紫花苜蓿MsZIP基因超表达载体的构建及转基因苜蓿检测_李燕

紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体的构建及拟南芥转化苏志芳;包阿东;李亚珍【摘要】[目的]构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表达栽体.[方法]根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的一对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,获得MsCOL1基因完整编码区DNA 序列,并将目的片段插入表达载体pBll21的相应位置,构建植物表达载体35S∶∶MsCOL1,再利用农杆菌介导方法将35S∶∶MsCOL1转化到拟南芥中.[结果]分析测序结果显示,所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆.经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因能够顺利表达.[结论]该方法成功构建植物表达载体35S∶∶ MsCOL1,并获得了转基因拟南芥植株.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】3页(P1610-1611,1668)【关键词】紫花苜蓿;拟南芥;转基因;MsCOL1【作者】苏志芳;包阿东;李亚珍【作者单位】河套学院农学系,内蒙古临河015000;河套学院农学系,内蒙古临河015000;河套学院农学系,内蒙古临河015000【正文语种】中文【中图分类】S541+.1有关植物开花时间的分子生物学研究，在模式植物拟南芥上已经进行得相对全面、深入。

在调控拟南芥开花时间的光周期途径中，CONSTANS(CO)基因的表达控制拟南芥感知日照时间的长短，在连接光信号与生物信号过程中起关键性作用，该基因编码一个含有锌指结构的核蛋白[1]。

当植物受到长时间光照时，CO基因的mRNA表达量增加[2]。

CO基因是FT基因[1]和SOC1基因[3]的上游基因，其转录因子能促进植物开花。

在拟南芥开花时间有关基因调控研究中，CO基因突变体能使开花时间延迟，通过调节增加CO基因的表达，可以使FT基因的表达量提高，使植物开花行为提前发生[1]。

但是在CO基因的同源基因COL的表达模式中，功能有所差异。

摘要生物治理是苏打盐碱土治理的有效方法。

紫花苜蓿具有较强的抗盐碱能力，发掘其抗盐碱基因并对其潜在抗性机理进行阐释，有利于高抗碱性紫花苜蓿新品种的培育和在盐碱地生物治理中的综合利用。

AP2/ERFs转录因子家族是一类与盐碱调控密切相关的转录因子，在植物的生长发育、代谢、胁迫应答、信号传导等诸多功能方面发挥着重要作用。

对紫花苜蓿中这类转录因子的研究，将有助于揭示并阐释紫花苜蓿的抗盐碱机理，提供优异的抗盐碱基因，用于作物的抗盐碱育种。

本研究克隆了紫花苜蓿MsERF003基因。

该基因拥有长度为570bp的开放阅读框，编码190个氨基酸残基。

该基因与来自蒺藜苜蓿MtERF003同源基因同源性为98.84%。

通过qPCR法对其在碳酸盐胁迫下的表达模式进行了分析，发现该基因在各个器官中的表达量均有上调，在根和茎中上调尤为明显。

我们构建了MtERF003启动子驱动的GUS基因表达载体，转入烟草中，获得了转基因植株。

GUS染色分析表明，该基因的启动子为在烟草中是根特异性表达启动子，且只在碳酸盐胁迫下发挥作用。

我们构建了过MsERF003-GFP融合表达载体，通过瞬时表达对其亚细胞定位进行了分析。

结果表明MsERF003只定位于在细胞核中。

我们构建了MsERF003基因植物表达载体，并导入到烟草基因组中，获得了转基因植株，且对T1代植株进行抗盐碱性评估。

结果表明在1.2%碳酸盐处理的8天后，非转基因植株已经萎蔫枯黄，而转基因植株则长势良好；在处理的过程中，转基因植株的总糖含量、脯氨酸含量、CAT含量、APX含量、POD含量和Na+/K+比显著高于非转基因组，对照组丙二醛含量的显著高于转基因组，叶绿素含量的降解速度明显快于转基因组；抗逆响应基因表达分析表明，在处理后期转基因植株的抗逆效应基因的表达量都高于对照组。

以上数据表明MsERF003基因在在烟草中表达提高了转基因烟草的抗盐碱能力，其可能在紫花苜蓿抗盐碱响应中起着重要的作用。

紫花苜蓿MsMYB2基因的克隆及转化冯子蓉;孙彦;晁跃辉;袁柱;陆继肖【期刊名称】《草地学报》【年(卷),期】2015(023)003【摘要】为获得MsMYB2基因过量表达的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株,利用PCR技术在紫花苜蓿(Medicago sativa)中克隆出MYB2基因并命名为MsMYB2,MsMYB2基因编码区全长834 bp,编码1条长度为278个氨基酸的多肽链.通过DNA重组技术将其与pBI121连接,成功构建了植物表达载体pBI-MsMYB2.通过花序侵染法获得具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植株,并通过PCR 和RT-PCR对目的基因进行检测,结果证明目的基因已整合到拟南芥基因组中并且可以表达,成功获得了MsMYB2基因表达的拟南芥转基因植株.【总页数】6页(P580-585)【作者】冯子蓉;孙彦;晁跃辉;袁柱;陆继肖【作者单位】中国农业大学草地研究所,北京100193;中国农业大学草地研究所,北京100193;北京林业大学林学院,北京100083;中国农业大学草地研究所,北京100193;中国农业大学草地研究所,北京100193【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆、表达分析及遗传转化 [J], 贾会丽;王学敏;郭继承;高洪文;吴欣明;刘建宁;石永红;董宽虎;王运琦2.紫花苜蓿MsHST基因克隆及拟南芥转化 [J], 李奕稹;晁跃辉;康俊梅;杨青川;金洪3.紫花苜蓿MsNAP基因克隆及烟草转化 [J], 晁跃辉;李珊珊;滕珂;许立新;肖国增;郭涛;韩烈保4.紫花苜蓿MsARGOS基因的克隆及对拟南芥的转化 [J], 王梦颖;晁跃辉;丛丽丽;杨青川;康俊梅;张铁军5.紫花苜蓿转录因子基因MsAP_(2)的克隆及转化 [J], 石欣玥;尚骁尧;周玲芳;张铁军;晁跃辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(4): 596−601/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家科技支撑计划项目(2008BADB3B05)和现代农业产业技术体系建设专项资金资助。

*通讯作者(Corresponding authors): 杨青川, E-mail: qchyang66@; 王凭青, E-mail: wang_pq@第一作者联系方式: E-mail: qinzhihui999@Received(收稿日期): 2009-11-10; Accepted(接受日期): 2010-01-07.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00596紫花苜蓿锌指蛋白基因RNAi 表达载体的构建及在苜蓿的转化秦智慧1,2 晁跃辉1 杨青川1,* 康俊梅1 孙 彦3 王凭青2,* 龙瑞才11中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193; 2 重庆大学生物工程学院, 重庆 400030; 3中国农业大学, 北京 100193摘 要: 根据紫花苜蓿锌指蛋白MsZFN 基因(GenBank 登录号为EU624138)序列, 设计两对含有酶切位点的特异性引物, 以紫花苜蓿cDNA 为模板, 分别合成用于构建干扰载体的正反义片段, 将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置, 构建成含有发夹结构的RNAi 载体pART-F-R 。

利用农杆菌介导方法, 将pART-F-R 转化到紫花苜蓿中, 经过PCR 检测, 获得了3株转基因植株。

经过RT-PCR 检测, 证明转基因植株中MsZFN 基因表达量明显低于未转基因的植株。

结果表明, 已构建成功具有发夹结构的RNAi 载体pART-F-R, 它可有效的抑制紫花苜蓿MsZFN 基因。

关键词: 紫花苜蓿; 锌指蛋白; RNAi; 转基因Construction and Transformation of RNAi Vector of MsZFN Gene from Alfalfa (Medicago sativa L.)QIN Zhi-Hui 1,2, CHAO Yue-Hui 1, YANG Qing-Chuan 1,*, KANG Jun-Mei 1, SUN Yan 3, WANG Ping-Qing 2,*, and LONG Rui-Cai 11Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2 Bioengineering College of Chongqing University,Chongqing 400030, China; 3 College of Animal Science and Technology, China Agriculture University, Beijing 100191, ChinaAbstract: On the basis of the sequence of Medicago sativa Zinc Finger Protein (MsZFN ) gene (GenBank accession No. EU624138), two pairs of specific primers containing different enzyme sites were designed. With the template of full-length cDNA, positive-sense strand and antisense strand were obtained, which were separately inserted into the expression vector pART27. The RNAi vector pART-F-R containing a hairpin structure was constructed. Mediated by Agrobacterium tumefaciens , pART-F-R was transformed into alfalfa plants. PCR testing showed that three transgenic plants were obtained. The result of RT-PCR showed that transgenic alfalfas had lower expression level of MsZFN gene than the wild type. These results indicated that the RNAi vector pART-F-R containing a hairpin structure was constructed successfully and highly efficient for the simultaneous silence of MsZFN gene.Keywords: Alfalfa (Medicago sativa L.); Zinc finger protein; RNAi; Transgene近年来的研究表明, 一些小的双链RNA 可以高效、特异地阻断体内特定基因表达, 促使mRNA 降解, 诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为RNA 干扰(RNA interference, 简称RNAi)[1]。

