实验二 凝胶层析法

一、实验目的本次实验旨在通过凝胶层析技术，对混合溶液中的不同组分进行分离，验证凝胶层析法的原理，并探讨影响分离效果的因素。

二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。

凝胶作为一种具有多孔结构的材料，其孔径大小可以调节，从而实现对不同分子量物质的分离。

实验中，混合溶液中的组分通过凝胶层析柱时，分子量较大的物质由于无法进入凝胶孔道，只能沿着凝胶颗粒之间的缝隙流出，而分子量较小的物质则可以进入凝胶孔道内部，从而在凝胶层析柱中停留更长时间，最终实现分离。

三、实验结果与分析1. 实验现象（1）观察实验过程中，不同组分在凝胶层析柱中的洗脱顺序。

根据实验结果，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出。

（2）观察凝胶层析柱中凝胶颗粒的吸附情况。

实验过程中，凝胶颗粒对分子量较大的组分吸附作用较弱，而对分子量较小的组分吸附作用较强。

2. 实验数据分析（1）通过计算不同组分的洗脱时间，可以得出其分子量大小。

实验结果表明，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出，与理论预期相符。

（2）分析凝胶层析柱中凝胶颗粒的吸附情况，可以发现分子量较小的组分在凝胶层析柱中停留时间较长，说明凝胶颗粒对其吸附作用较强。

四、实验结论1. 凝胶层析法可以有效地对混合溶液中的不同组分进行分离，实现不同分子量物质的分离。

2. 凝胶层析法的分离效果受分子量大小、凝胶孔径、洗脱液等因素的影响。

在本实验中，分子量较大的组分先流出，而分子量较小的组分后流出，与理论预期相符。

3. 凝胶层析柱中凝胶颗粒对分子量较小的组分吸附作用较强，导致其在凝胶层析柱中停留时间较长。

4. 实验过程中，凝胶层析柱的装填、洗脱液的选择、流速的控制等操作对实验结果有较大影响。

在实际操作中，应严格控制实验条件，以提高分离效果。

五、实验展望1. 在今后的实验中，可以尝试改变凝胶孔径、洗脱液等因素，进一步优化实验条件，提高分离效果。

2. 探索凝胶层析技术在生物、医药、化工等领域的应用，为相关领域的研究提供技术支持。

一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理和操作方法。

2. 掌握凝胶层析分离混合物中不同组分的基本技能。

3. 分析实验结果，验证实验原理。

二、实验原理凝胶层析是一种基于分子筛效应的分离技术。

该技术利用凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。

凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛，分子量不同的物质通过凝胶柱的速度也不同。

在凝胶层析实验中，样品被注入凝胶柱，随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱，从而实现分离。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：混合样品、葡聚糖凝胶、洗脱液（如蒸馏水、乙醇等）。

2. 实验仪器：凝胶层析柱、注射器、恒流泵、收集器、滤纸、烧杯等。

四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱，轻轻敲打柱底，使凝胶均匀分布。

2. 洗脱液平衡：将凝胶层析柱放入盛有洗脱液的烧杯中，使凝胶充分浸泡。

3. 样品制备：将混合样品与洗脱液按一定比例混合，制成样品溶液。

4. 注射样品：将样品溶液注入凝胶层析柱。

5. 收集分离组分：随着洗脱液的流动，不同分子量的物质会以不同的速度通过凝胶柱。

将收集器放置在凝胶柱下方，收集分离组分。

6. 分析实验结果：观察收集到的组分，分析实验结果。

五、实验结果与分析1. 分离效果：通过凝胶层析实验，成功分离出混合样品中的不同组分。

2. 分组情况：根据收集到的组分，分析其分子量大小，确定分离效果。

3. 实验原理验证：实验结果表明，凝胶层析能够有效分离混合物中的不同组分，验证了实验原理。

六、实验讨论1. 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理是基于分子筛效应，通过凝胶的孔隙结构，使不同分子量的物质在凝胶柱中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。

