胚胎干细胞的研究进展及其应用学习教材PPT课件

1. ES细胞的研究概况
2.1ES细胞的形态学特征 ES细胞核大，胞质胞浆少，细胞界限不明 显。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生 长，边缘折光性强，集落边缘可见有少量的已 经分化为扁平上皮细胞或梭形的成纤维细胞。 用碱性磷酸酶染色法染色，ES细胞呈棕红色， 而周围的成纤维细胞则呈淡黄色[7]。小鼠胚胎 干细胞的直径在7-18um之间，猪、牛和羊的ES 细胞颜色较深，直径为12-18um[8]。总的来说， ES细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征。
3.2.2早期胚胎及PGCs的选择和分离 以下早期胚胎都可以作为建立胚胎干细胞系 的材料：小鼠的桑椹胚（2日龄），囊胚（3日龄） 和延迟囊胚（4-6日龄）；猪的囊胚（7-10日龄）； 绵羊的囊胚（7-9日龄）；山羊的囊胚（7-8日 龄）；牛的桑椹胚（6-7日龄），囊胚（7-8）日 龄；兔的囊胚（4-5日龄）；水貂的囊胚（8-10日 龄）；仓鼠的囊胚（3日龄）。
2.2 ES细胞的基本特征 2.2.1全能性 ES细胞的全能性（totipotenty），是指ES细胞在解除分化 抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力， 即ES细胞发育成完整动物体的能力。其实质是细胞基因组中 决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依此表达。ES 细胞是能在体外大量增殖的全能性细胞，可以为细胞的遗传操 作和细胞分化研究提供丰富的实验材料。ES细胞全能性的检 测方法是以胚胎干细胞进行细胞核移植。如果ES细胞能和去 核的细胞融合发育成重构胚，而且经过胚胎移植，重构胚能发 育形成个体，则表明ES细胞具有全能性。例如，Campkell将绵 羊的类ES细胞注射到去核卵母细胞中，获得重构。重构胚经 过胚胎移植，有活的羔羊产生，证明了绵羊用骨髓基质细胞或其条件培养液，可诱导ES细胞在体 外分化为造血干细胞（transforming growth factor B，TGF-B） 的ES细胞，在维甲酸（RA）培养液经悬滴培养形成抑胚体， 再继续贴壁培养，可见拟胚体周围有许多由内皮细胞排列而 成的辐射状血管样结构；ES细胞在RA与双丁酰基环腺苷磷酸 （dibutyryl cyclic adenosine monohosphate dBcAmp）共同作 用下，可以分化为神经胶质细胞；在RA诱导下，ES细胞可分 化为肌细胞；ES或EG细胞经悬滴培养形成的拟胚体在二甲基 亚砜（DMSO）、胰岛素，三碘腺原氨酸（triiodofhgronine）、 胎牛血清或维甲酸（RA）的共同作用下可分化为脂肪细胞； ROSAB-geo基因传染的ES细胞在缺乏G418、含有10%小牛血 清，1umol/L低塞米松（dexamethason）条件下可以分化成软 骨细胞[10]。
3. ES细胞系的建立概况及建 系的技术要点：
3.1 ES细胞系的建立概况 迄今为止，小鼠与人的ES细胞系已经成功建立， 其他动物如仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊的类ES 细胞系也相继建立，在牛、兔上还得到了转基因嵌合 体动物[12]。 3.2 ES细胞建系的技术要点 ES细胞建系的原理是将早期胚胎（桑椹胚或囊 胚）或者是用外科手术法得到的内细胞团（Inner cell mass，ICM）或者原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）与分化抑制物共同培养，使之增值而 又保持未分化状态，这样代代相传，从而使数量有限 的胚胎或者PGCs细胞能够成千上万倍地克隆。其建 系的基本技术要点如下：
3.2.3早期胚胎及PGCS的培养和ES细胞的分离传代 将早期胚胎或PGCs置于饲养层或条件培养基上，在5%CO2、 37~39℃条件下进行培养。培养液一般为DMEM+15%胎牛血 清（FCS）。培养液中可添加多种细胞因子或分化抑制物， 如分化抑制因子（LIF）、表皮生长因子（EGF）、胰岛素样 生长因子（IGF）、β—硫基乙醇（mercaptoe thanol）等。 进行体外培养时，当胚胎内细胞团ICM增殖后或PGCS出现ES样 克隆后即可传代。ES细胞的增殖速度很快，小鼠ES细胞每7-8 小时倍增一次，猪类ES细胞每20小时倍增一次，羊类ES细胞， 每40-50小时倍增一次，牛类ES细胞每18-24小时倍增一次14。 传代时一般是用胰酶EDTA消化，在用微吸管或拨针将其打散 成单个细胞，然后移入新的饲养层上，进行培养几天后，即 可出现新的克隆点，在其分化之前可以再进行传代。
3.2.1饲养层的制备及分化抑制物的选择 常用的饲养层是由小鼠成纤维细胞无限系（STO） 或小鼠原始胚胎成纤维细胞（PMEF）制备而成， STO或PMEF经过丝裂霉素C等有丝分裂抑制剂处理 后，与早期胚胎或PGCs共同培养后，ES细胞就可 以分离出来了。STO和PMEF细胞可以分泌成纤维 细胞生长因子FGF（fibroblast growth factor）、分 化抑制因子LIF(leukemiain hibitory factor)，这些因 子有助于ES细胞增值，而且能抑制细胞的凋亡和分 化。此外，也可以用绵羊、山羊的输卵管或子宫上 皮、牛的颗粒细胞、子宫成纤维细胞等作为分化抑 制培养基[13]。
胚胎干细胞的研究进展及其应用
胚胎干细胞（Embryonic stem cells， ES细胞）是一种从早期胚胎内细胞团 （Inner cell mass，ICM）或原始生殖细 胞（primordial germ cells，PGCs）经体 外分化、抑制培养、分离和克隆得到的 具有发育全能性的细胞。目前，ES细胞 已经引起广大学者的注意和兴趣，对ES 细胞的研究也取得了很大进展。
2.2.2 多能性 多能性（Pluripotency）是指ES细胞具有发育成多种 组织的能力，参与部分组织的形成。细胞多能性检测的 方法很多，主要有：1.体外培养诱导分化试验 将ES细胞 培养在不含分化抑制物的培养基上，可以形成类胚体 （Embryoid bodies）。2.将ES细胞在特定培养基进行培 养，定向分化成特定组织。例如，在含有白血病抑制因 子（LIF）和维生素A酸（RA）的培养基可以分化形成体 壁内胚层。3.将ES细胞悬液（1-2×107个/ml）注射入同 原动物皮下，形成组织瘤，可以形成内胚层，中胚层， 外胚层。4.胚胎嵌合法，将ES细胞与胚胎细胞共同培养 或者将ES细胞注射入囊胚腔中，ES细胞就会参与多种组 织发育。如Kaufman首次用小鼠ES与囊胚嵌合，获得了第 一个生殖腺嵌合体小鼠，表明ES细胞具有发育多能性。