健康食品免疫调节功能评价方法修订草案
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保健食品功能检验与评价方法(2023年版)有助于调节肠道菌群1.1试验项目1.1.1 动物实验1.1.1.1 体重1.1.1.2 双歧杆菌11.1.3乳杆菌1.1.1.4 肠球菌1.1.1.5 肠杆菌1.1.1.6 产气荚膜梭菌1.1.2 人体试食试验1.1.2.1 双歧杆菌1.1.2.2 乳杆菌1.1.2.3 肠球菌1.1.2.4 肠杆菌1.1.2.5 拟杆菌1.1.2.6 产气荚膜梭菌2.2试验原则2.2.1 动物实验和人体试食试验所列指标均为必做项目。
2.2.2 正常动物或肠道菌群紊乱模型动物任选其一。
2.2.3 受试样品中含双歧杆菌、乳杆菌以外的其它益生菌时,应在动物和人体试验中加测该益生菌。
2.2.4 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。
3.3结果判定3.3.1动物实验:符合以下任一项,可判定该受试样品有助于调节肠道菌群动物实验结果阳性。
3.3.1.1双歧杆菌和/或乳杆菌(或其它益生菌)明显增加,梭菌减少或无明显变化,肠球菌、肠杆菌无明显变化。
3.3.1.2双歧杆菌和/或乳杆菌(或其它益生菌)明显增加,梭菌减少或无明显变化,肠球菌和/或肠杆菌明显增加,但增加的幅度低于双歧杆菌、乳杆菌(或其它益生菌)增加的幅度。
3.2.1人体试食试验:符合以下任一项,可判定该受试样品具有有助于调节肠道菌群的作用。
3.2.1.1双歧杆菌和/或乳杆菌(或其它益生菌)明显增加,梭菌减少或无明显变化,肠球菌、肠杆菌、拟杆菌无明显变化。
双歧杆菌和/或乳杆菌(或其它益生菌)明显增加,梭菌减少或无明显变化,肠球菌和/或肠杆菌、拟杆菌明显增加,但增加的幅度低于双歧杆菌、乳杆菌(或其它益生菌)增加的幅度。
有助于调节肠道菌群检验方法1动物实验1.1实验动物推荐用近交系小鼠,18-22g,单一性别,每组10-15只。
1.2剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个阴性对照组,以人体推荐量的10 倍为其中的一个剂量组,另设二个剂量组,必要时设阳性对照组。
保健食品功能学评价程序和检验方法(1996年7月18日卫监发[1996]38号发布,自发布之日起实行1.主题内容和适用范围本程序和检验方法规定了评价食品保健作用的统一程序和检验方法。
本程序和检验方法适用于评价食品的免疫调节、延缓衰老、改善记忆、促进生长发育、抗疲劳、减肥、耐缺氧、抗辐射、抗突变、抑制肿瘤、调节血脂、改善性功能等作用。
本程序和检验方法规定了评价食品保健作用的人体试食试验规程。
2.进行食品保健作用评价的基本要求2.1对受试物的要求2.1.1提供受试物的物理、化学性质(包括化学结构、纯度、稳定性等)等有关资料。
2.1.2受试物必须是规格化的产品,即符合既定的生产工艺、配方及质量标准。
2.1.3提供受试物安全性毒理学评价的资料,受试物必须是已经过食品安全性毒理学评价确认为安全的物质。
2.2对实验动物的要求2.2.1根据各种试验的具体要求,合理选择实验动物。
常用大鼠和小鼠,品系不限,推荐使用近交系动物。
2.2.2 动物的性别不限,可根据试验需要进行选择。
动物的数量的要求为小鼠每组至少10只(单一性别),大鼠每组至少8只(单一性别)。
动物的年龄可根据具体试验需要而定。
2.2.3 动物应达到二级实验动物的要求。
2.3 给受试物的剂量及时间2.3.1 各种试验至少应设3个剂量组,1个对照组,必要时可设阳性对照组。
剂量选择应合理,尽可能找出最低有效剂量。
在3个剂量组中,其中一个剂量应相当于人推荐摄入量的5-10倍左右。
2.3.2 给受试物的时间应根据具体试验而定,原则上至少1个月。