2. 影响分离效果的因素：实验过程中，洗脱液的种类、流速、凝胶的孔径等因素会影响分离效果。

在实验中，应严格控制这些因素，以确保分离效果。

3. 实验结果分析：通过分析实验结果，可以了解不同组分在混合样品中的含量和分子量大小，为后续研究提供数据支持。

凝胶层析实验报告一.实验目的:将血红蛋白与鱼精蛋白混合物进行分离二.实验原理:凝胶是一种具有多孔,网状结构的分子筛. 分子量不同通过凝胶柱的速度也不同,利用这种凝胶分子筛对大小不同的分子进行层析分离.当样品溶液通过凝胶柱时,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随着溶剂流动,因此流程较短,向前移动速度快而首先流出层析柱;反之,相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可自由地进出凝胶颗粒的网孔,在向下移动过程中,它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入与逸出,使流量增长,移动速率慢而最后流出层析柱.从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱.这样,经过层析柱,使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离.三.主要仪器和试剂:铁架台层析柱胶管交联葡聚糖凝胶G-50血红蛋白鱼精蛋白混合物(aq)四.操作步骤:1 连接装置:将层析柱固定在铁架台上,保持与水平面垂直,底部与胶管连接.胶管下端置于烧杯中.2 装柱:将尼龙网放入层析柱底部, 使其水平固定;夹住胶管向柱中注水,松手放水,使水流到剩一厘米,让气泡流出,夹住胶管.3 灌胶:将凝胶搅拌均匀,用玻璃棒引流将凝胶溶液一次性倒入层析柱约20ml;夹住胶管片刻,然后打开夹子,让凝胶沉淀约20分钟(凝胶与水分层),当水流至离凝胶约5mm处时,夹住胶管.用玻璃棒取滤纸一片伸入层析柱,放置于凝胶表面之上水面之下,打开夹子,当露出滤纸,关闭夹子.4 加样:用胶头滴管取血红蛋白’鱼精蛋白混合液,滴入层析柱,约两滴.5 洗脱:当待分离混合液渗入滤纸后,加少量水,开夹放水,(水面始终位于滤纸之上),反复两三次;关闭止水夹到入大量水,再开夹.等待分离6 回收:将洗净的凝胶回收以便再次利用五.实验现象:观察看到红色的液体先被分离,流至烧杯中;黄色液体流速很慢,最终流入烧杯.六.结论与分析:结论:血红蛋白分子量比鱼精蛋白分子量大的多,利用分子筛效应先分离出血红蛋白; 使其混合物分离. 分析:。

摘要凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。

凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。

根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。

GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。

本实验用凝胶色谱法对食用油中的甘油三酯进行了分离提取。

关键词：凝胶色谱甘油三酯食用油第一章简介凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。

它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。

对于高分子物质有很好的分离效果。

一、凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。

如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。

如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。

一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。

二、柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。

长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。

三、凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。

自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。

凝胶层析法分离蛋白质实验报告凝胶层析法分离蛋白质实验报告一、实验目的本实验旨在通过凝胶层析法分离蛋白质，掌握凝胶层析法的基本原理和方法，了解凝胶层析在蛋白质分离中的应用。