第31卷第12期V o l.31N o.12草地学报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2023年12月D e c.2023d o i:10.11733/j.i s s n.1007-0435.2023.12.006引用格式:李家兴,周丽莹,苑峰,等.紫花苜蓿M s H B1基因的克隆及表达分析[J].草地学报,2023,31(12):3617-3625 L I J i a-x i n g,Z H O U L i-y i n g,Y U A NF e n g,e t a l.C l o n i n g a n dE x p r e s s i o nA n a l y s i so f M s H B1G e n e f r o m M e d i c a g o s a t i v a[J].A c t aA g r e s t i aS i n i c a,2023,31(12):3617-3625紫花苜蓿M s H B1基因的克隆及表达分析李家兴1#,周丽莹2#,苑峰3,刘亚玲3,栾雅琳1,晁跃辉1*(1.北京林业大学草业与草原学院,北京100083;2.北京理工大学生命学院,北京100081;3.内蒙古草业技术创新中心有限公司,内蒙古呼和浩特010010)摘要:H D-Z i p(H o m o l o g o u s s t r u c t u r a lD o m a i n-l e u c i n eZ i p,同源结构域-亮氨酸拉链)蛋白是植物特有的转录因子,其中H B1属于H D-Z I PI亚族㊂通过调节植物体内的内源激素含量变化,H B1转录因子可以提高植物对干旱㊁高盐等不利环境的抵抗能力㊂本文为探究紫花苜蓿H B1基因的生物学功能,采用R T-P C R技术成功克隆了M s H B1基因㊂其编码区长867b p,编码288个氨基酸㊂氨基酸序列分析结果表明,H B1蛋白为不稳定蛋白㊂系统发育树分析表明H B1蛋白与蒺藜苜蓿(M e d i c a g o t r u n c a t u l a)同源蛋白的亲缘关系接近㊂构建M s H B1的原核表达载体,在大肠杆菌B L21中成功诱导紫花苜蓿M s H B1蛋白表达,W e s t e r nB l o t也证实M s H B1蛋白表达成功㊂表达分析显示:M s H B1基因在紫花苜蓿根㊁茎㊁叶中均有表达,在不同发育阶段中,幼嫩的叶片中表达最高㊂M s H B1在N a C l和A B A处理时的基因表达水平升高,推测M s H B1可能在紫花苜蓿高盐等胁迫应答方面发挥着重要的作用㊂关键词:M s H B1基因;紫花苜蓿;表达特征;原核表达中图分类号:S336文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2023)12-3617-09C l o n i n g a n dE x p r e s s i o nA n a l y s i s o f M s H B1G e n e f r o m M e d i c a g o s a t i v aL I J i a-x i n g1#,Z H O U L i-y i n g2#,Y U A NF e n g3,L I U Y a-l i n g3,L U A N Y a-l i n1,C HA O Y u e-h u i1*(1.S c h o o l o fG r a s s l a n dS c i e n c e,B e i j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y,B e i j i n g100083,C h i n a;2.S c h o o l o fL i f eS c i e n c e,B e i j i n gI n s t i t u t e o fT e c h n o l o g y,B e i j i n g100081,C h i n a;3.I n n e rM o n g o l i aP r a t a c u l t u r a lT e c h n o l o g y I n n o v a t i o nC e n t e rC o.,L t d,H o h h o t,I n n e rM o n g o l i a010010,C h i n a)A b s t r a c t:H D-Z i p(H o m o l o g o u s s t r u c t u r a lD o m a i n-l e u c i n eZ i p)p r o t e i n s a r e p l a n t-s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s,a-m o n g w h i c hH B1b e l o n g s t o t h eH D-Z I P I s u b f a m i l y.B y r e g u l a t i n g v a r i a t i o n s i n t h e c o n t e n t o f e n d o g e n o u s h o r-m o n e sw i t h i n t h e p l a n t,t h eH B1t r a n s c r i p t i o n f a c t o r c a ne n h a n c e t h e p l a n t s r e s i s t a n c e t oa d v e r s e e n v i r o n m e n t s s u c h a s d r o u g h ta n dh i g hs a l i n i t y.I nt h i ss t u d y,t oe x p l o r e t h eb i o l o g i c a l f u n c t i o no f t h e H B1g e n e i na l f a l f a (M e d i c a g o s a t i v a),t h e M s H B1g e n ew a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d u s i n g R T-PC R t e c h n o l o g y.I t s c o d i n g r e g i o nw a s867 b p i n l e n g t h,e n c o d i n g288a m i n o a c i d s.A m i n o a c i d s e q u e n c e a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h eH B1p r o t e i nw a s a n u n s t a-b l e p r o t e i n.P h y l o g e n e t i c t r e e a n a l y s i s i n d i c a t e d a c l o s e e v o l u t i o n a r y r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h eH B1p r o t e i n a n d i t s h o m o l o g o u s p r o t e i n i n M e d i c a g o t r u n c a t u l a.T h e p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o r o f M s H B1w a s c o n s t r u c t e d,a n d t h e e x p r e s s i o n o fM s H B1p r o t e i n i n E s c h e r i c h i a c o l i B L21w a s s u c c e s s f u l l y i n d u c e d,w h i c hw a s a l s o c o n f i r m e db y W e s t e r nB l o t.E x p r e s s i o n a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e M s H B1g e n ew a s e x p r e s s e d i n t h e r o o t s,s t e m s,a n d l e a v e s o f a l f a l f a,w i t hh i g h e r e x p r e s s i o n l e v e l s i n y o u n g l e a v e s d u r i n g d i f f e r e n t l e a f d e v e l o p m e n t s t a g e s.T h e g e n e e x p r e s s i o n l e v e l s o f M s H B1i n c r e a s e d u n d e rN a C l a n dA B A t r e a t m e n t.T h e r e f o r e,M s H B1m i g h t p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n r e-s p o n d i n g t o s a l i n i t y s t r e s s i n a l f a l f a.K e y w o r d s:M s H B1g e n e;A l f a l f a;E x p r e s s i o n p a t t e r n;P r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n收稿日期:2023-08-25;修回日期:2023-10-11基金项目:内蒙古草业技术创新中心有限公司项目(C C P T Z X2023B04)资助作者简介:#李家兴(1998-),女,汉族,内蒙古鄂尔多斯人,硕士研究生,主要从事草地植物遗传育种研究,E-m a i l:l j x19981121@b j f u.e d u.c n;#周丽莹(1982-),女,汉族,黑龙江省肇东人,副研究员,主要从事生物技术研究,E-m a i l:z h o u l i y i n g082173@163.c o m;*通信作者A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e,E-m a i l:c h a o y u e h u i@b j f u.e d u.c n草地学报第31卷H B1基因属于同源异性盒(H o m e o b o x,H B)蛋白家族,它含有典型的H D-Z i p转录因子结构,由同源异型域(H o m e o d o m a i n,H D)与亮氨酸拉链(L e u c i n eZ i p p e r,L