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过氧化氢酶活力的测定

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1 / 4 实验三 过氧化氢酶活性的测定

一、实验目的：

了解过氧化氢酶的作用，掌握碘量法测定过氧化氢酶活性的原理和方法；

二、实验原理:

过氧化氢酶是一类色素蛋白，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢既是氧化剂又是还原剂。

R（Fe＋2）2＋H2O2---R(Fe+3OH)2

R(Fe+3OH)2+ H2O2 ---- R（Fe＋2）2+2H2O+O2

并合上式：H2O2 ----2H2O+O2

据此，可根据消耗H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量的过氧化氢溶液，经酶促反应后，加入过量的KI溶液生成的I2用标准的Na2S2O3滴定，根据Na2SO3消耗的体积计算H2O2的消耗量。

三、实验材料、仪器和试剂：

1、实验材料：小白菜

2、仪器：恒温水浴锅、研钵、容量瓶、刻度吸管、100mL三角瓶

3、试剂：

（1）0.05mol/L H2O2 （2） 2mol/LH2SO4

（3）0.1mol/L Na2S2O3

（4）1%淀粉溶液 （5）10%(NH4)6Mo7O24

（6）pH7.8的磷酸缓冲液 （7）20% KI

（8）CaCO3

四、实验步骤：

（1）酶液提取：

称取2.5g白菜叶，加少量CaCO3，2mLpH7.8的缓冲液少量，研成匀浆，移入100ml容量瓶，用上述缓冲液冲洗研钵数次转入容量瓶中定容，静置10分钟，过滤。取滤液10mL于另一100mL的容量瓶中稀释定容待测（根据酶活高低而定）。

（2）酶促反应：

取锥形瓶4个，编好号各加入10ml酶液之后，立即向两个瓶中加入2mol/L

H2SO45mL，终止酶活性，作空白对照。向另外两瓶各加H2O2 5mL，摇匀，在加入H2O2的那一刻起，记录时间，5分钟后迅速向实验瓶中加入2mol/LH2SO45mL，终止酶活性。向三角瓶中加1mL 20% KI和3滴(NH4)6Mo7O24，摇匀后迅速用标准Na2S2O3溶液进行滴定至淡黄色，加入1mL1%淀粉指试剂，蓝色恰好消失，文档可能无法思考全面，请浏览后下载!

2 / 4 记录消耗的Na2S2O3的体积V0，V；

五、结果记录与数据处理：

被分解的H2O2量（mg）=（空白滴定值-样品滴定值）×Na2S2O3摩尔浓度×17

过氧化氢酶活性（mg.g-1.min-1）= (min))()()(OH22时间样品重测定取液量总体积量被分解的gmg

六、 结果分析与问题讨论：

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3 / 4 实验十 还原型VC含量测定

一、实验目的

学会从生物样品中提取维生素C方法,了解蔬菜中维生素C的含量。

学会测定维生素C含量的原理和方法,进一步掌握滴定法的基本操作技术.

二、实验原理

Vc由于其结构中具有烯二醇的结构，所以它是一种强还原剂，易被弱氧化剂氧化脱氢而成氧化型抗坏血酸。Vc在酸性溶液中比中性溶液及碱性溶液中稳定，但易被热、光及某些金属离子破坏。

本实验是用碘液作氧化剂，淀粉为指示剂，当Vc全部被氧化后，过量一滴碘液与淀粉指示剂反应生成淡兰色络合物，即为终点。

三、实验材料、试剂及仪器

材料：西红柿。

试剂：

2％草酸溶液：称取20g草酸溶于蒸馏水中，溶解后稀释到1000mL，混匀；

1％可溶性淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉用少量蒸馏水调成匀浆，倾入80 mL的沸水中继续煮沸至透明，冷却后稀释至100 mL；