3.试验项目、试验原则及结果判定3.1 免疫调节作用3.1.1 试验项目3.1.1.1.1 脏器/体重比值胸腺/体重比值脾脏/体重比值3.1.1.1.2 细胞免疫功能测定小鼠脾淋巴细胞转化实验迟发型变态反应3.1.1.1.3 体液免疫功能测定抗体生成细胞检测血清溶血素测定3.1.1.1.4 单核-巨噬细胞功能测定小鼠碳廓清试验小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验3.1.1.1.5 N细胞活性测定3.1.1.2 人体试食试验3.1.1.2.1 细胞免疫功能测定外周血淋巴细胞转化试验3.1.1.2.2 体液免疫功能试验单向免疫扩散法测定IgG、IgA、IgM3.1.1.2.3 非特异性免疫功能测定吞噬与杀菌试验3.1.1.2.4 N细胞活性测定3.1.2 试验原则要求选择一组能够全面反映免疫系统各方面功能的试验,其中细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞功能三个方面至少各选择1种试验,在确保安全的前提下尽可能进行人体试食试验。
4.2 安全检定4.2.1 安全试验 采用较人用剂量多出数倍的试样(按体重计算),给小鼠口服,观察对小鼠健康是否有不良影响。
规程规定取2g制品溶解在8mL无菌生理盐水中,20~22g小白鼠5只,每只灌胃0.5mL,每天1次,连续3d,并观察反应至第7天,小鼠应健康活存,体重增加。
4.2.2 杂菌检查 口服活菌制剂不得污染大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌等致病性细菌,检查时可采用上述致病菌选择特异培养基。
参照口服药卫生学指标要求,口服活菌制剂非致病性杂菌数不得超过1000/g,霉菌数不超过100/g。
对于非口服制剂,卫生学指标另有规定。
4.3 效力检定 益生菌制品多以制品中益生菌活存数表示效力。
活菌计数,通常采用平板法即先使细胞分散、定位、增值后,再做菌落计数,也称之细胞集落形成试验,以每克(每毫升)细菌集落数表示(CF U/g, CFU/mL)。
对于多种细菌制成的活菌制剂,则应分别在各种菌的特异培养基平板上计数。
一般胶囊制剂或片剂按规程规定测定方法应为:无菌称取3g制剂,加入适宜稀释液中,充分摇匀,作10倍系列稀释(根据不同制品不同指标),取量后稀释度0.1mL滴入适宜琼脂平皿上,共做3个平皿,并以 L 棒涂布均匀,置适宜条件下培育,到期观察每个平皿菌落生长情况,并计数,但必须注意,当平皿菌落数小于10或大于100时,都应重新调整稀释度重新测定。
根据3个平皿菌落总数可按下列公式计算活菌数。
3个平皿菌落数之和10 最后稀释度=活菌数(CFU/g) 活菌数用 CF U 表示,即为细菌集落单3位。
一切工业产品都要求把质量放在首位。
微生态制剂也不例外,益生菌制品,也称活菌制剂,是最为广泛使用的微生态制剂,它是用于临床治疗或保健的具有生物活性的制品;其质量具有自身的特殊性和重要性。
益生菌直接用于特定患者、年老体弱者或者直接用于健康人,益生菌制品质量优劣直接关系到使用者的疗效和安全,因而更须强调 质量第一 的原则。
保健食品标识规定第一条为了加强对保健食品标识和产品说明书的监督管理,根据《中华人民共和国食品卫生法》(以下简称《食品卫生法》和《保健食品管理办法》的有关要求,特制定本规定。
第二条本规定适用于在国内销售的一切国产和进口保健食品。
第三条本规定所用定义如下:保健食品:系指表明具有特定保健功能的食品。
即适宜于特定人群食用,具有调节机体功能,不以治疗疾病为目的食品。
功效成分:指保健食品中产生保健作用的组分。
食品标识:即通常所说的食品标签,包括食品包装上的文字、图形、符号以及说明物。
借以显示或说明食品的特征、作用、保存条件与期限、食用人群与食用方法,以及其他有关信息。
最小销售包装:指销售过程中,以最小交货单元交付给消费者的食品包装。
主要展示版面:指消费者选购商品时,在包装标签上最容易看到或展示面积最大的表面,一般的食品销售包装至少有一个表面可用作主要展示版面。
信息版面:是紧接主要展示版面右侧的包装表面。
如果因包装设计原因,紧接主要展示版面右侧的信息版面不能满足标签标示的要求(如折叠的包装袋)时,则信息版面可选择右侧版面右侧的下一个版面。
保健食品专用名称:表明保健食品的主要原料、产品物理形态、主要加工工艺等食品属性的名称。
保健食品作用名称:在保健食品名称中,用于表明保健食品主要作用的名称部分。
