BSA与CTAB相互作用的荧光光谱研究

BSA与CTAB相互作用的荧光光谱研究

涂逢樟;俞芸;上官昌汾

【摘 要】在模拟生理条件下,用荧光光谱法研究了十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.结果表明:BSA分子中色氨酸和酪氨酸残基具有荧光发射性质,以280 nm激发BSA,在341 nm处有很强的荧光发射.在加入CTAB后,发现CTAB-BSA强荧光峰的位置蓝移,且荧光强度随着CTAB浓度的增大而明显减弱,说明CTAB对BSA有荧光猝灭现象,猝灭以静态猝灭为主,由Stern-Volmer方程求得CTAB表观猝灭常数Kq=1.469×1013 L·mol-1·s-1.得到了CTAB与牛血清白蛋白分子间的结合常数和热力学参数.利用已有的计算方法,建立了相应的计算机程序,使计算结果更合理.通过与常见公式计算的结果进行比较,所建立的方法得到了比较满意的结果.

【期刊名称】《广州化工》

【年(卷),期】2013(041)024

【总页数】4页(P55-58)

【关键词】荧光光谱;牛血清白蛋白;十六烷基三甲基溴化铵;相互作用

【作 者】涂逢樟;俞芸;上官昌汾

【作者单位】龙岩学院化学与材料学院,福建龙岩364000;龙岩学院化学与材料学院,福建龙岩364000;龙岩学院化学与材料学院,福建龙岩364000

【正文语种】中 文

【中图分类】O616

在医学研究上，测定血清蛋白量及质的改变，可对疾病的诊断、疗效的观察提供有价值的资料及数据。同时，在生命科学和化学的研究中，需要了解各种类型的蛋白质的结构性能、形态、与其它的物质的结合形式以及反应机理等方面的信息［1］。牛血清蛋白(bovine serum albumins，BSA)是常用的研究蛋白，因为它是血浆中含量最丰富的载体蛋白，能与体内许多内源性物质及外源性物质作用，且这类蛋白的结构己用X 光测定［2］。

表面活性剂开发半个多世纪以来，作为洗涤剂大量使用。使用初期就发现对皮肤产生明显的刺激作用，后来逐步认识到在接触过程中对人体安全性的潜在危险［3］。而表面活性剂引起的皮肤刺激跟表面活性剂与角质层蛋白间的相互作用有关。因此，表面活性剂与蛋白质的相互作用在工业、生物、食品、医药和化妆品等行业中具有重要意义［4］。而溴化十六烷基三甲基铵(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)是人们经常研究的一种阳离子表面活性剂［5－7］，故选其作为表面活性剂来研究表面活性剂与蛋白质的相互作用。本文用荧光光谱法来研究CTAB 对BSA 的结构影响，获得有关CTAB 与BSA 相互作用的结合常数、结合热力学参数及荧光猝灭机理，旨在从分子水平上阐明CTAB 与BSA 作用的驱动力。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RF－5301PC 型荧光光谱仪，日本岛津公司;TU－1901 双光束紫外可见分光光度计，普析通用仪器有限责任公司(北京);pHS－3C 数字酸度计，杭州东兴设备仪器厂;DK－ S22型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司;微量进样器，日本岛津公司。

牛血清白蛋白，厦门鹭隆生物公司，Sigma 分装;十六烷基三甲基溴化铵(分析纯)，汕头西陇化工厂;磷酸氢钠、磷酸二氢钠、盐酸、氯化钠及氢氧化钠等其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

称取68 mg 牛血清白蛋白，溶于50 mL 二次蒸馏水中，配成浓度为2.0 ×10 －5mol/L 的储备液，置于4 ℃冰箱中保存。

称取9.1 mg CTAB，加入少量重蒸乙醇预溶解，移入50 mL 容量瓶中，用重蒸水稀释至刻度，即得浓度为5.0 ×10 －4mol/L CTAB 溶液。

准确移取9.60 mL 浓度为0.067 mol/L NaH2PO4溶液和准确移取40.40 mL 浓度为0.067 mol/L Na2HPO4溶液，两者混合均匀即得50.00 mL pH 7.40 等渗磷酸盐缓冲溶液(PBS)。

