表达产物的分离纯化

人胰岛素的酵母表达与纯化1.项目意义作为治疗糖尿病的主要药物，胰岛素用于临床已有70多年，是临床上用量最大的蛋白质类药物，重组DNA技术出现，胰岛素是最表达的哺乳动物蛋白之一。

旨在改善现有商品。

胰岛素治疗学性能的研究，是胰岛素是胰岛素蛋白工程的主要内容。

现已知现已知各种胰岛素类物愈300多种，但具有临床前景的不多。

在天然突变胰岛素原有的基础上曾用化合方法合成人工人胰岛素，发现其活力高于天然胰岛素。

这也是通过改变氨基酸残基获得的高活力胰岛素，但有关重组胰岛素对其对其性质研究不够系统。

可以先利用猪腰素前体在酵母中分泌表达，表达产物的分离纯化，进而由纯化的表达产物通过酶促转酞获得人胰岛素以及人胰岛素的酵母蛋白。

2.相关研究进展酵母菌与人类的关系源远流长，早在八千年，人们就用酵母菌来制作面包、酿造葡萄酒、啤酒和清酒等。

到20世纪末酵母菌以作为一种模式生物在生物化学、遗传学和分子生物学研究等方面担任了重要的角色。

自从1978年建立酵母菌遗传转化技术以来，酵母菌已成为生产异源蛋白及其生物学分析方面最有用的真核微生物。

酵母菌的生物学研究取得了巨大的进展，1996年完成了酵母菌全基因组的序列测定，已建立了相关基因库，如啤酒酵母基因库，酵母蛋白组数据库，这些数据库容纳了有关酵母菌的6000多个基因及其蛋白质功能、结构和相互间的关系等大量信息。

现在已有不少用于食品和酿造工业的遗传修饰酵母工程菌问世。

早期关于胰岛素的研究是从猪、牛、羊的胰腺中提取的相关产品，直到1936年才利用重结晶法再锌离子的存在下得到了纯化的胰岛素结晶，而胰岛素纯化的真正历史性突破是1960年色谱技术出现以后，使纯度的单一胰岛素分子制成为可能。

1965年我国科学家首次完成了牛结晶的合成胰岛素，20世纪70年代丹麦首次产出半合成胰岛素。

1982年美国首先利用重组DNA技术合成了人胰岛素，标志着生物工程胰岛素产品时代开始。

1996年美国通过胰岛素化学结构进行了改造和修饰有开发出了第一个胰岛素类似物。

重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化一、本文概述本文旨在探讨重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达及其后续的分离纯化过程。

胰岛素作为一种关键的激素，在调节血糖水平中发挥着至关重要的作用。

然而，天然胰岛素的来源有限，且提取成本高昂，因此，通过基因工程技术在大肠杆菌中生产重组人胰岛素成为了一种可行且经济的替代方案。

本文首先介绍了重组人胰岛素的基因克隆和在大肠杆菌中的表达策略，然后详细阐述了胰岛素的分离纯化过程，包括细胞的破碎、蛋白质的提取、层析分离以及胰岛素的纯化等步骤。

本文还讨论了影响胰岛素表达及纯化的关键因素，并提出了优化表达及纯化条件的策略，以期提高重组人胰岛素的产量和纯度，为糖尿病治疗提供更为可靠和经济的药物来源。

二、重组人胰岛素的基因克隆与表达重组人胰岛素在大肠杆菌中的表达首先依赖于对胰岛素基因的克隆。

基因克隆是生物技术中一项重要的技术，它涉及到从基因组DNA或cDNA中分离出特定的基因，然后将其插入到适当的载体中，以便在大肠杆菌等宿主细胞中进行复制和表达。

目的基因的获取：需要从人源的cDNA文库或基因组DNA中扩增出胰岛素的编码序列。

这通常通过PCR技术实现，需要设计一对特定的引物，它们能够与人胰岛素基因的两端互补结合。

载体的选择：为了在大肠杆菌中表达人胰岛素，需要选择一个合适的表达载体。

常用的载体包括质粒和噬菌体。

这些载体通常含有启动子、终止子、复制原点和选择标记等元件，以确保目的基因在宿主细胞中的高效表达。

基因的克隆：将目的基因与载体连接后，通过转化技术将重组质粒导入大肠杆菌感受态细胞中。

在适当的选择压力下，例如抗生素抗性，只有成功导入重组质粒的细胞才能生长，从而实现了对胰岛素基因的克隆。

表达条件的优化：在大肠杆菌中表达人胰岛素时，需要优化表达条件以获得最高的表达量。

这包括选择合适的培养基、调整培养温度、pH值以及诱导剂的浓度等。

表达产物的分析：通过SDS-PAGE、Western Blot等技术，可以对表达产物进行定性和定量分析，以确认胰岛素基因在大肠杆菌中的成功表达。

一、为检测表达产物在E.coli BL21(DE3)胞质中是以可溶性物质还是以包涵体形式存在，我们采用下面的方法：（1）收集菌液，10，000×g，4℃，离心5min；1×PBS漂洗后离心收集沉淀。