保健作用声明短语:以短语形式,对保健作用的简单介绍或描述。
第四条保健食品标识与产品说明书的所有标识内容必须符合下列基本原则:保健食品名称、保健作用、功效成分、适宜人群和保健食品批准文号必须与卫生部颁发的《保健食品批准证书》所载明的内容相一致。
应科学、通俗易懂,不得利用封建迷信进行保健食品宣传。
应与产品的质量要求相符,不得以误导性的文字、图形、符号描述或暗示某一保健食品或保健食品的某一性质与另一产品的相似或相同。
不得以虚假、夸张或欺骗性的文字、图形、符号描述或暗示保健食品的保健作用,也不得描述或暗示保健食品具有治疗疾病的功用。
保健食品功能检验与评价方法(2023 年版)The methods for evaluating and assessing the functionalityof health food products have evolved with time, and the2023 edition introduces several important changes and updates. Firstly, it is crucial to mention that these methods help in determining the effectiveness, safety, and quality of health food products.其中有几个主要的功能检验与评价方法。
生化指标方法是用于定量分析产品中特定成分含量的一种方法。
例如,通过测量维生素、矿物质、蛋白质等成分的含量来确定产品是否能够提供足够的营养。
Secondly, physiological function evaluation method is employed to assess the effects of health food products on human body functions. This method involves conducting experiments on subjects to measure various physiological indicators such as blood pressure, heart rate variability, immune response, etc. These indicators provide insightsinto the impact of the product on different aspects ofhuman health.临床试验是另一种常见的功能评价方法。
保健食品功能学评价程序和检验方法1主题内容和适用范围本程序和检验方法规定了评价食品保健作用的统一程序和检验方法。
本程序和检验方法适用于评价食品的免疫调节、延缓衰老、改善记忆、促进生长发育、抗疲劳、减肥、耐缺氧、抗辐射、抗突变、抑制肿瘤、调节血脂、改善性功能等作用。
本程序和检验方法规定了评价食品保健作用的人体试食试验规程。
2进行食品保健作用评价的基本要求2.1对受试物的要求2.1.1提供受试物的物理、化学性质(包括化学结构、纯度、稳定性等)等有关资料。
2.1.2受试物必须是规格化的产品,即符合既定的生产工艺、配方及质量标准。
2.1.3提供受试物安全性毒理学评价的资料,受试物必须是已经过食品安全性毒理学评价确认为安全的物质。
2.2对实验动物的要求2.2.1根据各种试验的具体要求,合理选择实验动物。
常用大鼠和小鼠,品系不限,推荐使用近交系动物。
2.2.2动物的性别不限,可根据试验要进行选择。
动物的数量的要求为小鼠每组至少10只(单一性别),大鼠每组至少8只(单一性别)。
动物的年龄可根据具体试验要而定。
2.2.3动物应达到二级实验动物的要求。
2.3给受试物的剂量及时间2.3.1各种试验至少应设3个剂量组,1个对照组,必要时可设阳性对照组。
剂量选择应合理,尽可能找出最低有效剂量。
在3个剂量组中,其中一个剂量应相当于人推荐摄入量的5-10倍左右。
2.3.2给受试物的时间应根据具体试验而定,原则上至少1个月。