0．1mol/L碘液（随用随配）：称取6.5克碘和20克碘化钾于研钵中，加少量的蒸馏水研磨至完全溶解后稀释至500毫升混匀。贮存于棕色试剂瓶中；

1％草酸溶液：称取10g草酸溶于蒸馏水中，溶解后稀释到1000mL，混匀；

0.1mg/mLVc标准溶液：准确称取抗坏血酸10mg，溶于1％草酸溶液中稀释至100mL贮存于棕色试剂瓶中冷藏（现用现配）。

仪器：万分之一电子天平；棕色酸式滴定管；三角瓶等。

四、实验操作步骤：

1、碘液的标定：吸取0.1mg/mLVc标准溶液10mL于100mL的锥形瓶中，加5滴可溶性淀粉，摇匀后用稀碘液滴定至浅蓝色，且30秒内不退色，即为终点。滴二个平行样。

2、样品的提取：准确称取10g左右的样品1份，

用少许2%草酸溶液研磨成匀浆，转入100mL容量瓶中，用2%的草酸溶液洗研钵3-4次，一并转入容量瓶中，最后用2%草酸溶液定容至100mL摇匀，放置10文档可能无法思考全面，请浏览后下载!

4 / 4 分钟后过滤，滤液备用。

3、滴定：

空白滴定： 准确吸取10mL2%草酸溶液于100mL的锥形瓶中，加5滴1%淀粉指示剂，摇匀后用稀碘液滴定至浅蓝色，且30秒内不退色，即为终点,滴二个平行样。

样品滴定： 准确吸取10mL样品于100mL的锥形瓶中，加5滴1%淀粉指示剂，摇匀后用稀碘液滴定至浅蓝色，且30秒内不退色，即为终点,滴二个平行样。

六、数据记录及计算

1、样品的重量（g）：样品1：W1 =

样品2：W2 =

2、碘液的标定（mL）： V1 = V2=

V=

3、样品的滴定（mL）：

4、空白的滴定（mL）：

5、计算：

每毫升碘液相当于Vc的毫克数K（mgVc/mLI2）= V101.0

Vc的含量（mg/100g 样品）=10010W100C)VV(样品空白样品

六、结果分析与讨论

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过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制

过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制

过氧化物酶（POD）活性测定

【实验原理】

过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。

【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存在冰箱中]

【方法步骤】

（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL，于研钵中研成匀浆，以4000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。

（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL，稀释后的酶液1mL（如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次（4min）。以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。

表1 紫外吸收法测定POD酶活性配置表

管 号 S0（对照） S1（实验） S2（实验）

反应混合液(ml) 3.0 3.0 3.0

KH2PO4 (ml) 1.0 0.0

0.0

酶液 (ml) 0.0 1.0 1.0

4.结果计算

以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。也可以用每 min

内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。

POD总活性[u/g(FW)]=

土壤过氧化氢酶活性测定方法(完整)

土壤过氧化氢酶活性测定方法(完整)

高锰酸钾滴定法

1. 试剂配制：

(1)0.3%过氧化氢溶液： ①（1：100 30%的H2O2和水）

②2O2+49.5ml蒸馏水）

③（1ml30% H2O2+99ml蒸馏水）

(2)3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水）

4+100ml蒸馏水）

2. 高锰酸钾的标定：

精确称取约0.2 g在110℃湿润至恒量的基准草酸钠.参加250 mL新煮沸过的冷水.10 mL硫酸,搅拌使之消融.将草酸钠溶液加热到75℃~ 85℃ (即开端冒蒸气时的温度),趁热用待标KMnO4 溶液进行滴定.开端滴准时反响速度很慢,待溶液中产生M n2+后,反响速度加速,但滴准时仍必须是逐滴参加,至溶液呈粉红色,半分钟内不褪色即为终点.留意滴定停止时的温度不该低于60℃.

2MnO4- + 5C2O42- + 16H+ 75~ 85℃ Mn 2+ +10CO2 + 8H2O.

