔径与层析速度的关系,已在上文描述.随着膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增. 估量表面积的参数为表面积比率(实际可用表面积与所用膜平面积的比率).另外, 膜孔径越小,层析速度也越小,那么金标复合物通过T线的时间也就越长,反应也就越充分.综合以上两点,结论为膜孔径越小灵敏度越高.但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高.所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜,找到合适的平衡点.2)不同厂家的膜差异这个差异主要来源于两点:1>??生产膜时,使用的聚合物和表面活性剂的来源,类型,数量不同.同理,在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响.2> 处理过程不同.3. 生物原料,缓冲溶液的试剂和配方1) 生物原料, 作为CT线的生物原料使用情况各异,所以这里只做略述.首先,单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体, 主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点, 而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别, 毫无疑问就增加了优化难度.其次,分子量越大,蛋白越难结合到固相材料上.2)缓冲液大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方,包括缓冲液,封闭液等等处理溶液配方.其实我也无法提供给你一个万用配方清单. 因为不同的反应体系需要不同的配方来支持, 而不同机构的反应体系又有差异. 想获”鱼”先学”渔”. 为了不误导大家,我在下面涉及到配方的问题上,仅提供思路,具体配方请自己摸索.缓冲液的构成一般是: PBS(或其他缓冲体系)+作用物质(针对某一特定问题)+PH调整. 我在参考过以前的各种资料后,个人意见为配方原则为宜简不宜繁,根据自己的需要添加作用物质,原来的很多需要添加的作用物质,由于膜制造技术的改进已经不再需要.推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2, 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性.作用物质的情况大致罗列如下:少量NACL,减少信号强度,消假阳.有机醇(甲醇,异丙醇等),润湿膜,减少膜带有的静电,利于结合包被.个人不推荐,因制膜工艺改进.表面活性剂(TW20,TX100),增加亲水力,可避免线条中空现象,也可增色.糖,保护剂,减缓老化速度,也可以增加亲水力同上.调PH到某个位置,可以消假阳.4. 点样环境环境湿度对点膜过程非常重要.最佳湿度一般在45-65%.湿度过低,膜上容易聚集静电荷,点膜容易出现散点,导致测试会出现疏水斑.湿度过高,膜上毛细作用加强,点膜容易引起CT线变宽甚至扩散.为了保证点样时膜湿度的均一性,一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间.5. 点样仪器与膜面情况的关系目前有两种点样方式,划膜式和非接触点膜式.非接触点膜式优于划膜式,进口划膜式优于国产划膜式.因划膜式为软管将抗体划到膜表面,而膜本身的物理性质为软脆,划管会在其表面留下印痕.进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好,所以留下的划痕较轻,而国产仪器较差,留下的划痕也就比较严重. 划痕容易对层析的金标复合物形成阻力,导致假阳性. 同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线(鬼线),而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象.6. 膜的宽度与点样位置膜的宽度一般有18mm(or 20mm)和25mm两种, 分别使用在做测试条和做测试板上.然而,不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度. 点样位置上移,金标复合物通过T线位置时速度变慢,反应时间增加,灵敏度升高. 反之灵敏度降低. 这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性.7. 溶液在膜上的扩散溶液在膜上的点样量一般情况下为1ul/cm.溶液在膜上的扩散是趋向两端的,喷点上去的是均匀的抗体溶液,但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间,中间的抗体会不断向两边扩散,所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的.一般情况下不影响你的试验.如果你发现线条出现两端红,中间淡的现象,就要考虑这个问题了.可以加如上面说的作用物质来解决.8. 点膜前后的封闭作用从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的,直接点膜就可使用.然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论.其实封闭不象大家认为的那样,一封闭什么问题都解决了. 老问题走了新问题又来了,而且更麻烦,我要说的是慎用封闭.我极其反对点膜前封闭的做法. 原因为厂家在生产膜时候,各种配方是混合加入原浆的.而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内,必然扰乱了膜内正常的物质分布.由此引发了许多问题,也降低了工作效率. 也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题,其实可以通过其他办法来解决,封闭必然是下测.我经常使用的封闭手法有两种.流动封闭,将作用物质处理在样品垫上.膜上定点封闭,将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上. 该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷头.可以将不合格的半成品大板重新复活.只要是将封闭做在了膜上,就必然会对产品的稳定性造成影响.具体的影响程度要通过稳定性测试来评判.9. 膜的储存刚生产出的膜一般含有5-10%的水分. 关于膜的老化机理,有个理论支持,不过争议比较大. 理论认为:膜的老化是因为膜上的水分蒸发,使膜变得疏水,带电荷并变脆. 储存膜一般要求是避光,密封.过干或过湿都不利.在这种保存条件下,一般可以放置两年. 但是如果膜上做了封闭处理,就要根据具体试验情况来判断了.有些膜由于生产工艺的问题,使用后灵敏度会在一段时间内发生变化,遇到这种问题,就需要在点膜后放置一段时间,待稳定后方可进入调试生产.后序以上便是我在胶体金层析诊断试验中使用硝酸纤维素膜过程中的一些经验.从起笔到结尾花了大约一个月时间,断断续续,终于完成. 也要感谢所有膜生产厂家技术专家在以前的工作接触中给我做过的大量技术培训,其中很多已经成为了经常联系的朋友.由于膜工业是在不断发展的,可能出现新的问题或新的解决办法. 欢迎进行讨论.免疫胶体金稀释液的配伍原则（前面我一个回帖成此文，发现太长了，不发新帖可惜，呵呵）制备好免疫胶体金后，还需要将其稀释到一定浓度，并吸附于特殊的惰性介质中才能够最终制成产品。