Z)结构域共同构成㊂它们之间形成的稳定空间结构及两者之间的相互作用共同决定了该类蛋白作为转录因子的功能,如D N A结合特异性㊁信号传导㊁生物和非生物胁迫的调控诱导等[1-2]㊂S e s s a等[3]通过H D-Z i p蛋白与D N A结合的方法,从拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)中分离了第一个H D-Z i p I亚族转录因子A t H B1,发现其主要参与植物叶片发育及植物对胁迫的应答㊂随后,H B1基因在向日葵(H e l i a n t h u s a n n u u s)[4]㊁棉花(G o s s y p i u ms p p)[5]㊁玉米(Z e am a y s)[6]㊁大麦(H o r d e u mv u l g a r e)[7]㊁黄花苜蓿(M e d i c a g o f a l c a-t a)[8]等多种植物中相继被发现并开展了相关的研究㊂向日葵在低温的条件下诱导并积累H a H B1蛋白质,通过提高细胞膜稳定性来抵御低温胁迫[4]㊂在干旱㊁盐胁迫条件下,棉花通过提高G h-H B1基因的表达,参与A B A生物合成,提高了植物A B A含量,进而增强了植物对干旱和高盐的抵抗能力[5]㊂H B1转录因子可以抑制转基因蒺藜苜蓿的发育,通过减少根系表面暴露进而提高植物耐盐性[9]㊂而紫花苜蓿研究发现,紫花苜蓿M s H B7基因能够通过降低A B A响应基因(M s A-B I1和M s S n R K2.6)和抗氧化酶编码基因(M s p x-d C和M s C a t a l a s e4)的表达,进而降低紫花苜蓿耐盐性[10]㊂作为一种优质的豆科牧草植物,紫花苜蓿营养价值丰富,粗蛋白含量高,含有多种维生素和微量元素等,适合作为饲料喂养家畜,增加畜产品产量[11-12]㊂现在土地季节性干旱㊁土壤中盐碱含量过高等问题严重限制了紫花苜蓿的种植,影响了紫花苜蓿的产量和品质[13-14]㊂因此,深入探索并发掘抗逆响应基因㊁通过转基因技术获得高抗逆能力的紫花苜蓿新品系,已成为紫花苜蓿分子育种的一个重要途径㊂植物激素脱落酸是植物响应胁迫信号转导的主要成员,对植物生长发育的多个环节起到调节作用,如抑制生长和抵抗逆境等方面[15]㊂杨跃霞等[16]研究证明了外源A B A可以增强紫花苜蓿耐盐性㊂同时,李波等[17]研究发现在盐胁迫的条件下,通过外施A B A可以降低紫花苜蓿幼苗的R O S积累,提高抗氧化酶活性㊂魏天娇等[18]发现A B A积累能够诱导盐胁迫相关基因的表达,从而提高紫花苜蓿对盐碱胁迫的耐受性㊂王英哲等[19]研究发现,通过外施A B A可以提高紫花苜蓿幼苗体内的可溶性糖和游离脯氨酸的含量,提高紫花苜蓿的耐寒性㊂因此,通过喷施外源A B A在紫花苜蓿抗旱㊁抗盐和抗寒等生理过程中起着重要作用㊂本文成功克隆紫花苜蓿M s H B1基因,进行了生物信息学分析,原核表达及基因表达特征分析㊂探讨紫花苜蓿M s H B1基因时空差异㊁激素诱导或盐胁迫下表达特征,为后续研究M s H B1基因的功能提供了依据㊂1材料与方法1.1植物材料、试剂及仪器本试验的紫花苜蓿品种为保定苜蓿,保存于北京林业大学草业与草原学院实验室;基质为草炭㊁蛭石㊁珍珠岩,体积比为3ʒ3ʒ1,光周期为14h/10h (日/夜),温度为24ħ,湿度为64%㊂大肠杆菌B L21㊁D H5α感受态细胞购于天根生化科技(北京)有限公司;克隆载体p M D19-T㊁原核表达载体p C o l d-S u m o2㊁植物总R N A提取试剂盒㊁反转录试剂盒㊁P C R纯化试剂盒㊁质粒小提试剂盒㊁P C R产物纯化试剂盒㊁P r i m e S T A R MA X及限制性内切酶购于T a K a R a公司;D L5000D N A M a r k e r购于湖南艾科瑞生物工程有限公司;彩色预染蛋白M a r k e r (10~170k D)购于上海碧云天生物技术有限公司㊂抗体A n t i-s t r e p t a gⅡm o u s em o n o c l o n a l a n t i b o d y 和H R P-c o n j u g a t e d g o a tA n t i-m o u s e I g G购于生工生物工程(上海)股份有限公司;植物激素A B A㊁6-B A㊁G A3和I A A购于S i g m a公司㊂水平电泳仪(W i d eM i n i-S u bC e l lG TC e l l)㊁凝胶电泳成像系统(C h e m i D o c T M X R S+S y s t e m)和超灵敏化学发光成像仪(C h e m i D o c T M I m a g i n g S y s t e m)均购于B i o-R a d 公司㊂1.2试验方法1.2.1M s H B1基因克隆收集成熟期紫花苜蓿叶片,置于研钵中,加入液氮充分研磨,使用植物总R N A提取试剂盒提取紫花苜蓿总R N A,利用反转录试剂盒得到第一链c D N A㊂以紫花苜蓿c D N A为模板,M s H B1-F和M s H B1-R为引物,利用P r i m e-S T A R MA X进行P C R扩增目的基因,程序为98ħ10s,55ħ15s,72ħ30s,30个循环;72ħ5m i n㊂P C R产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后,连接至克8163第12期李家兴等:紫花苜蓿M s H B1基因的克隆及表达分析隆载体p M D19-T㊂连接产物转化至大肠杆菌D H5α感受态细胞,涂布于含有氨苄青霉素的L B固体培养基上,挑取单克隆菌落进行P C R鉴定,将含有正确条带的单克隆菌落送至北京睿博兴科生物公司测序,对测序结果进行比对和分析,将测序正确的克隆载体命名为p M D-H B1㊂1.2.2引物设计基于公布的紫花苜蓿基因组数据[20],通过软件P r i m e rP r e m i e r5.0进行引物设计(表1)㊂其中,M s H B1-F和M s H B1-R用于M s HB1基因克隆,p C o l d-H B1-F和p C o l d-H B1-R用于原核表达载体构建,M s H B1-R T-F和M s H B1-R T-R用于M s HB1基因荧光定量检测,M s A c t i n-F和M s A c t i n-R用于内参基因A c t i n荧光定量检测㊂表1引物序列T a b l e1 P r i m e r s e q u e n c e s引物名称P r i m e rN a m e序列(5'-3') S e q u e n c e(5'-3')M s H B1-F G A A G T T G A A A A A A T G G A G T C T G G T CM s H B1-R T T A T G C A A C A T A A T A C A T A T T A C C C A C C A A T p C o l d-H B1-F A A A C C A C T C C A C T G C G T C G T C T Gp C o l d-H B1-R G T G T C T T A G A T T C T A G G G A CM s H B1-R T-F A T G G A G T C T G G T C G T C T T T A C T T T GM s H B1-R T-R T C C C A C G A C A A G C A G A A GM s A c t i n-F T G A T C T G G C T G G T C G T G A C C T T AM s A c t i n-R A T G C C T G C T G C T T C C A T T C C T A T 1.2.3M s H B1生物信息学分析通过N C B I(h t-t p s://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/)对M s H B1蛋白保守结构域进行分析预测,通过S O P MA(h t t p s:// p r a b i.i b c p.f r/h t m/s i t e/w e b/h o m e)和S w i s s-M o d-e l(h t t p s://s w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/)分别对M s H B1蛋白进行二级㊁三级结构的预测,根据E x-P A S y数据库(h t t p://e x p a s y.o r g/)进行蛋白理化性质分析㊂采用S i g n a l P5.0(h t t p s://s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/S i g n a l P-5.0/)进行蛋白质信号肽的预测,利用M E G A7.0软件构建系统发育树㊂通过T MHMM-2.0网址(h t t p s://s e r v-i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/T MHMM-2.0/)进行蛋白质跨膜结构预测,在C e l l-P L o c网站上(h t-t p://w w w.c s b i o.s j t u.e d u.c n/b i o i n f/C e l l-P L o c/)进行亚细胞定位预测㊂1.2.4M s H B1原核表达载体构建使用质粒小提试剂盒提取p M D-H B1质粒,以质粒为模板, p C o l d-H B1-F和p C o l d-H B1-R为引物,进行P C R 扩增,程序为98ħ10s,55ħ15s,72ħ30s,30个循环;72ħ5m i n㊂P C R产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析,对P C R产物进行纯化回收,将纯化后的P C R产物连接至限制性内切酶N c o I处理后的原核表达载体p C o l d-S u m o2㊂连接产物转化至大肠杆菌B L21感受态细胞,涂在含有氨苄青霉抗性的L B固体培养基上㊂挑取单菌落进行P C R鉴定,将含有正确条带的单克隆菌落送至生物公司测序,将测序正确的质粒命名为p C o l d-H B1㊂1.2.5 M s H B1蛋白原核表达挑取含有p C o l d-H B1单克隆菌落,摇菌培养至O D600=0.6,分别加入终浓度为0.1,0.2,0.5m m o l㊃L-1的I P T G, 14ħ低温诱导14h㊂将大肠杆菌样品,使用离心机5000r㊃m i n-1离心10m i n,弃掉上清,加入5 m L的1ˑP B S(p H=7.4)充分重悬菌液㊂吸取100μL重悬菌液,混入20μL的8m o l㊃L-1尿素溶液,99ħ加热10m i n后,将蛋白样品经S D S-P A G E电泳后,使用考马斯亮蓝染色㊂为分离可溶性蛋白和非可溶性蛋白,利用细胞破碎仪,设置功率60%,破碎15m i n,使用离心机12000r p m分离出上清和沉淀㊂将收集的上清与沉淀样品,经S D S-P A G E电泳后,使用考马斯亮蓝染色,分析蛋白质的表达情况㊂对S