1.2 实验过程

移取50 μL 浓度为2 ×10 －5 mol/L 的BSA 于1 cm 石英吸收池中，加入2.45

mL pH7.40 等渗磷酸盐缓冲液(PBS)。用微量进样器进行荧光滴定，每次加入1～5 μL CTAB 溶液。混合均匀并静置15 min 后，以280 nm 为激发波长(入射和发射狭缝分别为3 和5 nm)，在荧光光度计上记录290～450 nm 波长范围内的发射光谱。

2 结果与讨论

2.1 CTAB 对BSA 的荧光猝灭作用

图1 给出了CTAB 浓度对BSA 荧光光谱的影响，可见随着CTAB 浓度的增加，BSA 在341 nm 处荧光发射峰强度明显减弱，而且峰位发生明显的蓝移，表明色氨酸疏水性增强［8］。CTMAB的作用位点位于血清白蛋白亚域ⅡA 和ⅢA 的疏水腔中，而位于亚结构域ⅡA 的色氨酸残基，其荧光强度易受小分子配体的影响。因此，将CTMAB 加入到BSA 后，荧光强度明显降低。随着CTAB 浓度的增加，BSA 中的位点渐渐“饱和”，导致溶液中的荧光猝灭渐趋“饱和”。实验表明，当CCTAB∶CBSA≥20∶1后，CTAB 基本不再具有进一步的猝灭作用，如图1 中曲线h和曲线i 所示。 图1 CTAB 浓度对BSA 荧光光谱的影响Fig.1 The fluorescence quenching

spectra of CTAB－BSA

除静态和动态猝灭外，引起物质荧光强度降低的原因还有“内滤光效应”。Steiner 等［9－10］提出，如果吸收值不超过0.3时，内滤光效应可用如下公式进行校正:

式中:Fcorr和Fobs——校正后和观察到的荧光强度

Aex和Aem——药物在激发和发射波长处的吸光度

本文采用式(1)对内滤光予以校正。

2.2 猝灭类型和机理

小分子对蛋白质荧光的猝灭主要分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭的作用过程遵循Stern－Volmer 方程［11－12］:

式中:F0和F——不存在和存在猝灭剂时BSA 的荧光强度

Ksv——动态猝灭常数

kq——双分子猝灭过程速率常数

τ0——无猝灭剂存在下荧光分子的平均寿命，生物大分子荧光寿命约为10 －8 s［13］

［Q］——猝灭剂的浓度

由猝灭曲线的斜率即可求得猝灭常数，CTAB 的猝灭常数及线性相关系数r 列于表1。各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为2.0 ×1010 L·mol －1·s

－1［14］，显然CTAB对BSA 猝灭过程的速率常数(1.105～1.469×1013 L·mol－1·s－1)远大于扩散控制的kq，可见猝灭不是由动态碰撞引起的，而是由于形成了不发荧光的化合物引起的静态猝灭。 同时，动态猝灭和静态猝灭可以通过猝灭常数随温度的变化来区分。如果温度越高，导致猝灭常数越大，就说明碰撞分子数越大，是动态猝灭，反之则是静态猝灭［15］。从表1 数据可知，随着温度的升高，Ksv减小，这也佐证CTAB 对BSA

荧光的猝灭应该属于静态猝灭。

表1 不同温度下猝灭常数及相关系数rTable 1 Correlation coefficients r，Ksvand kqat different temperatures