3试验项目、试验原则及结果判定3.1免疫调节作用3.1.1试验项目3.1.1.1.1脏器/体重比值胸腺/体重比值脾脏/体重比值3.1.1.1.2细胞免疫功能测定小鼠脾淋巴细胞转化实验迟发型变态反应3.1.1.1.3体液免疫功能测定抗体生成细胞检测血清溶血素测定3.1.1.1.4单核-巨噬细胞功能测定小鼠碳廓清试验小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验3.1.1.1.5NK细胞活性测定3.1.1.2人体试食试验3.1.1.2.1细胞免疫功能测定外周血淋巴细胞转化试验3.1.1.2.2体液免疫功能试验单向免疫扩散法测定IgG、IgA、IgM3.1.1.2.3非特异性免疫功能测定吞噬与杀菌试验3.1.1.2.4NK细胞活性测定3.1.2试验原则要求选择一组能够全面反映免疫系统各方面功能的试验,其中细胞免疫、体液免疫入单核-巨噬细胞功能三个方面至少各选择1种试验,在确保安全的前提下尽可能进行人体试食试验。
保健食品增强免疫力的评价方法一、实验内容:1.细胞免疫2.体液免疫3.非特异性免疫功能4. NK细胞活性二、评价指标1.体重和免疫脏器重量的测定:称量实验动物在实验的初,中,终期的体重,测量胸腺和脾脏重量,评价受试动物的一般情况,脏器/体重比,包括胸腺/体重比,脾脏/体重比2.细胞免疫功能测定:1〕小鼠脾淋巴细胞转化实验2〕迟发性超敏反响〔DTH3.体液免疫功能1〕抗体生成细胞检测2〕血清溶血素测定4.单核/巨噬细胞功能测定1〕小鼠廓清实验2〕小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验5. NK细胞活性测定三、动物选择1.正常或免疫功能低下的模型动物进行实验.2. 一般选择小鼠,品系不限,推荐使用近郊系动物,性别为单一性, 6-8W,体重18-22g03.动物数量每组10-15只,清洁级以上.四、实验剂量1.至少设3个剂量组,另设空白对照组,也可加阳性对照组.2.尽可能找出最低有效剂量.3. 3个剂量中,有1个剂量应相当于人体推荐摄入量〔折算为每公斤体重的剂量〕的10倍4.最高剂量不得高于人体推荐摄入量的30倍5.剂量必须在毒理学评价的平安剂量范围内五、实验时间一般30天1.细胞免疫功能小鼠脾淋巴细胞转化实验和DTH反响实验结果均为阳性,或其中一个实验的两个剂量组结果阳性,那么可判定样品具有增强细胞免疫作用2.体液免疫功能抗体生成细胞实验和血清溶血素测定如结果均为阳性,或其中一个实验的2个剂量组结果阳性,可判定具有增强体液免疫作用.3.单核/巨噬细胞功能实验小鼠碳廓清实验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验结果均为阳性, 或其中一个实验的两个剂量组结果阳性,可判定具有增强非特异性免疫作用4. NK细胞活性一个以上剂量组结果阳性,可判定具有增强NK细胞活性作用5.在1-4项实验中,假设有2个功能检测呈阳性〔其中1, 2, 3应在以上单项功能判定的根底上〕,可判定该样品具有增强免疫作用.6.对1-4任何一项实验,具有抑制作用,可判定该样品具有免疫抑制效应.1.细胞免疫—小鼠脾淋巴细胞转化一一MTTt放射性核素掺入法一DTH小应一一耳月中胀法或足足石增厚法2.体液免疫―抗体生成细月fi实验一一Jerne改进玻片法〕4血清溶血素实验一一血凝法和半数溶血值HD50&测定3.非特异性免疫事小鼠碳廓清实验―小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验一一滴片法或半体内法5. NK细胞活性▲ 乳酸脱氢酶测定〔LDH法和放射性核素3H-TdR1.血液学检查工程半细胞分化抗原分类检测4细胞分类计数指标2.淋巴细胞转化增殖实验的改进增加新方法:4 5-澳脱氧尿音掺入标记检测细胞增殖动力学指标手抗增殖细胞核抗原单抗或PCNAfe疫组化染色-CFSEB记细胞检测细胞增殖水平4B淋巴细胞对有丝分裂原的反响性〔LPS诱导〕和混合淋巴细胞反响评价5.单核/巨噬细胞吞噬功能实验增加新方法:4单核/巨噬细胞计数4单核/巨噬细胞吞噬荧光微球的水平$ 单核/巨噬细胞吞噬FITC标记的细菌的功能半单核/巨噬细胞吞噬凋亡细胞的功能半单核/巨噬细胞呼吸爆发、趋化作用及细胞溶解活性,细胞因子释放活性氧和活性氮等的定量检测.6. NK细胞活性测定增加新方法:4微细胞毒性方法一4h51Cr释放测定法。
