银杏叶活性成分的提取制备及测定方法的研究进展

银杏叶活性成分的提取制备及测定方法的研究进展
银杏叶提取物（GBE）具有独特的药理活性及巨大的临床应用价值，因此对银杏叶的药用、保健等综合价值的深入挖掘和开发日益受到重视。

本文就银杏叶的化学成分、提取分离及其质量控制方面的最新进展作一综述。

1银杏叶的化学成分
银杏叶的化学成分较为复杂，迄今为止，已从银杏叶中分离出大量的极性和非极性化合物，其中主要为黄酮类化合物、萜类内酯，此外还有有机酸、烷基酚和烷基酚酸、甾体化合物及微量元素等。

1.1EGb761的化学组成GBE具有多种生理活性，目前国际上标准银杏叶提取物是按德国Schwabe专利工艺生产的EGb761，其中黄酮含量为24%，萜内酯为6%，白果酸小于0.0005%，原花青素类7.0%，羧酸类成分13.0%，儿茶素类
2.0%，非黄酮苷类20%，高分子化合物4.0%，无机物5.0%，水分溶剂
3.0%，其他3.0%。

提取物的各种成分是一个整体中有机的组成部分，EGb761的药理作用是各种相对固定组成的各组分共同作用的结果。

1.2化学成分的动态变化目前比较公认的GBE的有效成分为黄酮类化合物和萜类内酯，而它们在叶中的含量随季节变化和植株性别差异会有较大变化。

苑可武等［1］测定了北京地区银杏叶中黄酮含量的季节性变化，结果认为银杏叶总黄酮含量在4月份为最高，8月份时居次；同时发现大部分时期内以槲皮素为主而异鼠李素比例相对一直较小。

南京大学药物研究所对银杏叶中黄酮苷与萜类内酯含量分别进行研究［2，3］，结果发现黄酮苷含量以5月份为最高，以后逐月降低，雄性植株叶中黄酮含量明显高于雌性植株；而同株银杏树叶中萜类内酯含量随季节变化规律与黄酮苷相异，同时发现雌性植株叶子中内酯含量明显高于雄性植株，分别为0.22%,0.09%。

这一发现为我们充分利用自然资源提供了有价值的参考。

比较各地测定的银杏叶总内酯及黄酮苷含量，结果相差较大，除各自测定的方法的准确度或系统误差外，银杏总内酯与黄酮苷是否与各地的土壤、气候、环境及银杏树的性别、树龄等因素相关，还需做大量实验研究和分析统计工作。

2银杏叶提取物的制备
2.1有机溶剂提取法这是国内外使用最为广泛的方法。

由于银杏叶中含黄酮类化合物和内酯较少（分别为1.7%及0.6%左右），因此最终所得浸膏中此两类成分含量往往不高，所含杂质较多，离目前通行的“24+6”标准较远。

为得到能用于制药原料的GBE，则必须将此浸膏进行进一步的分离纯化。

常用的分离纯化方法有液-液萃取法、沉淀法和吸附洗脱法。

胡敏等［4］探讨了溶剂萃取和树脂吸附精制银杏叶黄酮的机制，比较了两种方法，结果表明，树脂吸附精制法优于溶剂萃取精制法。

树脂吸附纯化法近年来有较大的发展。

陈冲等［5］将银杏叶以65%乙醇回流提取，减压浓缩，ZTC澄清剂沉降。

其黄酮苷和内酯含量分别达到26%和6%以上。

李新岗等［6］对吸附银杏叶中银杏总内酯的树脂法进行研究，用50%乙醇沸提银杏叶干粗粉，滤液上724吸附树脂柱,最后得淡黄色粉末状提取物，含黄酮苷和银杏总内酯分别为27.4%，10.6%。

该法操作简单，能耗低，投资少，安全可靠。

树脂吸附生产工艺应用于银杏叶，其主要特点是成本低、回收率高、有机溶剂残留少。

Teris等［7］对银杏内酯A，B，C与白果内酯的制备分离进行了研究。

作者使用质量分数为6.5% NaOAc浸泡的硅胶柱，以中压液相色谱分离GA，GB，GC，GJ和BB的方法，先精制再分离，仅含1种内酯的色谱部位经重结晶3～4次可得纯品单体。

2.2超临界CO2提取法近年来，随着国际上超临界流体提取技术的迅速发展，用该技术提取植物中的活性成分也越来越广泛。

与有机溶剂法相比，具有提取效率高，无溶剂残留，活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏等优点，通过控制温度和压力以及调节改性剂的种类和用量，还可以实现选择性萃取和分离纯化，欧洲已有专利报道采用SFE技术除去银杏叶粗提物中的杂质。

近年来国内学者［8］也开始探索和研究用该技术提取银杏叶黄酮类化合物，得黄绿色精提物，收率为4.1%，其中黄酮苷含量在35%以上。

邓启焕等［9］以银杏叶有效成分分离为对象，建立了一套超临界流体小试、中试装置和实验方法，所得的提取物中银杏黄酮含量为28%，银杏内酯含量为7.2%，均高于国际现行公认的质量标准。

据夏开元等［10］报道，以乙醇和用大孔树脂提取的银杏叶精提物，于CO2-SFE精制前，毒性成分白果酸含量为 2.0%，而用CO2-SFE精提后，白果酸含量降低到0.02%。