免疫胶体金实验报告免疫胶体金技术常见影响因素分析免疫胶体金技术常见影响因素分析自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。

免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。

而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。

1耗材的选择1.1不同型号膜的筛选。

硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。

不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。

膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。

用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。

1.2结合垫的选择。

结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。

1.3样品垫及吸水纸的选择。

样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。

试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。

如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。

硝酸纤维素膜NC膜目录概念NC膜的生产原理NC膜的供应商及现状NC膜的选择膜的质控方式膜的深入探讨和应用技巧NC膜的应用举例概念NC膜的生产原理NC膜的供应商及现状NC膜的选择膜的质控方式膜的深入探讨和应用技巧NC膜的应用举例概念硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。

NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。

NC膜的生产原理匀浆配比购买回来的原料硝酸纤维素粒子是一种非常普遍的有机化学物，溶解形成混浆，在该浆体内，通过加入一定比例的试剂来调整最后形成的膜的性质，一般主要包含表面活性剂/高分子聚合物/盐离子/成型剂等溶解的一个缓冲体系内。

不同的厂家加入的溶液配方不一样，导致了产品的差异。

滚筒铺膜配好的匀浆通过滚筒，形成了一张薄膜，平摊在十分光滑的平面载体上。

过程与造纸非常相似。

成型当匀浆内的成型剂开始挥发，膜逐步干燥成型。

同时在这个过程中由于温度比较高，有些厂家在这个过程采取了在密闭腔体内成型，同时补充配方溶液的形式，来避免一些有效成分的蒸发。

切割通过以上步骤生产出来的膜是呈一个宽度极大的产品，宽度的大小直接和滚筒的大小相关，滚筒越大生产越方便，但设备的成本也越高.宽膜要经过切割才能成为我们购买到的25mm或18mm（或20mm）宽的膜，而长度上，成品卷膜和宽膜的长度是相同的.理论上可以让厂家切成你需要的任意宽度，但这样会造成原料的浪费和人力成本的增加，后来厂商在和试纸生产厂家的协调过程中，综合用料成本和生产便利性基本确定了上面说的宽度，以次为标准。

从生产过程，我们可以得知，NC膜本身已经添加了表面活性剂来改善亲水能力，而且已经存在有一定的缓冲系统（虽然对纸条测试影响不会很大）。

NC膜的供应商及现状现在有销售的NC膜品牌型号如下：PALL(美国)MILLIPORE（美国），M135（有背衬/无背衬两种）M180（有背衬/无背衬两种）WHATMAN and SS，Puraband impurabandSARTORIUS（德国），CN140伊能（国产），8um 6umMDI（印度），8um 6um说到这些供应商，不得不谈谈发展的历史. SS是膜行业的鼻祖，这点所有的膜公司都承认。

文章导读硝酸纤维素是一种白色的聚合物，这种物质其实有很多称呼，比如又被人们称为纤维素硝酸脂，其英文简称是nc，这种化学物质有很多特点，比如被阳光照射之后容易变色，还具有容易燃烧的特点，所以其实硝酸纤维素是一种危险品，平时使用的时候一定要谨慎，下面为大家介绍硝酸纤维素的正确使用方法。