保健品的区分保健品百科名片保健品GB16740-97《保健(功能)食品通用标准》第3.1条将保健食品定义为:“保健(功能)食品是食品的一个种类,具有一般食品的共性,能调节人体的机能,适用于特定人群食用,但不以治疗疾目前市场上的保健品大体可以分为保健食品、保健药品、保健化妆品、保健用品等。
保健食品具有食品性质,如茶、酒、蜂制品、饮品、汤品、鲜汁、药膳等,具有色、香、形、质要求,一般在剂量上无要求;保健药品具有营养性、食物性天然药品性质,应配合治疗使用,有用法用量要求,如目前带“健”字批号的药品;保健化妆品具有化妆品的性质,不仅有局部小修饰作用,且有透皮吸收、外用内效作用,如保健香水、霜膏、漱口水等;保健用品具有日常生活用品的性质,如健身器、按摩器、磁水器、健香袋、衣服鞋帽、垫毯等。
保健食品与一般食品的区别保健食品含有一定量的功效成分,能调节人体的机能,具有特定的功效,适用于特定人群。
一般食品不具备特定功能,无特定的人群食用范围。
保健食品不能直接用于治疗疾病,它是人体机理调节剂、营养补充剂。
而药品是直接用于治疗疾病。
保健品标志的含义保健食品标志的颜色为天蓝色图案,图标下半部分有保健食品字样。
国家工商局和卫生部在日前发出的通知中规定,在影视、报刊、印刷品、店堂、户外广告等可视广告中,保健食品标志所占面积不得小于全部广告面积的1/36。
其中报刊、印刷品广告中的保健食品标志,直径不得小于1厘米保健品标志。
如何鉴别保健品真伪一、购买保健品确保通过正规渠道购买二、先看有无卫生部的”小蓝帽”这是国家为让消费者辨认区分真假保健品的特制标志,三、其次看包装是否规范,有无清晰的或无法识别的部分.四、看GMP认证标志:GMP是国际通行的食品医药企业良好的生产流程和管理规范,是我国药品和保健品生产的强制项目。
五、看成分表:消费者要仔细看保健产品成分说明,大家购买时一定要看仔细。
保健食品与营养品有什么区别?保健品不是营养品。
健康食品免疫調節功能評估方法修正草案壹、前言健康食品的免疫調節功能評估,是針對包括非特異性及特異性免疫功能之評估。
所謂非特異性免疫力主要包括如中性白血球(neutrophils)及單核球(monocytes)的吞噬能力或是自然殺手細胞的活性(natural killer activity),及其他沒有利用抗原刺激的免疫反應。
而特異性免疫力主要是針對一些特定的抗原作進一步的評估,在小鼠身上可以利用外加注射一些特定的抗原,再進行抗原特異性免疫反應的評估,其中必須包括如特異性抗體的測定或是抗原特異性的T細胞增殖反應和細胞激素的研究。
至於人體的抗原特異性免疫力的評估,則可能必須與疫苗注射來合併進行。
同時,如果要評估免疫細胞的功能時,應該分別由質與量兩方面來加以分析。
量方面主要是測定各種免疫細胞的數目,目前利用螢光流體計數儀可以容易地將免疫細胞正確地計算出。
由於免疫功能在正常人或是為數不少的疾病都扮演著一個重要的關係,未來如果要更正確地評估健康食品在這些免疫疾病上的可能調節功能,也許需要另外建立動物模式或是經由人體的臨床試驗來加以評估這些功能。
貳、實驗方法一、動物實驗實驗動物:建議選用小鼠,常用的BALB/c或是B6小鼠皆可,6-8週大,雄鼠或雌鼠皆可,每組為單一性別,隻數至少10隻,同時須附上原始數據。
非特異性免疫反應及特異性免疫反應可使用同一批小鼠來進行。
(一)非特異性免疫反應:1. 脾臟或淋巴結細胞增殖反應:T細胞建議使用如Con A或是Phytohaemagglutinin(PHA)的裂殖素(mitogen),或是利用交叉連結(cross-linking)抗CD3抗體來刺激。
B細胞建議使用Lipopolysaccharide (LPS)來刺激。
測定步驟如下:(1) 3H-thymidine incoroperation 法:方法較靈敏,將脾臟細胞以適當細胞濃度(如2x106/ml)置於96-well plate, 再加入Rosewell Park Memorial Institute 培養基(RPMI)或添加有LPS, Con A, PHA 等細胞裂殖素的培養基。