Chen等［11］对SFE萃取银杏内酯和白果内酯进行研究，认为在萃取过程中必须有改性剂的参与。

用超临界CO2提取银杏叶中的药用成分，已引起各国学者关注，成为新热点之一。

2.3高速逆流色谱技术提取法高速逆流色谱（high-speed counter current chromatogra phy, HSCCC）技术是一种不用任何固定载体的液-液分配色谱技术，具有两大突出优点：①无因使用载体而固有的吸附现象；②具有不同于一般
色谱的分离方式，使其特别适用于制备性分离。

用HSCCC技术提取分离银杏叶中黄酮苷及总内酯成分，已引起各国专家的重视。

Yang等［12］以及蔡定国等［13］先后报道了应用HSCCC技术，从银杏叶提取物中分离纯化得到3种主要苷元：槲皮素、山奈素、异鼠李素。

我们还对HSCCC分离银杏总内酯的条件进行探索，目前已成功分离制得白果内酯单体，和以GA，GB为主要成分的混合物，并仍在继续摸索新的分离条件，以实现对银杏内酯的分离。

HSCCC对样品的高分离效率、高产品纯度、无吸附和污染等优点，将使其成为制备银杏黄酮苷元以及各银杏内酯和白果内酯对照品的较佳手段。

2.4细胞和组织培养合成法银杏黄酮类化合物以及萜类内酯主要存在于银杏叶片和根皮中，其含量较低，易受地域、季节、气候及植株性别限制而发生较大的含量变化，且银杏总体资源十分有限，叶的采收具有季节性。

继1991年Carrier等首次肯定了银杏组织培养物中有银杏内酯存在后，陆续已有较多成功的实验室研究成果。

孙天恩等［14］利用发根农杆菌的Ri质粒转化成功银杏叶的发根，其中银杏内酯的含量比较接近叶片，而银杏黄酮的含量则偏低。

但银杏发根具有生长速度快、有克隆性、遗传性稳定、筛选方便，无环境污染等优点，是继细胞培养后发展起来的又一新的培养系统，并已有有关专利公布。

虽然
目前商品化产生银杏内酯还是以叶片提取为主，但利用组织法生产及发根培养技术的前景令人注目。

3银杏叶提取物及其制剂的质量研究进展
目前，国外生产银杏叶制剂的大厂将其制剂的标准化内涵进行了延伸，不仅建立在以有效成分和毒性成分的基础上所制订的质控标准，还包括了原生药的种植采收和储藏的标准化，提取分离以及其制剂生产工艺的标准化。

EGb761即有其特殊的工艺和标准配合于每一道工序的具体过程。

而国际上一般公认的GBE 质量指标仅着眼于最终产品的含量监控，国内外学者均围绕这一标准，对银杏叶提取物及其制剂的主要成分的含量测定进行了广泛深入的研究，本文就其最新进展作一综述。

3.1黄酮苷类近年来对黄酮类成分的定量多采用酸水解后HPLC测定其中3种主要苷元的含量。

最近，杨天鸣等［15］报道了在含KBr的盐酸介质中，以KBrO3标准液为滴定剂，用示波滴定法测定银杏叶提取物中总黄酮的含量（以芦丁计），方法简单方便，快速准确，与分光光度法的测定结果无显著性差异（99%置信度）。

刘志敏等［16］运用最新发展起来的超临界流体色谱法成功地分离了黄酮类化合物，为银杏叶提
取物中黄酮类化合物的分离分析开辟了一条新的途径。

3.2萜类内酯由于萜类内酯在银杏叶中含量较低，且自身的特征紫外吸收峰很弱，用紫外检测器测定比较困难，受杂质干扰严重，因而其定量多采用示差折光检测器（RI）检测。

Stuart 等［17］报道了运用MECC法分离分析银杏内酯A，B及白果内酯，于波长185nm 处进行检测，成功也将三者进行分离，但至今尚未见进一步报道。

陈维军等［18］研究并提出了应用羟肟酸铁反应测定银杏叶及其提取物中总内酯含量的分光光度法，其最低检测限为45μg/ml，线性范围为0～0.9mg/ml，方法操作简便快速，对设备要求不高，可应用于银杏叶制剂的含量测定。

Biber 等［19］在对银杏内酯及白果内酯的生物利用度进行研究时，运用GC-MS法测定血浆中GA，GB，BB的浓度，以最低剂量给药时测得血药浓度峰值分别为68，40，159μg/m l。

4结语
银杏叶提取物及其制剂是近代植物药开发研究的热点之一，要使我国的银杏叶相关产业摆脱低水平重复、产品不稳定的因素造成的落后局面，使之有能力参与国际大市场的激烈竞争，应
借鉴国外的先进经验，以标准化的原料和标准化的生产工艺来生产高质量的标准化银杏叶提取物及其制剂。

在此基础上，紧密结合药理学、植物化学、分析化学等各学科，在进一步深入研究银杏叶中确切的有效成分的同时，将传统的中医中药理论融入对资源的充分合理利用中，则银杏叶的综合开发必将展现广阔的前景，成为中药现代化进程中坚实的一步。