2.3 结合常数计算

当荧光物质与猝灭体之间形成不发荧光的复合物时，可利用许多公式，如L

ineweaver－Burk 方程［式(3)］［16］、Scatchard方程［式(4)］［17］、对数方程［式(5)］［18］、改进的Scatchard 方程［式(6)和式(7)］［19］及Rosenthanl 方程［式(8)］［20］等来计算此相互作用的结合常数和结合位点数。

式中:n 和Ka——结合位点数和结合常数

r——平均结合数，即为平均每摩尔大分子结合CTAB 小分子的量

［Qt］和［Bt］——体系中CTAB 和BSA 的总浓度

［Qf］——游离CTAB 浓度

除式(6)和式(8)外，其余方程式都是应用游离CTAB 的浓度计算结合参数的。由于实验过程中很难获得游离CTAB 的浓度，用总的CTAB 浓度代替游离的CTAB 浓度又必然会影响计算结果的准确性。鉴于此，推导了生物大分子和小分子相互作用的关系式［21］:

此方法虽然可利用总浓度直接计算，减少误差，但计算步骤复杂。孙艳涛等［22］利用自编程序进行计算，不仅使计算结果更加合理，而且简化了计算过程。首先将nlg{［Qt］－ n［Bt］(F0－ F)/F0}括弧内的n 假设为1，以lg［(F0－ F)/F］对lg{［Qt］－［Bt］(F0－F)/F0}作图，由该曲线的斜率可以得到括弧外的n 值，如果结合位点n 不等于1，那么就将括弧外的n值重新带入到方程式(9)中的括弧内，无限循环下去，直到括弧内外的n 相同。根据lg［(F0－F)/F］和lg{［Qt］－n［Bt］(F0－F)/F0}的曲线截距，进而可以得到Ka值。常见的计算公式及本文所用方法所得的结果列于表2。表3 为利用计算机程序时的具体计算方法。

表2 不同温度下BSA 与CTAB 的结合常数和位点数Table 2 Binding constants

and sites of BSA with the drugs at 292 K and 300 K

表3 利用计算机程序计算BSA 与CTAB 的结合常数和位点数Table 3

Calculating program for binding constants and sites based on Eq.(9)

2.4 作用类型

小分子和蛋白质等生物大分子之间的结合力主要有疏水作用力、氢键作用力、范德华力和静电引力等。不同物质与蛋白质结合力的类型是不同的，根据反应前后热力学焓变ΔH 和熵变ΔS 的相对大小，可以判断小分子与蛋白质之间的主要作用力类型［14］。ΔH ＞0，ΔS ＞0 为疏水作用力;ΔS ＜0，ΔH ＜0 为氢键和范德华力;ΔH ＜0，ΔS ＞0 为静电引力。

当温度变化不大时，反应的ΔH 可以看作一个常数。根据得到的不同温度下的结合常数及以下各式可得到热力学参数。

式中:ΔH——焓变

ΔS——熵变

ΔG——自由能变

T——热力学温度

R——大气压常数

T1和T2——两个状态下的热力学温度 Ka1和Ka2——不同温度下的结合常数

CTAB 与BSA 结合后的ΔH，ΔS 及ΔG 的求算结果如表4 所示。从表4 可见，CTAB 与BSA 的结合是一个自发过程(ΔG ＜0);CTAB 与BSA 结合的ΔH ＜0，ΔS

＜0，可以认为CTAB 与BSA 分子间主要表现为氢键和范德华力。

表4 不同温度下BSA 与CTAB 结合后的热力学常数Table 4 Thermodynamic

parameters of binding for BSA and CTAB at 292 K and 300 K

3 结论

研究了不同温度下CTAB 溶液与BSA 作用的荧光猝灭光谱，证实了CTAB 与BSA

间的相互作用导致的荧光猝灭为静态猝灭。比较多个计算结合常数和结合位点公式，结果表明，本文根据计算机程序方法所得结果比用总浓度代替游离猝灭剂浓度的计算方法更合理。同时得到的热力学参数，证明CTAB 与BSA 之间主要靠氢键和范德华力结合。