二、实验原理凝胶层析法是一种基于分子大小不同的分离技术。

它利用凝胶颗粒的孔径大小，将不同大小的分子进行分离。

当蛋白质溶液通过装有凝胶颗粒的层析柱时，不同大小的蛋白质分子会根据其大小分别进入凝胶颗粒的不同孔径，从而实现在一个连续的流洗过程中将不同大小的蛋白质分离开来。

三、实验步骤1.准备实验材料：凝胶颗粒（如Sephadex G-25或G-75）、层析柱、蛋白质样品（如牛血清白蛋白）、缓冲液等。

2.将凝胶颗粒装入层析柱中，注意不要压实，保持颗粒松散。

3.加入缓冲液，使凝胶颗粒充分膨胀。

4.将蛋白质样品加入到层析柱中，注意不要加太多，以免影响分离效果。

5.打开流出口，使缓冲液缓慢流过层析柱，收集流出的溶液。

6.记录每管收集的溶液体积和蛋白质含量，绘制洗脱曲线。

7.收集分离后的蛋白质。

四、实验结果与分析1.洗脱曲线的绘制与分析实验中，随着缓冲液的流过，不同大小的蛋白质分子会依次被洗脱出来。

通过观察每管收集的溶液体积和蛋白质含量，我们可以绘制出洗脱曲线。

洗脱曲线显示了不同大小的蛋白质分子被洗脱出来的时间和顺序。

通过洗脱曲线，我们可以分析不同蛋白质分子的性质和大小。

2.分离效果评估通过比较实验前后的蛋白质样品，我们可以评估凝胶层析法的分离效果。

在凝胶层析法中，不同大小的蛋白质分子被分离出来，从而可以得到多个不同的蛋白质组分。

通过观察每个组分的蛋白质含量和性质，我们可以评估凝胶层析法的分离效果。

五、结论本实验通过凝胶层析法成功地分离了蛋白质样品中的不同组分。

实验结果表明，凝胶层析法是一种有效的蛋白质分离方法。

通过调整凝胶颗粒的孔径大小和缓冲液的成分，可以进一步优化分离效果。

在生物化学、生物工程和生物医药等领域，凝胶层析法被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离和纯化。

凝胶层析法测定蛋白质的分子质量【实验原理】凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。

凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。

但这种“过筛”与普通的过筛不一样。

将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。

在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。

凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose）；人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶（商品名称为Sephadex）的各种交联凝胶，它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。

这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。

在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。

相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。

利用这种性质可分离不同M r的物质。

为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t(total volume)表示。

实际上V t是由V O，V t与V g三部分组成，：V t=V O+V t+V gV o称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；V g为凝胶本身的体积，因此V t-V o.等于V i+V g。

实验二（1）凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白【实验目的】掌握凝胶层析分离蛋白质的基本原理，掌握柱层析的基本操作方法【实验原理】交联葡聚糖凝胶具有多糖网状结构，血红蛋白较鱼精蛋白大：血红蛋白分子量为64500，鱼精蛋白分子量为2000-12000，因此在交联葡聚糖凝胶中鱼精蛋白从胶体分子内部网状结构孔隙中通过，血红蛋白从胶体分子间隙中通过。

血红蛋白走过的路径短且速度快，鱼精蛋白走过的路径长且速度慢。

因此可以在层析柱中观察到红色的血红蛋白先被洗脱出来，而经二硝基氯苯预染呈黄色的鱼精蛋白则在其后被洗脱出来【实验步骤】检查层析装置是否完好→装填层析柱（蒸馏水面应高凝胶面1cm左右）→滴加0.2ml的血红蛋白和鱼精蛋白混合样品→放出一些蒸馏水使样品沉降到凝胶表面→滴加蒸馏水至液面高凝胶2cm→开始洗脱，过程中应不断滴加蒸馏水使液面高度尽量保持不变【实验结果】如图所示：【讨论与分析】1.凝胶层析柱装填时应避免出现气泡，因为气泡会导致血红蛋白的洗脱路径变窄，以至于血红蛋白洗脱速率减慢，从而导致血红蛋白和鱼精蛋白分离不充分；2.为避免凝胶柱装填时出现分层现象，可在再次加入凝胶前轻轻吹打沉淀好的凝胶表面，然后再慢慢补加凝胶。

实验二（2）离子交换层析分离混合氨基酸【实验目的】掌握离子交换层析的基本原理，了解分离混合氨基酸的基本方法【实验原理】天冬氨酸的等电点是2.97，赖氨酸等电点为9.74。

所以先用pH4.2的柠檬酸洗脱时天冬氨酸带负电被洗脱出来，而赖氨酸带正电吸附在阳离子交换树脂上；然后用pH13的NaOH洗脱时赖氨酸带负电，此时之前被吸附在阳离子交换树脂上的赖氨酸就会脱落而被洗脱出来了。