於37℃ CO2培養適當天數後,加入 1 µCi/well 3H-thymidine,繼續培養適當時間之後,以cell harvester 收集細胞於濾紙上,濾紙風乾後以閃爍計數儀測3H-thymidine 含量,計算細胞增生能力。
(2) MTT法或WST等其他類似呈色法:MTT的測定方法基本上是利用細胞本身的酵素對受質的作用,產生顏色的變化,再進一步測定其吸光值。
如果細胞受到細胞裂殖素的刺激,增生越多,則活的細胞愈多,酵素的活性就會較高,可以測到較高的吸光值。
利用此一原理,也可以來測定細胞的增殖反應,但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高,對懸浮性細胞則較不理想,進行本實驗時應特別注意。
WST-1(4-[3-(4-Iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate) 對細胞無毒性,其作用之原理同MTT assay,但最大的差異為MTT最後形成的是非水溶性formazan,WST-1形成的則是水溶性的,因此不需使用有機溶劑回溶結晶,在分析上較為便利。
(3) 螢光流體計數儀來測定DNA的染色:利用螢光染色的方法來分析細胞是否受到刺激,細胞核內的DNA是否有任何變化,可以利用Propidium iodide (PI) 及bromodeoxyuridine (BrdU) 的方法來染色。
PI可以在染色後直接利用螢光流體計數儀加以分析,但是BrdU 的方法則需要再加上一個抗BrdU 的單株抗體加上螢光,才能利用螢光流體計數儀來加以分析。
為了進一步分析是那些細胞的DNA有增加的變化,可以同時對這些細胞進行表面標記的分析。
如利用抗CD3 及抗B220 抗體先行染色,再將細胞加以固定,然後進行DNA 的染色。
對細胞的表面標記及細胞內的DNA 螢光使用不同波長的螢光,以便能夠在儀器上能對這兩群不同的細胞進行分析。
如果能夠達到此一目的,便能夠不需要將細胞分離出就可以知道是那些細胞受到活化。
2. 抗體分泌實驗血液中免疫球蛋白濃度:目前測定血清內免疫球蛋白的濃度,最常利用到的方法為radial immunodiffusion (RID) 法,此種方法在使用上較為方便,只要將血清放入培養孔中,靜置24 至48 小時後,再測量其直徑大小,與標準值對照,便可以算出免疫球蛋白濃度。
除此外,也可以利用sandwich-ELISA,或是生化的方法將免疫球蛋白的濃度計算出來,但是生化的方法可能必須在較具規模的醫學中心才能做得到。
3. 細胞激素分泌實驗將分離出的脾臟細胞以適當細胞濃度(如2x106/ml) 置於24-well 的Plate中,利用已經定量過的Con A 或抗CD3 抗體來刺激這些淋巴球。
經過適當時間(24到48小時) 的培養後,將上層液離心下來,以測定其淋巴介質製造的量。
在取得足夠檢體以前,可將其它檢體先保存在-70℃,等到檢體足夠時再一起測試。
淋巴介質的測定是利用sandwich-ELISA 法。
先利用一個抗淋巴介質的抗體先覆蓋在ELISA plate 上,在4℃靜置一晚。
在進行實驗前先以1% PBS-BSA 處理後清洗之。
再將要處理的檢體加到plate 上,置於室溫2小時後加入biotin 聯結的抗淋巴介質抗體。
兩小時的室溫靜置後,加入avidin 聯結過氧化酵素(avidin-linked peroxidase),再靜置2個小時後加入受質以呈色。
上述的裂殖素的濃度及刺激時間在實驗進行之前都應先測定其最適當的濃度,並以已知濃度的淋巴介質作為對照。
4. 分離脾臟或淋巴結細胞進行表面標記分析:利用合乎實驗動物倫理之方法分別犧牲老鼠,將脾臟取出並製備成單一細胞懸浮液,更進一步利用Tris-Ammonium chloride 緩衝液將紅血球懸浮,而白血球則利用Hank's 溶液清洗3次後再進行下一步的實驗。
將單一白血球分離出後,利用Fluorescein isothiocyanate(FITC) 及Phycoerythin(PE) 染色的單株抗體來計算不同表面標記的比例及數目。