硝酸纤维素膜的应用技巧：1.蛋白与膜的结合原理蛋白与膜的结合原理，已知的结合力包括疏水作用力H键静电作用力等，确切的结合原理并不明确，主要靠假说来支撑.主要有两种假说：1)首先两者靠静电作阻力结合，然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合.2)首先两者靠疏水作用结合，然后靠静电作用来维持长时间结合.两条假说，都表明其结合过程分为两步，首先结合和后面长时间结合.由于结合原理的不明确性，导致在这方面的工作非常依赖实践经验.2.膜对结合的影响1)膜孔径有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜，但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品，如果是不同厂家的产品，这种比较是无意义的.膜孔径与层析速度的关系，已在上文描述.随着膜孔径减小，膜的实际可用表面积递增，膜结合蛋白的量也递增.估量表面积的参数为表面积比率(实际可用表面积与所用膜平面积的比率).另外，膜孔径越小，层析速度也越小，那么金标复合物通过T线的时间也就越长，反应也就越充分.综合以上两点，结论为膜孔径越小灵敏度越高.但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性越高.所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点.2)不同厂家的膜差异这个差异主要来源于两点：1>生产膜时，使用的聚合物和表面活性剂的来源，类型，数量不同.同理，在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响.2>处理过程不同.3.生物原料，缓冲溶液的试剂和配方1)生物原料，作为CT线的生物原料使用情况各异，所以这里只做略述.首先，单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体，主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点，而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别，毫无疑问就增加了优化难度.其次，分子量越大，蛋白越难结合到固相材料上.2)缓冲液大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方，包括缓冲液，封闭液等等处理溶液配方.其实也无法提供给一个万用配方清单.因为不同的反应体系需要不同的配方来支持，而不同机构的反应体系又有差异.想获”鱼”先学”渔”.为了不误导大家，在下面涉及到配方的问题上，仅提供思路，具体配方请自己摸索.缓冲液的构成一般是：PBS(或其他缓冲体系)+作用物质(针对某一特定问题)+PH调整.在参考过以前的各种资料后，个人意见为配方原则为宜简不宜繁，根据自己的需要添加作用物质，原来的很多需要添加的作用物质，由于膜制造技术的改进已经不再需要.推荐的缓冲体系为0.01MPBSPH7-7.2，该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性.作用物质的情况大致罗列如下：少量NACL，减少信号强度，消假阳.有机醇(甲醇，异丙醇等)，润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被.个人不推荐，因制膜工艺改进.表面活动剂(TW20，TX100)，增加亲水力，可避免线条中空现象，也可增色.糖，保护剂，减缓老化速度，也可以增加亲水力同上.调PH到某个位置，可以消假阳.4.点样环境环境湿度对点膜过程非常重要.最佳湿度一般在45-65%.。

猪瘟抗体快速检测试剂盒——（胶体金法）使用说明书一、原理：本试纸采用酶联免疫原理和胶体金层析技术制成快速检测猪血清中的猪瘟抗体。

将猪瘟抗原包被在硝酸纤维素膜的检测线（T）上，兔抗猪瘟抗体包被在硝酸纤维素膜的质控线（C）上，用胶体金标记的猪瘟抗原干燥后置于玻璃纤维素膜下端。

当血清加入加样孔内，由于层析的原理，血清开始沿纸条移动，当遇上干燥的金标抗原，将其溶解，并带着金标抗原继续往上移动，至硝酸纤维素膜的检测线。

如果样品中有猪瘟抗体存在时，会与玻璃纤维素上的金标猪瘟抗原和包被在检测线上的猪瘟抗原，在检测上形成一个夹心的免疫复合物，呈一条紫红色线。

样品中的抗体越高，色线颜色越深，判定为阳性。

如果样品中没有猪瘟抗体，检测线（T）线上没有色带出现，判定为阴性。

样品和金标抗原继续往上移至质控线时，此处的兔抗猪瘟抗体将会同金标猪瘟抗原结合，在质控线（C）上形成一条紫红色线，证明本试纸有效。

整个试验仅需20分钟。

操作简便、快速、准确、灵敏度高，直观、结果容易判定。

二．产品组成：1、检测卡(1个)：由一特制的塑料检测卡将猪瘟抗体检测试纸条夹于卡内，卡面上设有加样孔和观察孔。

加样孔作为加入待检血清，观察孔内为试剂检测线（T），试剂质控线（C）。

一个检测试剂卡用一个铝箔袋包装，内装干燥剂。

2、吸样管1个；3、5份塑料手套；4、使用说明书一份。

三．操作方法：1．用1.5ml样品管，采血0.5~1ml待检测血清自然析出或用离心机离心10分钟左右，使血清析出。

2．将检测卡平置于桌面上，用吸样管吸取被检血清，在检测卡的椭圆形加样孔内加入2滴约80~100ul。

在室温下反应20分钟判定结果。

（检测卡如在4℃保存，必须恢复至室温后方可进行检测）四．结果判断：1．阳性：在检测线（T）处，质控线（C）处，各出现一条紫红色条带，判定为阳性；检测线（T）处条带色泽的深浅，依检测样品中猪瘟抗体效价的高低而变化，效价越高色带越深，反之越浅。