D S-P A G E电泳后的样品,进行转膜,以A n t i-s t r e p t a gⅡm o u s em o n o c l o n a l a n t i b o d y单克隆抗体为一抗,H R P-c o n j u g a t e d g o a t A n t i-m o u s e I g G为二抗,进行W B分析,使用超灵敏化学发光检测仪进行拍照观察㊂1.2.6M s H B1表达分析为分析不同组织及发育阶段的M s H B1基因表达水平,选取长势一致的紫花苜蓿植株,选取根㊁茎㊁叶三个组织部位,成熟和衰老叶片;100m m o l㊃L-1的N a C l溶液处理紫花苜蓿样品,用于分析M s H B1基因盐胁迫响应;为了分析不同激素对M s H B1表达的影响,对紫花苜蓿植株分别喷施50μm o l㊃L-1A B A㊁10μm o l㊃L-16-B A㊁50μm o l㊃L-1G A3㊁10μm o l㊃L-1I A A,并在0,0.5,1,2,4,6,8,12,24h这9个不同的时间点进行取样㊂将收集的样品液氮速冻处理后放至-80ħ冰箱储存㊂使用植物总R N A提取试剂盒对样品进行总R N A提取,并反转录为第一链c D N A㊂以M s H B1-R T-F和M s H B1-R T-R为引物,M s A c t i n 为内参基因,进行荧光定量P C R检测㊂所有样品均设置3个生物学重复,根据2-әәC t法[21]使用E X-C E L2010进行数据初步处理并作图,使用S P S S(26.0)软件进行单因素方差分析㊂9163草 地 学 报第31卷2 结果与分析2.1 M s H B 1基因克隆以紫花苜蓿c D N A 为模板,M s H B 1-F 和M s H B 1-R 为引物进行P C R 扩增,P C R 产物经琼脂糖凝胶电泳分析,在750~1000b p 位置存在一条单一㊁清晰D N A 条带(图1)㊂将上述产物,送至生物公司测序,测序结果显示:该D N A 含有完整的紫花苜蓿M s H B 1基因编码区㊂将该D N A 序列转化为氨基酸序列后显示:紫花苜蓿M s H B 1与蒺藜苜蓿M t H B 1蛋白质的氨基酸序列有高达99%的相似,仅有一个氨基酸的差异(图2)㊂图1 紫花苜蓿M s H B 1基因的克隆F i g .1 C l o n i n g of M s H B 1g e n e f r o ma l f a l f a 注:M ,M B 5000D N A M a r k e r ;1,M s H B 1基因N o t e :M ,M B 5000D N A M a r k e r ;1,M s H B 1g e ne图2 蒺藜苜蓿与紫花苜蓿H B 1的氨基酸序列对比F i g .2 C o m p a r i s o no f a m i n o a c i d s e q u e n c e s o fH B 1b e t w e e n M e d i c a go t r u n c a t l a a n da l f a l f a 2.2 生物信息学分析M s H B 1基因编码区为864b p,共编码288个氨基酸(图3A ),M s H B 1蛋白的分子式为C 1442H 2244N 398O 471S 12,分子量为47.654K D a ,理论等电点为4.77㊂根据保守域结构分析可知H B 1属于H D -Z I P 家族,在65位到120位氨基酸之间含有H o m e -b o x 的保守结构域(图3B )㊂M s H B 1蛋白质二级结构分析显示:其蛋白含有39.93%的α-螺旋和4.86%的β-转角(图3C );蛋白质的三级结构分析显示:其蛋白质主要由自由螺旋和环构成(图3D )㊂蛋白质信号肽预测显示,M s H B 1蛋白无信号肽,亚细胞定位预测显示,M s H B 1定位于细胞核㊂M s H B 1蛋白不稳定指数为69.35,推测其为不稳定蛋白,平均亲水指数为-0.755,推测其为亲水性蛋白㊂利用M E G A 7.0软件系统绘制不同植物的H B 1蛋白系统发育进化树,结果显示紫花苜蓿H B 1蛋白与蒺藜苜蓿同源蛋白亲缘关系最近(图4),其次是红三叶(T r i fo l i u m p r a t e n s e )㊂2.3 M s H B 1原核表达将含有p C o l d -H B 1质粒的大肠杆菌B L 21,涂布于含有氨苄青霉素抗性的L B 固体培养基上㊂挑取固体培养基上生长大小一致的单克隆菌落,引物为p C o l d -2f 和p C o l d -r 进行P C R 扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测所选大肠杆菌均能扩增出目标大小的D N A 条带(图5)㊂经生物公司测序显示:该载体含有正确序列的M s H B 1基因,无碱基突变㊁无移码突变,表明M s H B 1原核表达载体构建成功,可以用于后续的试验㊂263第12期李家兴等:紫花苜蓿M s H B 1基因的克隆及表达分析图3 紫花苜蓿M s H B 1序列及结构分析F i g .3 S e q u e n c e a n d s t r u c t u r e a n a l ys i s o f M s H B 1f r o ma l f a l f a 注:(A )M s H B 1基因D N A 序列和氨基酸序列;(B )M s H B 1蛋白保守结构域预测;(C )M s H B 1蛋白二级结构预测;(D )M s H B 1蛋白三级结构预测N o t e :(A )D N Aa n d p r o t e i n s e q u e n c e s o f M s H B 1g e n e ;(B )P r e d i c t i o n o f c o n s e r v a t i o n d o m a i n o fM s H B 1;(C )S e c o n d a r ys t r u c t u r e p r e d i c t i o n o fM s H B 1p r o t e i n ;(D )T e r t i a r y st r u c t u r e p r e d i c t i o no fM s H B 1p r o t e in 图4 M s H B 1蛋白进化树分析F i g .4 E v o l u t i o n a r y t r e e a n a l ys i s o fM s H B 1p r o t e i n s 1263草 地 学 报第31卷图5 p C o l d -H B 1鉴定F i g.5 I d e n t i f i c a t i o no f p C o l d -H B 1注:M ,M B 5000D N A M a r k e r ;1~3,pC o l d -H B 1质粒N o t e :M ,M B 5000D N A M a r k e r ;1~3,pC o l d -H B 1p l a s m i d 经诱导后,提取大肠杆菌表达产物,经SD S -P A GE 电泳后,进行考马斯亮蓝染色,发现使用三种不同浓度的I P T G 诱导后,大肠杆菌能够表达一个约45K D a 的蛋白,而未经诱导的大肠杆菌不能表达该蛋白(图6)㊂该结果初步显示了紫花苜蓿M s H B 1表达成功㊂图6 M s H B 1蛋白诱导前后的S D S -P A G E 检测F i g.6 S D S -P A G Ed e t e c t i o no fM s H B 1p r o t e i n b e f o r e a n da f t e r i n d u c t i o n注:M ,彩色预染M a r k e r (10~170k D );1,未诱导蛋白;2,0.1m m o l ㊃L -1I P T G 诱导蛋白;3,0.2m m o l ㊃L -1I P T G 诱导蛋白;4,0.5m m o l ㊃L -1I P T G 诱导蛋白;方框,目标蛋白N o t e :M ,c o l o u r p r e -s t a i n e d M a r k e r (10~170k D );1,u n i n d u c e d p r o -t e i n ;2,0.1m m o l ㊃L -1I P T G -i n d u c e d p r o t e i n ;3,0.2m m o l㊃L -1I P T G -i n d u c e d p r o t e i n ;4,0.5m m o l ㊃L -1I P T G -i n d u c e d p r o t e i n ;B o x ,t a r ge t p r o t e i n 为分析表达的蛋白质的可溶性,分别将诱导后的菌液样品利用细胞破碎仪进行破碎,分离上清和沉淀㊂经S D S -P A G E 电泳㊁考马斯亮蓝染色后,发现三种不同浓度的I P T G 诱导的大肠杆菌中均存在淀有明显的条带对比,其沉淀中含有存在的目标蛋白大约在45K D a 左右,0.1m m o l ㊃L -1I T -P G 与0.2m m o l ㊃L -1㊁0.5m m o l ㊃L -1浓度相比,其对M s H B 1的诱导能力更强(图7,8)㊂图7 M s H B 1蛋白诱导后沉淀S D S -P A G E 检测F i g .7 S D S -P A G Ed e t e c t i o no f p r e c i pi t a t i o n f o rM s H B 1pr o t e i na f t e r i n d u c t i o n 注:M ,彩色预染M a r k e r (10~170k D );1,0.5m m o l ㊃L -1I P T G 诱导沉淀蛋白;2,0.2m m o l ㊃L -1I P T G 诱导沉淀蛋白;3,0.1m m o l㊃L -1I P T G 诱导沉淀蛋白;4,未诱导沉淀蛋白;方框,目标蛋白N o t e :M ,c o l o u r p r e -s t a i n e d M a r k e r (10~170k D );1,0.5m m o l㊃L -1I P T G -i n d u c e d p r e c i p i t a t e d p r o t e i n ;2,0.2m m o l ㊃L -1I P T G -i n d u c e d p r e -c i p i t a t e d p r o t e i n ;3,0.1m m o l ㊃L -1I P T G -i n d u c e d p r e c i pi t a t e d p r o t e i n ;4,u n i n d u c e d p r e c i p i t a t e d p r o t e i n ;B o x ,t a r ge t p r o t e in 图8 M s H B 1蛋白诱导后上清S D S -P A G E 检测F i g .8 S D S -P AG Eo f s u pe r n a t a n t af t e r i n d u c t i o no f M s H