Real time PCR 从原理到实验方法及数据分析

real-time PCR 数据分析无论所使用的real-time PCR是何种型号，正确的数据分析对于获得有效的实验结果都是至关重要的。

这里介绍有关real-time PCR数据分析的知识。

在讨论基本分析过程之前，先介绍如何设计一个好的实验。

如果你是自己设计的引物和探针，那有助于下一步的工作。

但是在有些情况下，人们使用出版文献上的序列会更方便。

记住，即便是出版物提供的序列也不能保证会得到优化的实验结果。

而且排版错误的可能性也需要考虑在内。

所以进入实验室之前使用BLAST对全部序列进行核实确保他们是正确的。

下订单前先检察引物和探针的序列和Tm值是实验设计的基本要求。

标准曲线是判断实验质量的重要手段。

使用一个已知的模板，PCR产物，合成的寡核苷酸或转录的RNA做个标准曲线能够确定PCR的效率，敏感性，动态范围和其他的参数。

建立标准曲线时使用OD260的模板样本。

模板的总量以DNA分子的数量来描述，把质量转化为DNA含量的公式如下：（质量（克）*阿伏伽德罗常数）每个碱基的平均质量*模板的长度。

例如，合成70-mer的单链DNA，样本质量为0.8*10ˆ-11gm。

代入公式得：（0.8*10ˆ-11*6.023*10ˆ23molecules/mole）330gm/mole/base*70 base。

如果使用双链的模板，则碱基的平均质量为660gm/mole/base。

标准曲线使用的模板含量从1*10ˆ7开始连续稀释7次每次稀释10倍，最终得到10个模板拷贝。

这样的浓度有助于得到最高的ΔRn和最低的Ct。

用Excel画曲线时以模板数量的对数值为X，Ct（cycle threshold）值为Y轴。

标准曲线的计算公式如下：y=mx+b。

y就是Ct，m是斜率，x=log10template amount，b=y-intercept。

用斜率计算出实验效率Efficiency【10ˆ（-1/斜率）】-1。

实验效率告诉我们PCR反应的执行情况。

实时定量荧光pcr原理
实时定量荧光PCR（quantitative Real-Time PCR）是一种基于PCR技术的高效、准确且可靠的DNA分析方法。

其主要原理
是通过在PCR反应过程中实时监测DNA扩增产物的累积量，从而定量测定起始DNA模板的数量。

实时定量荧光PCR的核心是使用荧光探针的方法来定量检测PCR反应过程中的DNA扩增产物。

在PCR反应中，荧光探
针包含一个荧光染料和一个荧光素（quencher）分子。

当探针
与PCR反应中的模板DNA序列互补结合时，荧光染料与荧光素分子之间距离较远，荧光信号强度较高。

而当PCR反应进
行到延伸阶段，DNA聚合酶酶活将荧光探针的酶切位点切除，导致荧光染料与荧光素分子之间距离缩小，荧光信号强度降低。

根据荧光信号的变化情况，可以推算出PCR反应过程中DNA
扩增产物的实时累积量。

为了实现定量测定，实时定量荧光PCR还需要设置一个标准
曲线。

首先，制备一系列包含已知浓度的DNA标准品，然后
通过实时定量荧光PCR测定这些标准品的荧光信号。

根据标
准品荧光信号与其对应浓度之间的关系，构建标准曲线。

最后，通过比较待测样品的荧光信号与标准曲线，可以确定样品中的DNA起始数量。

实时定量荧光PCR在科学研究和临床诊断中具有广泛应用。

它可以用于分析基因表达水平、研究遗传变异、检测病原体等。

相比传统的定量PCR方法，实时定量荧光PCR具有灵敏度高、
精确性好、操作简便等优点，成为分子生物学领域中不可或缺的实验技术之一。

荧光定量PCR实验及数据分析一、概述荧光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，简称qPCR）是一种结合了PCR技术的高灵敏度和荧光探针技术的实时定量特性的分子生物学分析方法。

该方法通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的变化，对模板DNA或RNA的初始浓度进行定量分析。