這些細胞表面標記的測定將利用於Fluorescence Activated Cell Sorter(FACS) 分析法。
5. 自然殺手細胞活性:(1) 放射線法為要測定實驗動物之自然殺手細胞的活性,可以先培養自然殺手細胞的標的細胞(YAC-1 細胞株)。
將YAC-1細胞與51Cr先一起培養約4小時,再將殘餘在試管中而未移除的51Cr除去。
再加入不同數目的單核球(monocyte)與已經與51Cr培養過的標的細胞一起培養,培養一段時間後取出上清液,放入γ-counter內計算其放射強度。
實驗的過程中,利用NP-40或HCl將細胞破壞,取得51Cr 的最高釋放值。
實驗值-背景值×100﹪計算公式=最高釋放值-背景值(2) FAC Scan法採用LIVE/DEAD Cell-Mediated Cytotoxicity Kit,為一使用兩種顏色螢光的分析方法。
以綠色的3,3’-dioctadecyloxacarbocyanine (DiOC18) 染標的細胞,將此標的細胞和不同數目的單核球一起培養後,再以紅色的propidium iodide (PI) 染色,最後以Flow cytometer 進行分析。
6. 吞噬細胞活性:吞噬細胞可以分別測定單核球(monocyte)或是中性白血球的吞噬能力,目前可以分別利用吞噬細菌如E. coli、yeast等方法來加以測定,也可以利用已標記好的E. coli (如螢光),在細胞吞噬後利用螢光流體計數儀來加以分析。
(二) 特異性免疫反應以卵白蛋白(ovalbumin,OV A)(或其他抗原如KLH, keyhole limpet haemocyanin)對老鼠行腹腔注射,以得到抗體生成的曲線圖及時間表。
老鼠在餵食一個月的飲食後,先採血,以作為整個實驗過程的基本值。
開始注射卵白蛋白OV A 致敏老鼠,以得到OV A 特異性IgG 及IgM 的產生。
每隻老鼠注射2μl Complete Freunds Adjuvant入腹腔內,兩週後再腹腔注射6μl Incomplete Fr eunds Adjuvant為追加致敏。
定期採血以追蹤血清中OV A 特異性IgG 及IgM 的濃度。
1. OV A誘發的特異性抗體產生首先以100µl的10µg/ml OV A 覆蓋在ELISA plate 上置放在4℃過夜。
翌日將抗原沖洗乾淨後加上200μl 1% BSA-PBS 來當阻斷性溶液,置於室溫2小時或4℃過夜。
將1% BSA-PBS 沖洗乾淨後加入欲測的血清樣本,置於室溫2小時。
再加入biotin-聯結性兔子對抗老鼠IgG或IgM 抗體,再靜置2小時。
沖洗乾淨後再加入avidin-linked peroxidase,靜置2小時。
最後加入ABTS 顯色劑呈色約30 分鐘,以5% SDS 停止反應後判讀其吸光值。
2. OV A-特異性的T細胞增殖反應將脾臟細胞2x 106/ml 置於96-well plate, 再加入RPMI 培養基或添加有OV A的培養基。
於37℃的CO培養箱兩天後,加入12µCi/well 3H-thymidine,繼續培養20 小時後,以cell harvester 收集細胞於濾紙上,濾紙風乾後,以閃爍計數儀測3H-thymidine 含量,以計算細胞增生能力。
3. OV A-特異性的細胞激素製造將分離出的脾臟及淋巴結細胞以適當濃度(如2x106/ml) 置於24-well 的Plate中,以已知濃度的OV A抗原共同培養來刺激淋巴球。
經過適當時間(24到48小時) 的培養後,取上層液以測定其淋巴介質分泌量。
淋巴介質的測定基本上是利用sandwich-ELISA 法。
簡言之,是先利用一個抗淋巴介質的抗體先覆蓋在ELISA plate 上,在4℃靜置一晚。
在進行實驗前先以1% PBS-BSA 處理,再加以清洗。
然後將欲測定之上清液加到ELISA plate 上,置於室溫2小時後再加入biotin 聯結的抗淋巴介質抗體。
室溫靜置2小時後再加入avidin-linked peroxidase,靜置2小時後,加入受質呈色。
二. 人體的臨床試驗:人體試驗的免疫功能評估,原則上與動物的評估近似,惟進行人體的臨床試驗之前應經過各醫院的人體試驗委員會通過才能加以進行。