收稿日期:2007-10-17;修回日期:2007-12-18基金项目:中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(中国农业科学院草原研究所)资助项目作者简介:任卫波(1979-),男,山西晋城人,助理研究员,博士,2007年毕业于中国农业大学草业科学系,从事牧草种质资源与育种,已发表论文10余篇
文章编号:1673-5021(2008)02-0104-05紫花苜蓿耐寒越冬性研究进展
任卫波1,陈立波1,郭慧琴2,徐柱1,解继红1(1中国农科院草原所,内蒙古呼和浩特010010;2内蒙古农业大学,内蒙古呼和浩特010018)摘要:从形态结构、生理生化、基因表达3个层次对苜蓿耐寒及其越冬性相关研究进展进行简要回顾,对提高苜蓿越冬能力的具体措施进行了总结,讨论了当前研究的不足,并对未来的研究热点进行了展望。关键词:紫花苜蓿;耐寒;越冬中图分类号:S541文献标识码:A
紫花苜蓿(MedicagosativaL)是重要的多年生豆科牧草之一,因其具有较高的生态价值和经济价值,被冠以牧草之王的美誉。在高纬度寒冷地区,低温、干旱等逆境胁迫导致苜蓿减产,甚至不能安全越冬,从而影响苜蓿的分布和生产。因此,开展苜蓿抗寒相关研究、提高苜蓿安全越冬能力,是紫花苜蓿研究的热点问题之一。1寒害与冷害及其与越冬性的关系冷害是指当温度低于12而高于0时,植物因低温而产生的直接损伤乃至致死;寒害是指温度低于0时,植物细胞因结冰等因素造成间接损伤乃至致死。对低温胁迫的响应分为三类:(1)冷敏感性:当温度低于12时,植株就受到损伤;(2)耐冷敏寒性:植株能在12下积累抗性,但不能在0以下存活;(3)耐寒性:植株能在0以下存活。冷害与寒害的损伤机理有本质的区别。冷害损伤主要是直接由低温造成的,寒害损伤主要是由于细胞内结冰导致的间接损伤[1]。影响苜蓿越冬能力的因素主要包括:当年的秋冬季的环境胁迫(包括冷害、寒害、干燥、因冰封导致根部严重缺氧等)和来年春季返青的环境胁迫(包括干旱、气温剧变造成的冷害等)。这些胁迫的组成与程度因地点与年度而异。苜蓿越冬性研究就是为了将冻害和寒害的影响降低到最低限度,提高苜蓿越冬成活率和产量。2苜蓿对冬季逆境胁迫的适应21逆境胁迫对苜蓿植株形态结构的影响及其适应211叶叶片形态结构与苜蓿植株的抗寒性有一定关系。其中叶宽长比小即叶片窄长、气孔密度大、叶片组织密度大、疏松度小、叶脉突起度大的植株比较抗寒[2]。叶片的解剖结构在低温下也发生变化,Jan-icke等(1989)研究发现随着温度的降低,苜蓿叶片气孔导度下降。关于叶形与耐寒性还有一定争议[3]。Campbell等(1991)在对二倍体苜蓿研究中发现,叶形与苜蓿耐寒性不存在相关性[4]。212根苜蓿根系具有四种类型:直根型、分枝型、根茎型和根蘖型。分枝型和根茎型根的苜蓿具有更新能力,当母株主根冻死后,还可产生新的根,因此比单主根具有更强的耐寒能力[5,6]。根蘖型苜蓿具有大量的水平侧根,因此抗寒越冬能力强于直根型苜蓿。但是,关于根蘖型苜蓿与直根型苜蓿耐寒性差异仍有争议。根蘖型苜蓿在有些区域的耐寒性与直根型苜蓿没有显著差异[7]。除此之外,根茎和根越粗,苜蓿耐寒性越强[8]。22逆境胁迫对苜蓿生理生化活动的影响及其适应221生化水平2211超氧化物歧化酶当苜蓿植株受到低温胁迫时,活性氧分子在细胞内大量累积。过多的活性氧分子会使膜脂过氧化、脱脂化、磷脂游离、细胞膜结构破坏,最终导致细胞功能的丧失。SOD、POD等同工酶能够抑制过氧
104
