荧光光谱法研究尼麦角林与牛血清白蛋白的相互作用

第４０卷第４期　１　西南民族大学学报・自然　学版　ＪｕｌＪｏｕｒｎａ　ｏｆＳｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｆｏｒ　Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ　２０１４　１　－　

ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００３－４２７１．２０１４．０４．０７　

荧光光谱法研究尼麦角林与牛血清白蛋白　

的相互作用　

陈佰灵，仇丽颖，李婧，ｙｌＪＵ￣，郭芷含，赵志刚　

（西南民族大学化学与环境保护工程学院，四川成都６１００４１）　

摘要：目的：模拟正常人体生理条件下，采用荧光光谱技术研究尼麦角林与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）相互作用的机制．方　

法：通过荧光光谱法确定尼麦角林对ＢＳＡ荧光淬灭的机制，采用Ｓｔｅｒｎ—ｖｏｌｍｅｒ方程和Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ．Ｂｕｒｋ双倒数方程计算　

反应的猝灭常数和形成常数，采用双对数方程计算两者结合常数和结合位点数，热力学公式计算反应前后焓变和熵变　

确定两者结合的主要作用力类型．结果：尼麦角林在０．２５ｘ１０一～２．２５ｘ１０～ｍｏｌ－Ｌ。浓度范围内，对ＢＳＡ的内源荧光有较强　

的淬灭作用，淬灭类型属于静态荧光淬灭．在温度２５￣Ｃ和３７￣Ｃ时，尼麦角林与ＢＳＡ的结合常数分别为３．４９９ｘ１０　Ｌ・ｔｏｏｌ　

和５．２１３×１０　Ｌ．ｍｏｌ。。，结合位点数分别为１．２１和１．２５．由热力学参数焓变（ＡＨ＝Ｉ１．０５　ＫＪ・ｍｏｌ０）ｋＳ－零和熵变（ＡＳ＝７４．８７　

Ｊ・ｍｏｌ～・Ｋ　）ｋ－Ｉ－零，确定尼麦角林与ＢＳＡ之间的作用力以疏水作用力为主．结论：尼麦角林与ＢＳＡ通过疏水作用形成　

复合物，经静态猝灭机制引起ＢＳＡ内源性荧光猝灭．　

关键词：　尼麦角林：牛血清白蛋白；荧光光谱法　

中图分类号：Ｒ９１７　文献标识码：Ａ　文章编号：１００３．４２７１ｆ２０１４）０４．０５０９．０５　

尼麦角林（Ｎｉｃｅｒｇｏｌｉｎｅ），化学名为１０ｃｚ一甲氧基一１，６一二甲基麦角林－８ｐ一甲醇基－５．溴烟酸酯，具有较强　

的０ｃ受体阻滞作用、扩张血管、抑制血小板聚集和抗血栓作用，能加强脑部新陈代谢和神经递质转化，增加血氧　

和葡萄糖的摄取及利用，临床上已成为阿尔茨海默症、血管性痴呆、脑血管疾病、周围血管疾病以及前庭中枢　

性平衡障碍等多种疾病的经典用药　。Ｊ．血浆中的白蛋白具有转运功能，药物与白蛋白结合后不能跨膜转运，起　

到药物储库作用，因此药物与白蛋白结合能力的高低，直接影响其临床疗效，但尼麦角林是否能与白蛋白相互　

作用的研究尚未见报道．本文选择了与人血白蛋白具有高度同源性的牛血清白蛋白（ＢＳＡ），采用荧光光谱法研　

究尼麦角林与ＢＳＡ相互作用的特征，该结果可为探讨尼麦角林在体内的转运、分配和代谢过程提供部分实验数　

据和理论依据，也为临床合理用药提供一定的参考．　

１　实验部分　

１．１仪器与试剂　

ＣＡＲＹ　Ｅｃｌｉｐｓｅ荧光分光光度仪（美国，Ｖａｒｉａｎ公司），Ｕｎｉｃａｍ　ＵＶ５００紫外分光光度仪（美国，Ｔｈｅｒｍｏ公司），　

ＰＨＳ一３Ｄ型ＰＨ计（上海智光仪器仪表有限公司）．ＨＨ一２数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）．三羟甲基氨基甲烷　

（Ｔｒｉｓ）（美国，Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司），牛血清白蛋白（瑞士，Ｒｏｃｈｅ公司，含量９８％），尼麦角林（四川大学华西药学院天然药　

化教研室，含量９９．５％），除Ｔｒｉｓ为生化试剂外，其余试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子水．　

１．２试验方法　

１．２．１溶液配制　

ＢＳＡ溶液：用Ｔｒｉｓ—ＨＣ１缓冲溶液（Ｏ．１　ｍｏｌ‘Ｌ～，盐酸调节ｐＨ　７．４，内含０．１　ｍｏｌ・Ｌ。ＮａＣ１维持离子强度）配成　

４．０×１０＿。ｍｏｌ‘Ｌ　储备溶液．尼麦角林溶液：精密称取尼麦角林适量，用甲醇溶解配制成浓度为２．５×１０一ｍｏｌ－ＬＪ的　

收稿日期：２ｏｌ４—０４．０８　通讯作者：仇丽颖（１　９８０一），女，汉族，沈阳人，讲师，博士，研究方向：生物药物分析；Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉｕ７９９２＠ｓｉｎａ．ｃｏｒｎ