B 1p r o t e i n图8:M ,彩色预染M a r k e r (10~170k D );1,未诱导上清蛋白;2,0.1m m o l ㊃L -1I P T G 诱导上清蛋白;3,0.2m m o l ㊃L -1I P T G 诱导上清蛋白;4,0.5m m o l ㊃L -1I P T G 诱导上清蛋白;方框,目标蛋白F i g.8:M ,c o l o u r p r e -s t a i n e d M a r k e r (10-170k D );1,u n i n d u c e ds u -p e r n a t a n t p r o t e i n ;2,0.1m m o l ㊃L -1I P T G -i n d u c e d s u p e r n a t a n t pr o -t e i n ;3,0.2m m o l ㊃L -1I P T G -i n d u c e ds u p e r n a t a n t p r o t e i n ;4,0.5m m o l ㊃L -1I P T G -i n d u c e d s u p e r n a t a n t p r o t e i n ;B o x ,t a r ge t p r o t e i n 选I P T G 表达量含量高的0.1m m o l㊃L -1I P T G 沉淀诱导蛋白进行W e s t e r nB l o t 杂交检测,0.1m m o l ㊃L -1浓度下诱导的蛋白有条带显示(图9),与S D S -P A G E 考马斯亮蓝染色结果大小一致,0.1m m o l ㊃L -1I P T G 浓度下原核蛋白成功表达㊂2263第12期李家兴等:紫花苜蓿M s H B 1基因的克隆及表达分析图9 M s H B 1蛋白原核表达的W e s t e r nB l o t 检测F i g .9 W e s t e r nB l o t d e t e c t i o no f p r o k a r y o t i c e x pr e s s i o n o fM s H B 1p r o t e i n注:1~2,0.1m m o l ㊃L -1I P T G 诱导沉淀蛋白样品;3,未诱导蛋白对照N o t e :1~2,0.1m m o l ㊃L -1I P T Gi n d u c e d p r e c i pi t a t e d p r o t e i ns a m -pl e s ;3,u n i n d u c e d p r o t e i n c o n t r o l 2.4 M s H B 1不同组织及发育时期表达分析为分析M s H B 1基因在紫花苜蓿根㊁茎㊁叶中的表达差异,对M s H B 1进行荧光定量R T -P C R 检测,M s H B 1基因在根㊁茎㊁叶中均有表达,而M s H B 1基因在叶中表达水平略高,茎中表达水平最低(图10)㊂收集不同发育时期紫花苜蓿叶片,进行M s H B 1荧光定量R T -P C R 检测,结果显示:M s H B 1在不同的叶片发育时期也存在差异,其中幼嫩叶片中的表达量最高,成熟和衰老叶片中的表达量低(图11)㊂图10 M s H B 1基因不同组织的表达分析F i g .10 E x p r e s s i o na n a l ys i s o f M s H B 1ge n e i nd if f e r e n t t i s s u e s 注:不同小写字母表示差异显著(P <0.05)㊂下同N o t e s :D i f f e r e n t l o w e r c a s el e t t e r s i n d i c a t es i gn i f i c a n td i f f e r e n c e sa t t h e 0.05l e v e l .T h e s a m e a s b e l o w2.5 M s H B 1基因对盐胁迫及外施激素响应对不同盐胁迫的样品,进行荧光定量R T -P C R 分析,结果显示:经过N a C l 处理后,与未处理相比,紫花苜蓿中H B 1基因的表达水平提升,其中,在6h 达到高峰,随后逐渐下降,但经24h 处理后,表达水平依为对照水平的1.85倍㊂因此,M s H B 1基因参与N a C l 胁迫应答(图12)㊂图11 M s H B 1基因叶片不同发育阶段的表达分析F i g .11 E x p r e s s i o na n a l ys i s o f M s H B 1g e n e i n l e a v e s a t d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a ges 图12 紫花苜蓿M s H B 1基因的盐胁迫表达F i g .12 E x pr e s s i o no f t h e M s H B 1g e n e i na l f a l f a u n d e r s a l t s t r e s s对植物喷施不同激素,分别在不同时间点采样,进行荧光定量R T -P C R 分析,外源A B A 使M s H B 1基因的表达水平呈先上升趋势,在6h 达到顶峰,之后基因表达量缓慢下降,与对照相比,M s H B 1仍呈现较高水平,经A B A 处理24h 基因表达水平为对照的2.11倍(图13A );外施G A 3后4h 内,M s H B 1基因表达变化并不显著,但在6h 后开始呈现上升的趋势,在12h 时短暂下降,与对照样品相比仍具有一定的上升趋势,在24h 后到达顶峰,是对照样品的8倍(图13B );外源6-B A 使M s H B 1基因呈现先上升后下降的趋势,但M s H B 1表达水平变化并不太大,在4h 达到顶峰,仅为对照样品的1.38倍,但在24h 表达水平最低,为对照样品的0.34倍(图13C );外源施加I A A 使M s H B 1短时间内快速下降,随后缓慢上升(图13D )㊂3263草地学报第31卷图13外源激素对紫花苜蓿M s H B1的表达F i g.13 A n a l y s i s o f t h e e x p r e s s i o no f M s H B1i na l f a l f ab y e x o g e n o u sh o r m o n e s3讨论植物在生长发育过程中可能会受到各种不利环境因素的影响,如干旱㊁低温㊁高盐等非生物因子胁迫㊂植物抗逆过程如其他生理过程一样,当植物受到逆境胁迫时,植物能够采取相应的策略来应对胁迫,在长期适应环境中也演化出了相应的一套复杂的防御网络机制[22-23]㊂脱落酸在整合各种胁迫信号和调控下游胁迫反应方面发挥重要作用,在生物和非生物胁迫过程中扮演着关键角色[24]㊂L e c h n e r 等[25]研究发现拟南芥中I类H D-Z i p转录因子A T H B6是A B A反应的负调控因子,能够通过与MA T H-B T B蛋白直接结合,进而引发蛋白泛素化过程㊂此外,V a l d e's等[26]发现拟南芥中另外两个H D-Z i p转录因子基因A TH B7和A TH B12的转录调控依赖于2C型蛋白磷酸酶(P P2C)的活性,而P P2C S在A B A信号传导过程中起着重要的调控作用,同时,A t H B7和A t H B12蛋白的结合可以抑制编码A B A受体基因的转录㊂为深入发掘H B1基因的功能及A B A调控H B1转录因子网络机制提供基础,本试验成功构建M s H B1-p C o l d-S u m o2载体,其与p E T载体骨架相似,并转入大肠杆菌B L21中诱导表达,通过W e s t e r nB l o t验证M s H B1蛋白表达成功,约为45K D a左右㊂本研究与紫花苜蓿M s I P T和M s D R E B1原核表达结果一致[27-28],为后续蛋白纯化以及纳米抗体的制作提供了抗原㊂H D-Z I P的I类转录因子能够参与逆境为胁迫或响应激素诱导,尤其响应A B A信号,该家族的基因随着A B A含量的变化而表达水平会发生变化[29-30]㊂通过生物信息学对M s H B1蛋白进行分析,构建系统发育树可知,紫花苜蓿M s H B1蛋白与蒺藜苜蓿同源蛋白亲缘关系最近,其次是红三叶㊂通过M s H B1表达分析可知,M s H B1在根茎叶中均有表达,推测M s H B1基因在根㊁茎㊁叶中均能发挥作用,且参与了植物的生长发育㊂蒺藜苜蓿H D Z i p-I亚族转录因子H B1在主根和侧根分生组织中表达,通过参与根部分生组织中A B A和辅酶信号的复杂相互作用,进而调控侧根的生长[9],拟南芥A t h H B1主要调控叶片的生长与发育[31],番茄L e H B1则参与调控花发育及果实成熟调控[32]㊂因此,进一步说明在不同物种中的H B1的表达部位以及功能可能存在一定的差异性㊂在盐胁迫和A B A的处理下,M s H B1表达量明显提高,推测M s H B1可能参与盐胁迫和A B A信号传导进程㊂这与H B1基因在棉花[5]㊁水稻[29]的表达模式下十分相似㊂此外,M s H B1可能参与其他激素途径,如外源G A3,6-B A,I A A均能引起紫花苜蓿的M s H B1基因表达改变㊂本研究为此后关于M s H B1基因表达功能的研究提供了依据,关于M s H B1深入的生物功能以及调控机制,需进一步探索㊂4结论本研究克隆了紫花苜蓿M s H B1基因,M s H B1的开放阅读框867b p,编码了288个氨基酸,利用原4263第12期李家兴等:紫花苜蓿M s H B1基因的克隆及表达分析核体系成功表达出M s H B1蛋白;M s H B1基因在紫花苜蓿根茎叶中均有表达,但茎的基因表达量低于根和叶的表达量;M s H B1参与A B A和N a C l的应答过程,G A3的能够提高M s H B1表达水平,而6-B A㊁I A A则会降低M s H B1表达,表明紫花苜蓿M s H B1基因参与多种激素信号传导途径㊂参考文献[1] S C H E N A M,D A V I SR W.H D-Z i pp r o t e i n s:m e m b e r so f a nA r a b i d o p s i s h o m e o d o m a i n p r o t e i ns u p e r f a m i l y[J].P r o cN a t lA c a dS c iUSA,1992,89(9):3894-3898[2] MO E N SCB,S E L L E R IL.H o x c o f a c t o r s i nv e r t e b r a t ed e v e l-o p m e n t[J].D e v e l o p m e n t a l B i o l o g y,2006,291(2):193-206 [3] S E S S AG,MO R E LL IG,R U B E R T I I.T h eA t h 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紫花苜蓿基因组测序及分析近年来，随着基因组测序技术的不断发展越来越多的植物基因组序列得到完善。