【实验步骤】检查层析装置是否完好→装填层析柱并用柠檬酸洗涤几次阳离子交换凝胶（流动相面始终应高出凝胶面1cm左右）→滴加0.2ml的混合氨基酸样品→放出一些液体使样品沉降到凝胶表面（使流动相液面高出凝胶面0.5cm即可）→滴加柠檬酸至液面高凝胶2cm→开始洗脱并用标记好的试管依次采集7管洗脱液各2ml（过程中不断滴加柠檬酸使液面高度尽量保持不变）→换用NaOH洗脱，同样也采集7管洗脱液各2ml→往洗脱液收集管中分别加入pH为5的乙酸缓冲液和茚三酮溶液各0.5ml→沸水浴10min→570nm测吸光值→绘制层析图并计算分离度【实验结果】时间（试管编号） 1 2 3 4 5 6 7 吸光度A 0.000 0.004 0.695 0.295 0.044 0.014 0.030 时间（试管编号）8 9 10 11 12 13 14 吸光度A -0.003 0.008 0.037 3.010 0.222 0.020 0.039【讨论与分析】由层析图可得Rs=98.4%【讨论与分析】天冬氨酸与赖氨酸洗脱液的吸光度差距较大的原因可能有哪些？答：1.样品取自上清液，氨基酸没有混合均匀，导致洗脱液中氨基酸含量差异较大；2.茚三酮与氨基酸的呈色反应的结果与氨基酸的种类及pH值有关，洗脱液pH值不同，导致茚三酮呈色反应出现了不同的染色结果因而导致了吸光度的差异。

一、实验目的1. 了解凝胶过滤层析的原理及操作步骤。

2. 掌握利用凝胶过滤层析法分离混合物中不同分子量蛋白质的方法。

3. 通过实验验证凝胶过滤层析法在蛋白质分离中的应用。

二、实验原理凝胶过滤层析法，又称分子筛层析法或凝胶过滤法，是一种根据分子大小进行分离的层析技术。

该技术利用凝胶的分子筛特性，将混合物中的不同分子量的物质分离。

凝胶是一种具有多孔结构的物质，孔径大小不一，当混合物通过凝胶层析柱时，大分子物质由于无法进入凝胶孔径，将直接通过层析柱；而小分子物质则可以进入凝胶孔径，从而在层析柱中停留较长时间，实现分离。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质混合物（含有已知分子量的标准蛋白质和未知分子量的蛋白质）- 凝胶层析柱（Sephadex G-75）- 洗脱液（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）- 标准蛋白质（如牛血清白蛋白、卵清蛋白等）- 未知蛋白质样品2. 实验仪器：- 凝胶层析柱架- 凝胶层析柱- 量筒- 离心机- 分光光度计四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将凝胶层析柱垂直放置于凝胶层析柱架上，用洗脱液平衡凝胶层析柱，直至洗脱液颜色清澈。

2. 加样：取一定量的蛋白质混合物，加入凝胶层析柱的顶部，用洗脱液冲洗，直至混合物完全进入层析柱。

3. 洗脱：用洗脱液缓慢冲洗层析柱，收集各部分洗脱液，分别测定其蛋白质含量。

4. 分离：根据洗脱液的蛋白质含量，绘制洗脱曲线，分析不同分子量蛋白质的分离情况。

5. 结果分析：根据标准蛋白质的分子量和洗脱曲线，推测未知蛋白质样品的分子量。

五、实验结果与分析1. 凝胶过滤层析柱平衡后，洗脱液颜色清澈，说明凝胶层析柱已准备就绪。

2. 洗脱过程中，标准蛋白质和未知蛋白质样品的洗脱曲线如下：- 标准蛋白质洗脱曲线：在洗脱曲线中，标准蛋白质的洗脱峰呈对称状，峰面积较大，说明分离效果较好。

- 未知蛋白质样品洗脱曲线：在洗脱曲线中，未知蛋白质样品的洗脱峰位置与标准蛋白质的洗脱峰位置不同，峰面积较小，说明分离效果较差。