第30卷第2期中国草地学报2008年3月Vol30No2ChineseJournalofGrasslandMar2008化,减轻活性氧的伤害。研究表明,当温度降低时,苜蓿植株叶片的Cu,Zn-SOD酶活性呈先升高后降低的趋势。这说明在低温胁迫初期,SOD活性增加,通过消除冷胁迫产生的活性氧和氧自由基,对幼苗进行保护;当植株经过抗寒锻炼,获得耐寒能力后,SOD酶活性逐渐下降。在抗寒锻炼过程中起保护作用[9]。2212储藏蛋白从9月初到10月中旬,根储藏蛋白(Vegetativestorageproteins)的浓度和总量显著增加,此后伴随着编码VSPs的转录子的消失,VSPs的含量基本保持不变,其它的可溶性蛋白则持续增加直到秋末冬初,占到根储藏蛋白总量的60%[10]。苜蓿秋天过早的落叶降低了VSPs的累积。这些化合物的含量如脯氨酸、精氨酸、组氨酸和根储藏蛋白与来年苜蓿春季返青生长有显著的正相关,但是与越冬率没有显著关联。苜蓿越冬率主要与根内保护性糖含量呈显著正相关[10]。Ferullo等(1997)研究发现,苜蓿抗寒性差可能是因缺乏富含甘氨酸的蛋白质如MSA-CIA和MSACIB在细胞内的累积造成的[11]。2213根内可溶性糖苜蓿根及根颈中可溶性糖的积累(尤其是低聚糖)与其抗寒及越冬性有着显著的正相关[12,13]。冬季冰封造成苜蓿根部高度缺氧,这些缺氧环境降低了苜蓿根内可溶性糖(蔗醣、果糖、葡萄糖和果聚糖)的累积,降低了3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性,从而影响了越冬和来年春季返青[14]。2214脱落酸(ABA)单一使用ABA胁迫可以在一定程度上提高耐寒性,但是要最大限度提高耐寒性,必须进行冷适应性诱导。ABA处理会导致蛋白合成模式改变,部分改变与冷适应诱导相一致,冷适应诱导是ABA独有的[15]。2215脯氨酸在低温胁迫下,肇东苜蓿植株体内游离脯氨酸含量积累,并随着低温处理时间的延长而增加[16]。222生理水平2221钙离子的流动当温度从25降到15时,细胞内的钙离子浓度没有显著变化。当温度进一步从15降低时,钙离子流入开始显著。当温度降低到4时,钙离子的流入是25时的15倍。添加钙螯合剂,抑制细胞外的钙离子流入胞质,同时也抑制了冷诱导基因CAS(Cold-acclimation-specific)的表达。反之,添加钙离子载体将促进胞外钙离子的流动,加强CAS基因的表达。进一步分析表明,在4低温下细胞骨架结构发生重组,细胞膜脂成分发生变化,不饱和脂肪酸含量增加,胞膜的流动性降低,透性增强,Ca离子流入细胞质内,传递冷胁迫信息,导致低温响应基因Cas30的表达[17]。设想的冷胁迫响应过程:温度降低到15以下细胞膜流动性降低细胞膜钙离子通道激活细胞壁钙离子流入胞质冷响应蛋白激酶磷酸化酶激活冷响应蛋白磷酸化冷响应基因表达增强抗寒能力增加[18,19]。国
内也有类似的报道。用50mmol/L的CaCl2浸泡图牧吉和公农1号苜蓿种子,处理后两个品种幼苗的抗寒性都显著提高,进一步分析表明,两个品种的苜蓿植株的SOD、POD等酶活性及脯氨酸含量也提高[20]。2222光合作用在低温下,苜蓿叶片的最大净光合速率和叶绿素含量均降低,而且光照大于黑暗,其原因可能是低温下光照加剧叶绿素的降解和细胞膜系统的损伤,从而加剧光合电子传递的抑制和光合速率的降低[21]。23逆境胁迫对苜蓿基因表达的影响及其适应231cDNA筛选为了寻找与冷胁迫响应相关的基因,研究它们在冷胁迫条件下在不同基因型的紫花苜蓿中的表达情况,Ivashuta等(2002)对1036个cDNA克隆进行了筛选。通过筛选,获得在耐寒和不耐寒苜蓿品种中表达显著差异的cDNA。这些差异表达cDNA是一些携带有长末端重复序列(LTR)的非编码重复因子[22]。