通过基因组测序，可以系统地解析植物基因功能。

紫花苜蓿具有优良的农艺性状，是全世界种植范围最广的牧草作物，具有“牧草之王”的美称。

在我国，紫花苜蓿生长主要集中在北方地区，这些地区气候寒冷，容易发生低温冻害，造成苜蓿减产，大大降低苜蓿的生产效益。

肇东苜蓿作为紫花苜蓿的地方品种之一，具有良好的抗寒特性。

因此，本研究以肇东苜蓿为主要研究材料，进行基因组测序、组装及注释，获得基因组草图；对其它四种紫花苜蓿品种：阿尔冈金、WL168 WL52侪日WL44列行基因组重测序，挖掘抗寒相关的SNP同时，对紫花苜蓿AP2/ERF^录因子进行挖掘分析，构建紫花苜蓿AP2/ERF 基因调控网络，系统的解析紫花苜蓿AP2/ERF转录因子在抗寒胁迫中的调控机制。

主要研究成果如下：1.紫花苜蓿全基因组组装及注释分析通过高通量测序，评估紫花苜蓿基因组大小为1107"右，杂合率为1.77%，通过组装获得紫花苜蓿基因组草图。

进一步注释分析，挖掘119194个蛋白质编码基因，它们主要的功能集中在信号转导机制、蛋白质翻译后修饰、防御机制以及转录调控等生物过程。

2.紫花苜蓿抗寒性状相关遗传变异的挖掘通过四个紫花苜蓿品种进行基因组重测序，发掘紫花苜蓿品种间的遗传变异(SNP)，获得8909604个遗传变异；结合5个紫花苜蓿品种的抗寒性数据，挖掘82838个SNP与紫花苜蓿抗寒性状形成相关。

这些SN吩布在14372个基因上，它们主要涉及转录调控、还原代谢和信号转导等过程。

进一步富集分析发现，AP2/ERF、bHLH MADS NAC MY以及WRKY 等基因家族可能在紫花苜蓿抗寒过程中起关键调控作用3.紫花苜蓿AP2/ERF^录因子分子调控机制研究对紫花苜蓿全基因组进行分析，发掘了139个AP2/ERF^录因子，其成员分布在3个业家族中；挖掘紫花苜蓿与模式植物拟南芥的基因互作关系,构建紫花苜蓿的基因调控网络,系统的解析紫花苜蓿的分子调控网络，将来为紫花苜蓿基因资源的利用奠定了理论基础。

《利用转基因技术创建紫花苜蓿耐盐新种质的研究》篇一一、引言随着全球气候的变化和人类活动的加剧，土壤盐渍化问题日益严重，对农业生产造成了巨大的威胁。

紫花苜蓿作为一种重要的牧草和绿肥作物，其耐盐性的提高对于改善盐碱地的利用和农业可持续发展具有重要意义。

近年来，转基因技术的发展为作物耐盐性的改良提供了新的途径。

本研究旨在利用转基因技术创建紫花苜蓿耐盐新种质，以提高紫花苜蓿在盐渍化土壤中的生长和产量。

二、材料与方法1. 材料本研究所用材料为紫花苜蓿的基因组DNA及相关的耐盐基因。

2. 方法（1）耐盐基因的筛选与克隆：从已知的耐盐基因库中筛选出与紫花苜蓿耐盐性相关的基因，进行克隆和序列分析。

（2）转基因载体的构建：将克隆得到的耐盐基因与植物表达载体连接，构建转基因载体。

（3）紫花苜蓿的遗传转化：采用农杆菌介导法将转基因载体导入紫花苜蓿的基因组中，获得转基因紫花苜蓿。

（4）转基因紫花苜蓿的筛选与鉴定：通过PCR、Southern blot等方法对转基因紫花苜蓿进行筛选和鉴定，确认外源基因的整合及表达情况。

（5）耐盐性评价：在盐渍化土壤条件下，对转基因紫花苜蓿的生长、产量及生理指标进行测定，评价其耐盐性。

三、结果与分析1. 耐盐基因的筛选与克隆通过生物信息学分析和文献调研，我们成功筛选出与紫花苜蓿耐盐性相关的基因，并进行了克隆和序列分析。

这些基因在植物抗逆境、抗盐碱等方面具有重要作用。

2. 转基因载体的构建与遗传转化我们将克隆得到的耐盐基因与植物表达载体连接，成功构建了转基因载体。

通过农杆菌介导法将转基因载体导入紫花苜蓿的基因组中，获得了转基因紫花苜蓿。

3. 转基因紫花苜蓿的筛选与鉴定通过对转基因紫花苜蓿进行PCR、Southern blot等方法的筛选和鉴定，我们确认了外源基因的成功整合及表达情况。

这为后续的耐盐性评价奠定了基础。

4. 耐盐性评价在盐渍化土壤条件下，我们对转基因紫花苜蓿的生长、产量及生理指标进行了测定。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）高效遗传转化与基因组编辑体系的建立与优化紫花苜蓿（Medicago sativa L.），又称草豆，是一种重要的经济作物和饲料植物，具有广泛的应用价值。