荧光定量PCR技术在基因表达研究、病原体检测、基因突变分析以及药物疗效评估等领域具有广泛的应用价值。

在荧光定量PCR实验中，通常使用特异性引物和荧光探针来识别并扩增目标序列。

荧光探针的设计是关键步骤之一，它必须能够与目标序列特异性结合并在PCR过程中产生可检测的荧光信号。

实验过程中还需严格控制反应条件，包括温度、时间、引物和探针的浓度等，以确保实验的准确性和可重复性。

数据分析是荧光定量PCR实验不可或缺的一部分。

通过对实验数据的收集、整理和分析，可以获取目标序列的初始浓度信息，进而对实验结果进行解读和评估。

数据分析方法包括相对定量和绝对定量两种，前者通过比较不同样本间目标序列的相对表达量来评估差异，后者则通过标准曲线法或质粒拷贝数法等方法来确定目标序列的绝对浓度。

荧光定量PCR技术是一种高效、灵敏且特异的分子生物学分析方法，对于研究基因表达、病原体检测等领域具有重要意义。

通过不断优化实验操作和数据分析方法，可以进一步提高荧光定量PCR实验的准确性和可靠性，为科学研究和临床实践提供有力支持。

1. 荧光定量PCR技术的概述荧光定量PCR技术，是一种基于DNA聚合酶链式反应的分子生物学技术，它通过引入荧光标记，实时监测PCR过程中目标DNA片段的扩增情况，从而实现对特定基因拷贝数的精确量化。

该技术结合了PCR的高效扩增能力与荧光信号的灵敏检测，使得微量DNA分子的检测成为可能，并在遗传学、分子生物学、医学诊断等领域中发挥着重要作用。

荧光定量PCR技术主要依赖于特异性引物和探针的设计，使得PCR扩增过程具有高度的特异性。

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA 的降解，保持RNA的完整性。

在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。

二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA用DNase I 消化DNA组份加量模板(RNA) 10ugRNase Inhibitor 4ulDNase I buffer 10ulDNase I 10ulDEPC处理H2O 至100ul混匀，37℃90min三、RNA琼脂糖凝胶电泳1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。

2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。

倒入凝胶板上凝固30min。

2．取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。

3．120V电压下电泳25min。

用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。

4．RNA电泳结果如下图所示。

可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。

四．RNA反转录为cDNA反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul 体系)模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整)引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ulDEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul混匀，70℃5min，立即冰浴5*buffer 4.0ul 8.0uldNTP(10mM) 2.0ul 4.0ulRNase Inhibitor 0.5ul 1.0ul混匀，37℃5minM-MLV 1.0ul 2.0ul42℃60min ，70℃10min反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。

real-time pcr原理
实时聚合酶链反应（real-time PCR）是一种广泛应用于分子生
物学研究中的技术，用于检测和定量DNA或RNA的存在。

与传统聚合酶链反应（PCR）相比，实时PCR能够提供更快、更准确的结果。

实时PCR基于聚合酶链反应原理，通过扩增目标DNA或
RNA序列来检测其存在。

实时PCR使用一对特异性引物，即
前向引物和反向引物，与目标序列的两侧结合。

在反应过程中，DNA聚合酶会复制模板DNA，并在每个引物的结合位点依次
合成新的DNA链。

然而，与传统PCR不同的是，实时PCR在反应混合物中加入
了一种叫做探针的荧光探测剂。

这种探针通常由一个引物和一个荧光信号发生器组成。

当探针与目标序列结合时，引物会选择性地与模板DNA结合，并将荧光信号发生器离开。

在PCR
反应进行的同时，荧光信号会产生，并且可以实时监测到
PCR反应的进程。

实时PCR设备一般配备了一个光学系统，可以记录PCR反应
过程中产生的荧光信号。

光学系统能够定量检测荧光信号的强度，并将其转化为DNA或RNA的相对数量。

这使得实时
PCR能够定量目标DNA或RNA序列在样本中的存在量。

总的来说，实时PCR结合了PCR的增幅特性和荧光技术的快
速检测特性，可以在PCR反应进行的同时实时监测和定量目
标DNA或RNA序列的存在量。

这使得实时PCR成为现代分子生物学研究中的重要工具。

由于Real-time qPCR 的众多优点，现在已是生命科学领域的一项常规技术。

越来越多的研究文章中涉及RT-PCR 的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。

由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，不少没有做过real-time qPCR 的研究者往往感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。