　５１０　西南民族大学学报・自然科学版　第４０卷　

工作溶液，４　ｏＣ保存备用．　

１．２．２荧光光谱测定　

分别在一系列容量瓶中各精密加入ｌ　ｍＬ　４．０￣１０～ｍｏｌ・Ｌ　的ＢＳＡ溶液，依次加入０，１００，２００，３００，４００，５００，６００，　

７００，８００，９００　的２．５×１０一ｍｏｌ・Ｌ　的尼麦角林溶液，再分别加入０．１　ｍｏｌ・Ｌ—Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ（ｐＨ７．４，内含０．１　ｍｏｌ・Ｌ　ＮａＣ１）　

缓冲溶液定容至１０　ｍＬ，摇匀，置于恒温水浴锅中在规定温度下（２５￣Ｃ或３７￣Ｃ）孵育２０ｍｉｎ，测定荧光光谱．固定激　

发波长为２７８ｎｍ，激发，发射狭缝均为５ｎｍ，扫描荧光光谱并测量荧光强度．测定温度为２５℃或３７℃．　２结果与讨论　

２．１尼麦角林与ＢＳＡ荧光光谱对比　

ＢＳＡ分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基能够发射荧光，因而ＢＳＡ是内源性荧光物质．当激发波长在　

２７８　ｍ时，ＢＳＡ荧光发射峰在３５０　ｍ附近，而尼麦角林荧光强度很弱，因此不会对ＢＳＡ的荧光产生干扰．　

。ｏｏ　∞。　滚＊‘　蛐。　５０。　

图１　激发波长在２７８ｎｍ时ＢＳＡ和尼麦角林的荧光光谱　Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆｔｈｅ　ＢＳＡ　ａｎｄ　Ｎｉｃｅｒｇｏｌｉｎｅ　ａｔ　２７８ｎｍ　ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ　２．２尼麦角林对ＢＳＡ荧光光谱的影响　

固定ＢＳＡ的溶液浓度不变，向其中加入不同体积的尼麦角林溶液，结果随着尼麦角林浓度的增／Ｊｒｌ（终浓度依　

次为０，０．２５，０．５，０．７５，１．０，１．２５，１．５，１．７５，２．０，２．２５ｘ１０～ｍｏｌ・Ｌ　），ＢＳＡ最大荧光发射蜂强度逐渐降低（见图２）．实　

验结果说明尼麦角林通过某种机制导致ＢＳＡ的荧光被淬灭．　

骥　

。０ｏ　。５０　波长　）　５０　５０。　。。。　３５。　波长　）　５０　。。　

・　图２尼麦角林对ＢＳＡ荧光发射光谱的影响　Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆＮｉｃｅｒｇｏｌｉｎｅ　Ｏｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｅｍｉｓｓｉｏｎ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆＢＳＡ　２．３尼麦角林对ＢＳＡ的荧光猝灭机理　荧光猝灭作用可分为动态猝灭和静态猝灭等　Ｊ．本文首先按照动态荧猝灭规律，测定了常温下（２５℃）和　

正常生理条件下（３７℃），尼麦角林对ＢＳＡ的荧光猝灭情况．在动态猝灭过程中，可利用Ｓｔｅｒｎ—ｖｏｌｍｅｒ方程ｐ。。　：　

Ｆｏ／Ｆ＝Ｉ＋Ｋｑ％［Ｑ］＝１＋Ｋ　ｖ［Ｑ］．　（１）　方程中Ｆ０和Ｆ分别表示猝灭剂不存在和存在时ＢＳＡ的荧光强度，［Ｑ】是猝灭剂的浓度，即本实验中尼麦角林的　浓度，Ｋｓｖ为动态猝灭常数（单位Ｌ・ｍｏｌ　），Ｋｑ为双分子表观猝灭速率常数（单位Ｌ・ｍｏｌ＂ｌ＇ｓ　），

　是无猝灭剂时荧光分　第４期　陈佰灵等：荧光光谱法研究尼麦角林与牛血清白蛋白的相互作用　５ｌｌ　

子平均寿命，文献　报道约为１０一Ｓ．将Ｆｏ／Ｆ对［Ｑ］作图进行曲线拟合（图３），由直线的斜率可以求算ｔ￣ｒ－．ｓｖ，进一　

步求算出Ｋｑ（表１）：　

Ｏ　Ｏ　５　ｌ　１．５　２　２　５　

［ＱＩ／１０—　ｍｏｌ・Ｌ－　图３　不同温度条件下尼麦角林对ＢＳＡ荧光猝灭Ｓｔｅｒｎ—Ｖｏｌｍｅｒ方程曲线　Ｆｉｇ．３　Ｓｔｅｒｎ—Ｖｏｌｍｅｒ　ｐｉｏｔｓ　ｏｆＢＳＡ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｑｕｅｎｃｈｅｄ　ｂｙ　ｎｉｃｅｒｇｏｌｉｎｅ　ａｔ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　表１不同温度条件下尼麦角林对ＢＳＡ荧光猝灭常数　Ｔａｂ．１　ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｏｆ　ＢＳＡ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｎｉｃｅｒｇｏｌｉｎｅ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　