近年来，随着基因工程技术的快速发展，紫花苜蓿的高效遗传转化与基因组编辑体系的研究成为了热门课题。

高效遗传转化是基因工程研究的关键一步。

紫花苜蓿的主要遗传转化方法包括农杆菌介导的转化和基因枪介导的转化。

农杆菌介导的转化是目前最常用的遗传转化方法之一，它通过农杆菌将外源基因导入植物细胞。

基因枪介导的转化则是利用金粒枪将外源DNA迅速“炮入”植物细胞，突破植物细胞的保护屏障。

这两种方法各有优劣，研究人员可以根据具体需求选择合适的方法进行遗传转化。

遗传转化的关键是选择合适的载体和选择合适的转化子。

在紫花苜蓿的遗传转化研究中，研究人员通常选择转化质粒和短小DNA片段作为载体。

而转化子则需要具有强大的转化能力和稳定的遗传表达，以确保外源基因可以稳定地表达在植株中。

基因组编辑是指通过直接改变生物体的基因组来达到特定的目的。

它通常包括诱导突变、基因敲除和基因改造等技术。

基因组编辑技术的研究在农业和医药领域具有重要的应用前景。

紫花苜蓿基因组编辑的研究主要集中在利用CRISPR/Cas9系统对目标基因进行敲除和改造。

CRISPR/Cas9系统是一种刚刚兴起的基因组编辑技术，它通过导引RNA与Cas9蛋白的结合来实现DNA的切割和编辑。

研究人员通过将CRISPR/Cas9系统导入紫花苜蓿细胞，并设计合适的导引RNA序列，可以针对目标基因进行精确的编辑。

由于紫花苜蓿是一种自交不纯的植物，其遗传转化和基因组编辑体系的建立与优化会受到自交不纯性产生的困扰。

因此，研究人员需要在选择父本和控制自交过程时谨慎选择，以提高遗传转化和基因组编辑的效率。

此外，研究人员还需要考虑到遗传编辑的效果和安全性。

在使用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑时，需要确保编辑的基因在整个遗传过程中稳定传递，并且不会对植物的生长和发育造成不良影响。

专利名称：一种检测4种紫花苜蓿RNA病毒的成套试剂与方法专利类型：发明专利
发明人：班丽萍,李瑾,刘艳琪,戴雯婷
申请号：CN202110136934.8
申请日：20210201
公开号：CN112680441A
公开日：
20210420
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种检测4种紫花苜蓿RNA病毒的成套试剂与方法。

本发明公开的检测4种紫花苜蓿RNA病毒的成套试剂包括名称分别为AMV‑P、MsAPV1‑P、MsDPV1‑P和MsAV1‑P的引物对；AMV‑P由序列表中序列1和2所示的两条单链DNA组成，MsAPV1‑P由序列表中序列3和4所示的两条单链DNA组成，MsDPV1‑P由序列表中序列5和6所示的两条单链DNA组成，MsAV1‑P由序列表中序列7和8所示的两条单链DNA组成。

实验证明，本发明的成套试剂可以成功检测紫花苜蓿的AMV、MsAPV1、MsDPV1和MsAV1这4种病毒，可广泛应用于田间紫花苜蓿是否感染这4种病毒的检测工作中。

申请人：中国农业大学
地址：100193 北京市海淀区圆明园西路2号
国籍：CN
代理机构：北京纪凯知识产权代理有限公司
代理人：魏少伟
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收稿日期：2019-02-13作者简介：赵菲佚（1972-），男，江苏镇江人，天水师范学院生物工程与技术学院教授，博士。

基金项目：国家自然科学基金“苜蓿半胱氨酸合成酶与其有机硫含量关系的研究”（31260568）、“基于酶催化的氰化物污染现场快速检测研究”（31660153）阶段性成果紫花苜蓿（Medicago savita ）属豆科苜蓿多年生草本植物，素有“牧草之王”和“饲料皇后”的美称。

[1]苜蓿有极高的营养价值，[2]是世界上最重要的牧草之一，广泛分布于全世界，对牛、羊等牲畜的生长具有重要的作用。

[3]硫在动物所需的营养中占有重要地位，对促进家畜的生长和发育以及家畜产品的质量和生产具有极其重要的意义。

在苜蓿品质指标中，含硫氨基酸含量为重要的指标之一。

[4]苜蓿虽富含高量蛋白，但氨基酸组成不平衡，含硫氨基酸[半胱氨酸（Cys ）和甲硫氨酸（Met ）]含量很低，而Cys 和Met 是人畜的必需氨基酸，长期食用低硫含量的饲料会引起牛羊的脱毛，降低皮毛质量，蛋奶质量以及影响对其他氨基酸的吸收。

因此提高苜蓿含量中含硫氨基酸的含量在牧草生产中具有重要的意义。

半胱氨酸是植物合成的第一个有机硫化物，其合成调控很可能是提高植物含硫氨基酸的关键点，因而，半胱氨酸合成酶(CSase)在植物含硫氨基酸代谢中起着关键的作用。

CSase 是由多成员组成的小家族。

目前，已经从拟南芥、水稻、大豆、截形苜蓿、鹰嘴豆等植物中克隆得到OAS-TL 基因，部分基因已成功转入拟南芥等模式植物[5]，通过基因工程的手段从紫花苜蓿本身克隆到OAS-TL 的基因，然后再将其转入紫花苜蓿，提高OAS-TL 的表达量，从而提高体外无机硫转化为体内有机硫的效率，进而增加紫花苜蓿的硫含量。

本研究将紫花苜蓿三得利（Sanditi ）半胱氨酸合成酶基因成员MsSDCS-0序列从克隆载体pBSC 亚克隆至pCAMBIA1205植物表达载体上，成功构建植物荧光表达载体pCAMBIA1205-GFPn-MsS⁃DCS-0，转入野生型（Col-0）拟南芥原生质体考察半胱氨酸合成酶MsSDCS-0成员亚细胞定位，并同时转化拟南芥整体植物以考察其表达模式。

《利用转基因技术创建紫花苜蓿耐盐新种质的研究》篇一一、引言紫花苜蓿是一种具有重要经济价值的作物，因其富含营养且能够改良土壤而被广泛种植。

然而，盐碱土壤对紫花苜蓿的生长造成了严重的影响，这直接制约了其种植范围和产量。

因此，如何提高紫花苜蓿的耐盐性，成为了一个亟待解决的问题。

近年来，随着转基因技术的不断发展，利用该技术创建耐盐新种质为解决这一问题提供了新的途径。

本文旨在探讨利用转基因技术创建紫花苜蓿耐盐新种质的研究。

二、研究目的和意义本研究的主要目的是通过转基因技术，将耐盐基因导入紫花苜蓿中，创建耐盐新种质。

这将有助于提高紫花苜蓿在盐碱土壤中的生长和产量，从而扩大其种植范围，提高农业生产的效益。

此外，这一研究也将为其他作物的耐盐性改良提供参考和借鉴，具有重要的理论和实践意义。

三、研究内容和方法1. 材料和试剂本研究所用材料为紫花苜蓿的基因组DNA和耐盐基因。

试剂包括各种限制性内切酶、连接酶、转染试剂等。

2. 实验方法（1）耐盐基因的获取和鉴定：从已知耐盐植物中获取耐盐基因，并通过PCR等技术进行鉴定。

（2）构建转基因载体：将耐盐基因与载体连接，构建转基因载体。

（3）紫花苜蓿的基因组DNA提取及转染：提取紫花苜蓿的基因组DNA，将其与转基因载体一起转染到紫花苜蓿的细胞中。

（4）转基因紫花苜蓿的筛选和鉴定：通过PCR等技术筛选出成功转染的紫花苜蓿，并进一步鉴定其耐盐性。

3. 实验设计本实验设计包括预实验、正式实验和验证实验三个阶段。

在预实验阶段，我们将探索最佳的转基因条件和耐盐基因的来源；在正式实验阶段，我们将进行大量的转基因操作，并筛选出成功的转基因紫花苜蓿；在验证实验阶段，我们将对成功转染的紫花苜蓿进行耐盐性鉴定。

四、结果与讨论1. 结果通过本研究的实验，我们成功地将耐盐基因导入紫花苜蓿中，并筛选出了一批成功的转基因紫花苜蓿。

这些转基因紫花苜蓿在盐碱土壤中的生长和产量均有所提高，且其耐盐性得到了显著改善。

《MfERF028基因提高转基因紫花苜蓿耐寒性的研究》篇一一、引言紫花苜蓿作为一种重要的牧草作物，其耐寒性对于保障其生长和产量至关重要。

然而，由于气候变化和生态环境的变化，紫花苜蓿的耐寒性受到了严重挑战。

为了提高紫花苜蓿的抗寒性能，本研究采用了基因工程手段，利用MfERF028基因提高转基因紫花苜蓿的耐寒性。

二、材料与方法2.1 材料实验所用材料为紫花苜蓿，并选用MfERF028基因作为实验基因。

此外，实验还使用了相关的分子生物学试剂和仪器。

2.2 方法（1）基因克隆与载体构建：从紫花苜蓿中克隆MfERF028基因，构建到表达载体中。

（2）转基因紫花苜蓿的获得：通过农杆菌介导法将构建好的表达载体转入紫花苜蓿中，获得转基因紫花苜蓿。

（3）耐寒性检测：对转基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿进行耐寒性检测，比较其差异。

三、实验结果3.1 MfERF028基因的克隆与表达载体的构建通过PCR扩增和测序验证，成功克隆了MfERF028基因，并将其构建到表达载体中。

通过酶切和PCR鉴定，确认了表达载体的正确构建。

3.2 转基因紫花苜蓿的获得与鉴定通过农杆菌介导法将表达载体转入紫花苜蓿中，获得了转基因紫花苜蓿。

通过PCR鉴定，确认了转基因紫花苜蓿中成功插入了MfERF028基因。

3.3 耐寒性检测结果将转基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿进行耐寒性检测，发现转基因紫花苜蓿的耐寒性明显高于野生型紫花苜蓿。