本文就从real-time qPCR 的发展史说起，包括real-time qPCR 的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR 发展史Real-time qPCR 就是在PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。

由于在PCR 扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

由于常规的PCR 的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。

现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等位基因的检测，药物开辟，临床诊断，转基因研究等。

在Real-time qPCR 技术的发展过程中，定量PCR 仪的发展起了至关重要的作用。

1995 年，美国PE 公司(已经并入Invitrogen 公司)成功研制了Taqman 技术，1996 年推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每一个循环的荧光强度，通过Ct 值进行数据分析。

从而荧光定量PCR 获得广泛应用。

现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM 系列；BIO-RAD 的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM 系列；Roche LightCycler@ 系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER 的LineGene 系列。

荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。

其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。

荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。

2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。

因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。

TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。

在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。

只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。

荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。

cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。

2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。

3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。

4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。

实时PCR实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。

real time PCR 的定量使用荧光色素，目前有二种方法。

一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素，例如SYBR Green荧光染料；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针（probe），如Taqman 探针。

、两种方法原理不同。

SYBR Green荧光染料游离时不发光，当反应体系中存在双链DNA时，SYBR Green与双链DNA结合，此时才发光。

Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端。

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。

real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。

这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”反应体系oligo: 多聚体，相当于mRNA引物AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs：脱氧核苷酸RNase：RNA酶抑制剂PCR Buffer：RT-PCR缓冲液MgCl2：2价镁离注意事项：绝对定量：几种可能：1. 你的cDNA浓度是不是通过紫外分光测定的？紫外的干扰因素很多，只能作为浓度参考，也就是可能会导致你的内参Ct有差异，正常现象。

2. 反转录的效率，如果你的内参扩增产物在靠近mRNA的3'端影响不大，如果在里面或者5'端，Ct值存在差异正常。

实时定量RTPCR的原理及方法一、本文概述实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在分子生物学领域中广泛应用的实验技术，用于检测和分析RNA样本中特定基因的表达水平。

该技术结合了反转录和聚合酶链式反应（PCR）的基本原理，通过实时监测PCR过程中产生的荧光信号，实现对基因表达量的高精度定量。

本文将对实时定量RT-PCR 的原理、实验方法以及应用进行详细的阐述，旨在为读者提供全面且深入的了解，从而能够在实际研究中灵活应用该技术，提高实验效率和准确性。

二、实时定量RT-PCR的基本原理实时定量反转录聚合酶链式反应（Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chn Reaction，简称实时定量RT-PCR）是一种在DNA扩增过程中，通过荧光信号实时监测反应产物量的变化，从而得到起始模板量的分析方法。

这种技术结合了反转录（RT）和聚合酶链式反应（PCR）两个过程，使得RNA模板也能进行定量分析。

实时定量RT-PCR的基本原理可以分为三个步骤：反转录，PCR 扩增，以及实时荧光信号检测。

反转录步骤中，RNA模板在反转录酶的作用下，被转换成互补的DNA（cDNA）。

这个过程中，RNA的特异性序列被保留下来，为后续的PCR扩增提供了模板。

然后，PCR扩增步骤中，特定的DNA片段在DNA聚合酶的作用下，通过引物的引导，进行指数级的扩增。

在这个过程中，DNA的数量以2的n次方（n为循环次数）增长，从而大大提高了检测的灵敏度。

实时荧光信号检测步骤中，通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，使得在DNA扩增的每一个循环中，都能实时监测到荧光信号的变化。

这种荧光信号的变化与DNA产物的量成正比，因此可以通过实时监测荧光信号，来推算出起始模板的量。