参考：《高锰酸钾尺度溶液标定办法的改良及留意事项》王继莲

3. 测定：

精确称取2 g风干土置100 mL锥形瓶→参加40 mL蒸馏水和5

mL0.3%过氧化氢（现配）,另设对比 (40 mL蒸馏水和5 mL0.3%过氧化氢)→在来去式振荡机上振荡20 min→参加5 mL3N硫酸（以稳固未分化的H2O2）→用慢速型滤纸过滤,→

4．成果盘算 泥土的过氧化氢酶活性,以单位土重的0.1N KMnO4毫升数(对比与实验测定的差) 暗示.

备注：

以容量法测H2O2的酶活：Kappen（1913）起首介绍硫酸存鄙人用高锰酸钾滴定残剩的过氧化氢测定酶活.此法依据H2O2与泥土互相感化时,未分化的H2O2的数目用容量法（经常应用高锰酸钾滴定未分化的H2O2）测定H2O2的酶活

2 KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4→2MnSO4＋K2SO4＋8H2O＋5O2

泥土H2O2酶促过氧化氢的分化有利于防止它对生物体的迫害感化.

过氧化氢酶(CAT)活性测定

过氧化氢酶(CAT)活性测定

过氧化氢酶(CAT)活性测定

高锰酸钾滴定法

(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．165-167)

一、原理

过氧化氢酶(catalase，CAT)普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，它属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

R(Fe2+)+HO22R(FeOH3+－)2e

R(Fe2+R(FeOH3+－)+HO22)2+2 HO2＋O22e

因此，可以根据H2O2的消耗量或者O2的生成量测定该酶活力的大小。

在该体系中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。

5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料

植物器官(花瓣、叶片等)

(二)仪器设备

冰箱、离心机、微量加样器 (1ml、20μl、100μl)、移液管、精密电子天平、试管、研钵、剪刀、镊子、三角瓶、恒温水浴、容量瓶、酸式滴定管

(三)试剂

(1)10% H2SO4

(2)0.2mol/L PH7.8磷酸缓冲液

(3)0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制

成1000mL，再用0.1mol/L草酸溶液标定

(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2(大约等于17.6 mol/L)5.68mL，稀释至1000mL，用

0.1mol/L高锰酸钾标准液(在酸性条件下)进行标定

(5) 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定溶1000mL。 三、试验步骤

【高中生物】高中生物实验：过氧化氢酶活性的测定

【高中生物】高中生物实验：过氧化氢酶活性的测定

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高中生物

实验：过氧化氢酶活性的测定

原理

过氧化氢酶广泛存在于所有植物组织中。它能将过氧化氢分解为氧气和水，保护生物体免受过氧化氢的毒性影响。测定过氧化氢酶的方法包括测压法、滴定法和分光光度法。氧电极法是一种灵敏、快速的氧释放速率测量方法。氧释放速率与过氧化氢酶活性成正比。

仪器药品

氧电极记录仪

电磁搅拌器 超级恒温水浴

注射器、微量注射器和容量瓶

反应杯 亚硫酸钠

过氧化氢酶

50mmol/l磷酸缓冲液，ph7.0(见附表2)。

50mmol/L过氧化氢溶液：取30%过氧化氢1.4ml，用磷酸缓冲液稀释至250ml。

标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶(sigma)1.0mg(110u/mg)，溶于50mmol/l磷酸缓冲液(ph7.0)11ml中，使酶浓度为10u/ml。

操作步骤

1.仪器的标定

按照实验步骤88校准仪器，以获得记录纸上每个小网格的等效氧含量。

2.绘制酶活性标准曲线

（1） 在反应杯中加入过氧化氢磷酸缓冲液，打开电磁搅拌器搅拌10分钟，插入电极，吸收电极外溢出的溶液，调整换档旋钮，使记录笔约满刻度的10-20%，使记录纸四处移动，温度在1-2分钟后达到平衡，记录笔画出一条直线。

(2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110u/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。 （3） 按照上述相同步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μL（例如，浓度为20、30、40、50U/ml），并记录氧释放曲线。

(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。

（5） 以过氧化氢酶活性单位为横坐标，以每分钟释放的氧气量为纵坐标绘制标准曲线。