（2）加入1×PBS，pH8.0（含有2%Triton X-100），振荡混匀后加入溶菌酶，在4℃反应30min。

（3）菌体用超声破碎仪作用10min，随后在10，000×g，离心10min。

（4）上清（胞质中的可溶性物质）和沉淀（包涵体沉淀）分别进行SDS-PAGE 电泳分析。

二、如果表达产物带有His标签，并且以不可溶性的包涵体形式存在于细胞中，所以我们采用Ni-NTA，在变性条件下进行分离纯化，具体过程如下：（1）3 ml菌体超声破碎后，收集包涵体沉淀。

加入200µl Buffer B，0.5μl β–巯基乙醇和4μl咪唑（终浓度为20mM）。

轻微混匀后，在室温放置1h，使包涵体充分溶解。

（2）12，000×g，离心10min，上清置于新的离心管中备用。

（3）取50μl 混合50%酒精的Ni-NTA，轻微离心后，吸去上清，Ni-NTA用等量的Buffer B洗涤两次。

（4）把包涵体破碎后的上清，加入到Ni-NTA中，室温轻微混匀30min。

（5）12，000×g，离心10sec沉淀Ni-NTA，去上清。

（6）在Ni-NTA中加入250μl Buffer C，和5μl咪唑（终浓度为20mM），轻微混匀后，12，000×g，离心10sec，去上清。

重复一次。

（7）加入25μl Buffer E，和5μl咪唑（终浓度为160mM），12，000×g，离心10sec，上清为含重组蛋白的洗脱液E。

重复三次。

（8）SDS-PAGE分析鉴定表达产物的分离纯化情况。

三、如果表达产物带His标签，并且都以可溶性的形式存在于细胞质中，所以我们采用Ni-NTA，在非变性条件下进行分离纯化。

生物技术制药试题1. 生物技术制药:生物技术制药是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。

2. 基因表达:基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子.生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。

3. 质粒的分裂不稳定:通常将质粒不稳定性分为两类:一类是结构不稳定性,也就是质粒由于碱基突变、缺失、插入等引起的遗传信息变化;另一类是分离不稳定性,指在细胞分裂过程中质粒不能分配到子代细胞中,从而使部分子代细胞不带质粒(即P-细胞)。

在连续和分批培养过程中均能观察到此两类现象发生。

一般情况下具有质粒的细胞(即P＋细胞)需要合成较多的DNA、RNA和蛋白质,因此其比生长速率低于P-细胞,从而P-细胞一旦形成能较快速地生长繁殖并占据培养物中的大多数。

4. 补料分批培养:发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。

它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。

因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。

但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。

5. 人-鼠嵌合抗体:嵌合抗体（ chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。

它是由鼠源性抗体的 V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。

因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。

6. 悬浮培养:非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。

重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。

本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。

关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。

据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。

由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。

纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。

但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。

与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。

目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。

重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。

因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。

90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。

本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。

1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。

重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法重组门冬酰胺酶ⅱ的表达纯化与分析[导言]左旋门冬酰胺酶(lasparaginase,lsp)是淋巴系统恶性肿瘤化疗方案中的一个很主要的药物,应用日趋广泛。

然而,lsp可产生多种毒副作用,包括急性胰腺炎、药物性糖尿病、过敏反应、凝血功能障碍、肝功能损害等,在一定程度上限制了lsp的临床应用,尤其对于曾出现上述不良反应的患儿的后续治疗还能不能再用lsp,就成为一个急需解决的问题。

目前国内所有化学治疗中应用的ecii主要是依赖进口,完成表达ecii的基因工程菌株构建,并逐步进行ecii的工业化生产,对于国内all的临床化疗有积极意义。

为此,我们克隆了ecii的基因,在大肠杆菌中获得了高效表达,并探讨了其突变复性及后续纯化的简便方法。

国内亦开展了类似的工作。

[目的要求]1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。

2.掌握工程菌发酵培养、酶蛋白重组天冬酰胺酶II分泌表达、表达酶蛋白制备、酶活性测定、SDS-PAGE电泳鉴定的工作原理和技术方法。

【实验原理】利用微生物，尤其是大肠杆菌生产L-天冬酰胺酶的研究已经非常广泛和深入。

大肠杆菌可产生两种天冬酰胺酶，即L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，分别由其染色体上的基因ansa和ansB编码。

只有L-天冬酰胺酶II具有抗肿瘤活性。

L-天冬酰胺酶II在美国、德国和日本销售。

中国天津生化厂于1974年投入运行，随后因菌株降解和产量下降而停产。

目前，国内药品都是进口的。

1995年，我院构建了一株高效分泌和表达L-天冬酰胺酶II的基因工程菌株。

在大肠杆菌细胞中合成重组L-天冬酰胺酶II（RL ASP II）并分泌到周质中。

表达的RL-ASP的相对分子量ⅱ 其最大紫外吸收值为278nm。

本实验以此工程菌为材料采用蔗糖溶液渗透振扰提取法和酶解法联用提取周质中的rl-aspⅱ，再用硫酸铵分级沉淀、deae-52阴离子纤维素交换层析等步骤提取和纯化，得到较高纯度表达产物rl-aspⅱ。