在低温条件下，转基因紫花苜蓿的生长速度和存活率均优于野生型紫花苜蓿。

四、讨论本实验通过将MfERF028基因导入紫花苜蓿中，成功提高了转基因紫花苜蓿的耐寒性。

这表明MfERF028基因在提高植物抗寒性能方面具有重要作用。

此外，本实验还为其他植物的抗寒性改良提供了新的思路和方法。

五、结论本实验通过基因工程手段，成功提高了转基因紫花苜蓿的耐寒性。

这为解决气候变化和生态环境变化对紫花苜蓿生长和产量造成的影响提供了新的途径。

同时，本实验还为其他植物的抗寒性改良提供了重要的参考价值。

农杆菌介导的紫花苜蓿BADH基因高效转化体系的优化和转基因植株的检测农杆菌介导的紫花苜蓿BADH基因高效转化体系的优化和转基因植株的检测概述紫花苜蓿（Medicago sativa）是一种重要的经济作物和牧草，广泛种植于全球各地。

为了提高紫花苜蓿的耐盐碱性和抗逆性，目前主要通过转基因技术引入外源基因来实现。

农杆菌介导的基因转化是一种常用的植物转基因方法。

然而，在紫花苜蓿的转化过程中，存在着一些困难和挑战，如低转化率、高胚病率和对植物生长发育的负面影响。

因此，优化农杆菌介导的紫花苜蓿BADH基因转化体系，提高转化效率，并对转基因植株进行有效的检测和鉴定，对于紫花苜蓿的基因工程研究具有重要意义。

一、农杆菌介导的紫花苜蓿BADH基因转化体系的优化1. 表达构建的优化紫花苜蓿BADH基因负责编码产生抗逆性和耐盐碱性的相关酶。

为了提高转基因效果，需要优化表达构建。

首先，选择适合的启动子和终止子以确保基因在植物体内正常表达。

其次，考虑到转化体系的稳定性和选择性，选择合适的选择标记基因。

2. 农杆菌菌株的优化选择适合的农杆菌菌株对于提高转化效率非常重要。

常用的农杆菌菌株有Agrobacterium tumefaciens及Agrobacterium rhizogenes。

在优化过程中，要考虑到菌株的毒性对植物的影响，并对其进行基因修饰以提高转化效率。

3. 组织培养条件的优化紫花苜蓿是有效的再生体系，但转化过程中仍然存在着高胚病率的问题。

因此，需要优化组织培养条件以提高胚病率和植株再生率。

例如，通过选择适当的培养基成分、激素浓度和光周期等因素，能够显著提高紫花苜蓿的转化效率。

二、转基因植株的检测和鉴定为了确保转基因植株的稳定性和准确性，需要进行有效的检测和鉴定。

常用的检测方法包括PCR、Southern blotting和Western blotting等。

这些方法能够检测转基因植株中是否存在外源基因、基因的拷贝数以及基因的表达水平等信息，从而对转化的准确性进行验证。

《紫花苜蓿SKIP同源基因的克隆和功能鉴定》篇一一、引言紫花苜蓿作为一种重要的豆科植物，具有丰富的营养价值和生态价值。

近年来，随着分子生物学和基因工程技术的不断发展，对紫花苜蓿的基因功能研究逐渐成为热点。

SKIP（Skipping）基因作为一类重要的调控基因，在许多植物的生长、发育及响应逆境中起到关键作用。

本文以紫花苜蓿为研究对象，通过对SKIP 同源基因的克隆和功能鉴定，探讨其功能特点，以期为进一步的研究提供参考。

二、实验材料与方法1. 材料本实验选取紫花苜蓿为实验材料，相关试剂和仪器均购自正规渠道。

2. 方法（1）基因克隆a. 提取紫花苜蓿的DNA；b. 设计并合成特异性引物；c. 通过PCR技术扩增SKIP同源基因；d. 连接T载体并转化至大肠杆菌；e. 筛选阳性克隆并测序验证。

（2）功能鉴定a. 构建SKIP同源基因的过表达载体；b. 通过遗传转化法将过表达载体导入植物中；c. 观察并记录转基因植物的生长状况；d. 对转基因植物进行逆境处理，观察其抗逆性；e. 利用生物信息学软件分析基因表达模式。

三、实验结果1. 基因克隆结果通过PCR扩增，成功克隆了紫花苜蓿的SKIP同源基因。

连接T载体并转化至大肠杆菌后，筛选出阳性克隆并进行了测序验证，结果表明所克隆的基因序列与已知的SKIP同源基因序列高度相似。

2. 功能鉴定结果（1）过表达载体的构建及遗传转化成功将SKIP同源基因构建至过表达载体中，并通过遗传转化法成功将过表达载体导入紫花苜蓿中。

（2）转基因植物的生长状况观察在正常生长条件下，转基因植物与野生型植物相比，生长状况无明显差异。

然而，在逆境处理后，转基因植物的抗逆性明显增强，表现出更好的生长恢复能力。

（3）生物信息学分析通过对转基因植物的基因表达模式进行分析，发现SKIP同源基因在紫花苜蓿中的表达受到多种环境因素的调控，具有较高的表达活性。

此外，该基因在紫花苜蓿的生长发育及抗逆过程中发挥重要作用。

紫花苜蓿MsJAR1基因克隆及表达分析代蕊;陈崎;爽爽;张岩;张志强;米福贵【期刊名称】《草地学报》【年(卷),期】2024(32)5【摘要】为探究紫花苜蓿(Medicago sativa L.)茉莉酰氨基酸结合物合成酶(Jasmonoyl amino acid conjugate synthase,JAR1)的基因功能,本试验对‘草原4号’紫花苜蓿中克隆到的MsJAR1基因进行了生物信息学和表达模式分析,发现MsJAR1基因cDNA序列长度为1740 bp,开放阅读框(ORF)编码579个氨基酸残基,含有GH3保守结构域。

MsJAR1与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、红三叶(Trifolium pratense)、豌豆(Pisum sativum)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、相思子(Abrus precatorius)的同源性均在80%以上。

烟草亚细胞定位显示该蛋白定位于叶绿体。

MsJAR1基因在老叶中表达量最高,花器官次之;蓟马取食、盐和干旱胁迫可诱导该基因表达,初步推测其参与紫花苜蓿应答蓟马取食及干旱和盐胁迫防御反应。

本研究为进一步探究紫花苜蓿MsJAR1基因功能提供了参考。

【总页数】8页(P1370-1377)【作者】代蕊;陈崎;爽爽;张岩;张志强;米福贵【作者单位】内蒙古农业大学草原与资源环境学院;内蒙古农业大学草原与资源环境学院【正文语种】中文【中图分类】S892.6【相关文献】1.紫花苜蓿MsOXO基因的克隆及表达分析2.紫花苜蓿MsSOS1基因的克隆与表达分析3.云南逸散紫花苜蓿MsVDE基因的克隆与表达分析4.紫花苜蓿atpA基因的克隆及表达模式分析5.紫花苜蓿MsHB1基因的克隆及表达分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

紫花苜蓿转基因技术及其应用的研究进展
周岩;张洁;袁重要;马俊
【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2012(000)008
【摘要】对农杆菌介导法、电击法、显微注射法及基因枪法等几种常用的紫花苜蓿转基因技术研究进展进行概述.综述利用转基因技术对苜蓿进行品质改良,提高抗逆性、抗病虫害、抗除草剂,以及利用转基因苜蓿作为生物反应器生产植物疫苗、酶制剂和抗体等方面的研究进展及最新研究成果.对目前制约紫花苜蓿转基因技术发展的瓶颈及其生物安全性问题进行分析和讨论,并对其应用前景和商业价值进行展望.
【总页数】7页(P17-23)
【作者】周岩;张洁;袁重要;马俊
【作者单位】河南科技学院生命科技学院,新乡453003;河南科技学院生命科技学院,新乡453003;河南科技学院生命科技学院,新乡453003;河南科技学院生命科技学院,新乡453003
【正文语种】中文
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