氯霉素胶体金免疫层析试纸条的技术报告1 胶体金的制备1.1玻璃器皿的准备玻璃器皿表面的少量污染会干扰金颗粒的生成，一切玻璃容器应绝对清洁，用前经过酸洗，硅化。

硅化过程一般是将玻璃容器浸泡于含5％二氯二甲硅烷的氯仿溶液中1min，室温干燥后蒸馏水冲洗，再干燥备用。

专用的玻璃器皿以第一次生成的胶体金稳定其表面，弃去后以双蒸馏水淋洗，可代替硅化处理。

将玻璃器皿用酸液浸泡72小时后，取出，大量自来水冲洗，洗洁精洗涤，蒸馏水浸泡24h后用去离子水冲洗三次，37℃温箱烘干后备用。

1.2柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液在胶体金免疫层析试验中，检测信号是由于金颗粒在检测线或质控线上聚集而成，所以如果金颗粒太小就不能产生足够的颜色信号，如果太大又会遇到空间位阻问题。

空间位阻可以阻止小分子蛋白质接近金颗粒的zeta电位，例如IgG分子(160 000 Daltons)大约8nm，约有4nm可以与金颗粒的表面结合，其最适的标记金颗粒为40nm，而对小分子抗原来说，可以使用20nm的胶体金颗粒进行标记。

取0.01％氯金酸水溶液100ml用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌的情况下加入1％柠檬酸三钠水溶液1.5ml，继续搅拌加热40min，溶液呈透亮的红色。

室温冷却，用去离子水恢复到原体积，4℃保存。

1.3 胶体金的质量鉴定1.3.1 肉眼观察用肉眼观察制备的胶体金，其颜色为酒红色、均匀度较好无杂质、透明度较高。

1.3.2 紫外扫描鉴定取冷却后的胶体金溶液进行400～600nm紫外扫描，确定最大吸收峰波长，观察最大吸收峰的峰形、峰宽。

紫外扫描的最大吸收峰波长为530nm，根据回归方程Y= 0. 4271X + 514. 56计算得到胶体金颗粒粒径为36.2nm。

由图谱可以看出最大吸收峰的峰宽较小,说明胶体金颗粒分布比较均匀。

1.3.3 透射电镜鉴定透射电镜下观察胶体金颗粒的大小是否均匀一致，有无椭圆形及多角形。

拍片放大后测量胶体金颗粒直径大小，取多个点计算胶体金颗粒的平均直径。

(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201610066693.3(22)申请日 2016.02.01G01N 33/531(2006.01)(71)申请人苏州东尼生物技术有限公司地址215300 江苏省苏州市昆山市开发区中小型企业园风琴路108号5号房(72)发明人王峰 王玉立 卜天(54)发明名称一种应用于胶体金免疫层析的硝酸纤维素膜预处理方法(57)摘要本发明公开了一种应用于胶体金免疫层析的硝酸纤维素膜预处理方法，该方法这一次包括如下步骤：1、硝酸纤维素膜与背衬、PVC 板粘在一起；2、粘好的硝酸纤维素膜放入鼓风干燥箱20°C-37°C 干燥4-10小时；3、干燥后的硝酸纤维素膜放在温度为18℃-28℃，湿度60%-70%状态下，避光平衡1-2小时；4、点膜，本发明硝酸纤维素酶预处理方法一方面提高点膜线的质量，另一方面又产品的重复性和批间差。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页CN 105606796 A 2016.05.25C N 105606796A1.一种应用于胶体金免疫层析的硝酸纤维素膜预处理方法，其特征在于：依次包括如下步骤：粘膜：硝酸纤维素膜与背衬、PVC板粘在一起； (2) 干燥：粘好的硝酸纤维素膜放入鼓风干燥箱中干燥； (3) 平衡； (4) 点膜。

2.根据权利要求l所述的一种应用于胶体金免疫层析的硝酸纤维素膜预处理方法，其特征在于：所述的干燥条件为鼓风干燥机中，温度为20℃-37℃，干燥时间为4-10分钟。

3.根据权利要求1所述的一种应用于胶体金免疫层析的硝酸纤维素膜预处理方法，其特征在于：所述的平衡条件为：避光或者红光条件，温度为18℃-28℃，湿度为60%-70%，平衡时间为1-2小时。

4.根据权利要求l所述的一种应用于胶体金免疫层析的硝酸纤维素膜预处理方法，其特征在于：所述的点膜可以用连续点膜机、台式点膜机设备点膜。