进一步分析表明,这些cDNA可能代表某个假想的反转录转座子家族,这些转座子在低温诱导下可以激活表达;可是,这些转座子的激活并不依赖基因型[22]。Mohapatra等(1989)以黄花苜蓿耐寒品种Anik的幼苗为材料,构建其cDNA文库,对冷胁迫特异诱导表达基因进行了筛选。结果发现,3个cDNA克隆pSM784,pSM2201和pSM2358的转录表达水平仅与苜蓿植株耐寒性呈显著正相关,即抗寒性越强转录表达水平越高[23]。232冷诱导基因随着秋季落叶,冷诱导基因msaCIA(编码一种富含甘氨酸蛋白)转录水平在不耐寒苜蓿品种WL225显著降低,但是在耐寒品种ACCaribou105
任卫波陈立波郭慧琴徐柱解继红紫花苜蓿耐寒越冬性研究进展中其转录水平没有显著变化[24]。寒冷、脱落酸和干旱胁迫都可以显著提高转录因子基因WXP1的表达水平。WXP1的高度表达可以提高转基因紫花苜蓿叶片表皮蜡质物的累积,转基因苜蓿叶表皮蜡质物增加296%~377%,叶片蜡质物的增加,降低了水分和叶绿素的损失,从而提高了抗旱耐寒能力[25]。冷诱导基因CAS15编码145KD的蛋白,有4个包含由10个氨基酸组成的结构域[24]。3提高苜蓿越冬能力的对策31栽培管理措施播种期、冬春季管理措施和刈割制度都对苜蓿的安全越冬有显著影响[26]。播种期越早,苜蓿根颈越粗,入土越深,因此适当提前播种有利于提高苜蓿越冬能力。施种肥、延长生长期促进幼苗生长,加强冬春季田间管理如增加根颈保温层,增加土壤含水量等措施,可有效提高苜蓿越冬率[27]。最后一次刈割时间对苜蓿越冬性影响较大,一般认为应在霜冻前4~6周进行,这样有利于根茎内碳水化合物的累积[27]。32常规育种国外苜蓿抗寒常规育种的研究主要集中在苜蓿秋眠性方面。秋眠性是指随着秋季日照时数的减少而引发的生理休眠,具体表现为秋季苜蓿再生能力的降低。研究发现,苜蓿的秋眠性与其冬季逆境损伤呈显著负相关。秋眠性品种秋季再生株高度低,但抗寒能力强,冬季损伤低;非秋眠品种秋季再生株高度高,但抗寒能力弱,冬季损伤重。通过连续选择,可以显著提高非秋眠品中的耐寒性[28]。利用田间选择、回交、种间或属间杂交,经过多代选择,我国也先后育成了草原1号、草原2号、龙牧801、龙牧803等耐寒品种。虽然常规育种取得了很大的成就,但育种周期长,受环境影响较大,不能完全满足苜蓿生产的需要。33基因工程由于紫花苜蓿已经建立了较好的体细胞胚再生组培体系,使得利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtu-mefaciens)对其进行转化非常方便快捷[29]。尽管如此,由于苜蓿越冬受低温、冰冻、缺氧等多个生理胁迫过程的影响,而且控制这些生理过程的基因非常多,因此通过基因操作技术来提高苜蓿越冬能力仍然是很困难的。为了解决这一问题,在转基因苜蓿候选基因的选择上,并没有选择那些与单一过程有关的基因,而是选择了这些胁迫因素的公共效应。研究发现,与越冬性相关的这些胁迫对植物的影响有相似之处:(1)活性氧分子的增加;(2)细胞膜的脂肪酸含量增加与蛋白质的降解;(3)细胞膜结构损伤;(4)细胞质的大量流失与细胞活性的丧失。基于此,如果提高植株的抗氧化能力,苜蓿的冬季损伤会显著降低。将拟南芥的Fe-SOD[30],烟草中的Mn-SOD[31,32]基因转入紫花苜蓿植株体内,转基因苜蓿植株体内两种酶的活性显著增强,同时其越冬存活率平均比对照高出25%,但是该酶的增强表达并没有有效的降低低温对植株造成的直接伤害(如对叶片和须根)[30],可能是Fe-SOD的高度表达减轻了由冻害引起的次级损伤,从而间接加强了苜蓿的越冬能力[30]。