由计算结果可知，尼麦角林对ＢＳＡ的猝灭过程速率常数Ｋｑ远大于猝灭剂对生物大分子的动态荧光猝灭速率　

常数最大值２．０×１０川ｍｏｌ－＂Ｌ・Ｓ一，说明动态猝灭不是引起ＢＳＡ荧光猝灭的主要原因　Ｊ．　

静态猝灭可用Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ￣倒数方程［６，８１进行描述：　（Ｆ０．Ｆ）～＝Ｆ０。　＋ＫＬＢ－１．Ｆ０－ｋ［Ｑ］～．　（２）　

其中，Ｆ０、Ｆ和［Ｑ］意义同前，ＫＩＪｅ为静态猝灭过程中复合物的形成常数（单位Ｌ・ｍｏｌ　）．应用（Ｆ０　Ｆ）　对［Ｑ］　

作图并进行线性拟合（见图４），由直线的斜率和截距求算ＫＬＢ（表２）．　

０　１　２　３　４　５　

１／［Ｑ］／１０　ｔｏｏｌ・Ｌ‘　图４不同温度条件下尼麦角林对ＢＳＡ荧光猝灭Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ方程曲线　Ｆｉｇ．４　Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ—Ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔｓ　ｏｆＢＳＡ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｑｕｅｎｃｈｅｄ　ｂｙ　ｎｉｃｅｒｇｏｌｉｎｅ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　表２不同温度条件下尼麦角林与ＢＳＡ相互作用的结合常数和结合位点数　Ｔａｂ．２　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃｏｎｓｔａｎｔｓ　ａｎｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｎｕｍｂｅｒｓ　ｆｏｒ　ＢＳＡ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｎｉｃｅｒｇｏｌｉｎｅ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　

２．４尼麦角林与ＢＳＡ的结合常数和结合位点数　引用文献报道［７－９１的公式（方程３）作图并计算静态猝灭过程蛋白质与小分子的结合位点数ｎ和结合常数ＫＡ．结　

果见图５和表２．　

１ｇ（Ｆｏ／Ｆ—１）　ｌｇ　Ｋ　Ａ＋ｎｌｇ［Ｑ］．　（３）　５　３　５　２　１　５　Ｏ　３　，一　１　０　

。　５１２　西南民族大学学报・自然科学版　第４Ｏ卷　

￣ｌＱ｜／ｍｏ｝Ｌ一　图５　不同温度条件下尼麦角林对ＢＳＡ荧光猝灭的双倒数方程曲线　Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｄｏｕｂｌｅ　ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ　ｐｌｏｔｓ　ｏｆＢＳＡ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｑｕｅｎｃｈｅｄ　ｂｙ　Ｎｉｃｅｒｇｏｌｉｎｅ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　２．５尼麦角林与ＢＳＡ的作用力类型　

有机小分子和蛋白质生物大分子之间的结合力主要有疏水作用力、范德华力、静电作用力和氢键作用等．由　

热力学参数关系式（方程式４－６），可以计算出尼麦角林与ＢＳＡ相互作用的热力学函数值，结果见表３．　

１ｎ（Ｋ２／Ｋ３＝ＡＨ（１／Ｔ１－１／Ｔ２）／Ｒ　

△Ｇ＝一ＲＴｌｎＫ．　

ＡＳ＝一ｒＡＧ－－ＡＨ）／Ｔ．　ｒ　表３不同温度条件下热力学参数　Ｔａｂ．３　Ｔｈｅ　ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ　（４）　

（５）　

（６）　

文献报道判断生物大分子与小分子的结合性质有一定的热力学规律　。¨，若ＡＨ＞Ｏ，ＡＳ＞０，则表现为疏水作　

用力；若ＡＨ＜０，ＡＳ＞０，则表现为静电作用力；若ＡＨ＜０，ＡＳ＜０，则表现为氢键和范德华力．由于尼麦角林与ＢＳＡ　

反应前后的ＡＨ＞０，ＡＳ＞０，表明两者之间的作用力以疏水作用为主．　

３结论　

本研究结果表明，尼麦角林对ＢＳＡ的荧光猝灭作用属于静态猝灭，是由于两者间通过分子间疏水作用力形　

成了无荧光的大分子复合物而产生的，两者的结合位点约为１．ＢＳＡ通过与尼麦角林结合形成复合物，能够影响　

其在体内的转运和代谢，进而影响其药理作用，因此尼麦角林和ＢＳＡ的相互作用结果对临床用药具有重要意义．