氨基酸纤维素薄层层析

薄层层析的原理与操作薄层色谱，或称薄层层析(thin-layer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。

这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法，从50年代发展起来至今，仍被广泛采用。

一、基本原理薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板，也可用涤纶布等)上形成薄层，然后用相应的溶剂进行展开。

薄层层析可根据作为固定相的支持物不同，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。

一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。

吸附是表面的一个重要性质。

任何两个相都可以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。

在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上，都可能发生吸附现象。

物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。

在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。

而处于固体表面的分子所受的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。

吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。

在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。

吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。

例如用硅胶和氧化铝作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。

当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。

由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。

氨基酸的薄层层析[原理 ]氨基酸薄层层析属于吸附层析，主要根据各种氨基酸在吸附剂表面的吸附能力不同进行分离或提纯的一种方法。

将硅胶（吸附剂—作为固定相的支持剂）均匀地铺在玻璃片上，并将氨基酸样品点于吸附剂上。

在密闭容器中，由于吸附剂的毛细管作用使展开剂上行将样品展开。

被分离的氨基酸因结构不同，在吸附剂上的吸附亲和力也不同。

吸附力大的就容易被吸附剂吸附，而较难被溶剂所冲洗（即解吸）；吸附力小的就容易被溶剂携带至较远的距离。

氨基酸在吸附剂和展开剂之间反复多次的进行吸附和解吸附，从而使不同的氨基酸达到分离的目的。

[试剂 ]（一）硅胶G（二） 0.2%羧甲基纤维素钠称取羧甲基纤维素钠1g 溶于蒸馏水100 ml中，在沸水浴中煮沸至无气泡，冷却，置冰箱储存，临用前稀释至0.2%。

（二）氨基酸溶液制备下列各氨基酸的异丙醇（90%）溶液各10ml。

1． 0.01mol/L 精氨酸精氨酸15.9mg溶于90%异丙醇10ml中。

2． 0.01mol/L甘氨酸甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇10ml中。

3． 0.01mol/L酪氨酸酪氨酸18.1mg溶于90%异丙醇10ml中。

将上述溶液各取出1ml ，混合均匀作为氨基酸混合溶液。

（三）展开剂按4：1：1体积比例混合正丁醇，冰乙酸及水。

临用时配置。

（四） 0.5%茚三酮丙酮溶液茚三酮0.5g溶于无水丙酮100ml 中。

[ 主要器材 ]（一）玻璃板（4× 10cm）（二）层析缸。

（三）喷雾器。

（四）长颈漏斗。

（五）玻璃毛细管。

（六）恒温干燥箱。

[ 操作步骤 ]（一）薄板的制备1．称取硅胶G 0.5g 放入研钵中，加 1.5ml0.2% 羧甲基纤维素钠，研磨成均匀的稀糊状。

2．将上述糊状物倾倒在4× 10cm 的玻璃片（图11）上，使之均匀地布满于玻片，将玻片轻轻地晃动，使硅胶 G 均匀分布，表面平坦，光滑，无水层及气泡，然后水平放置在空气中使其自然干燥。

氨基酸的薄层层析（TLC）【实验原理】聚酰胺薄膜层析是60年代以后发展起来的一种新的层析方法，特别适用于氨基酸及其衍生物的分析。

具有灵敏度高、分辨率强、操作方便快捷等特点。

聚酰胺是一类化学纤维素原料，即锦纶（尼龙）。

由乙二酸和乙二胺聚合而成的，称锦纶66。

由于分子中含有大量的酰胺基团，故称聚酰胺。

聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶制成的。

聚酰胺对许多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的-C=O和 -NH- 能与被分离物质的一定基团形成H键。

如酚类（黄酮类、鞣质）和酸类（氨基酸、核苷酸）能以其羟基与酰胺键的羰基形成H键。

在层析过程中，当样品随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生H键吸附能力的强弱不同，从而可将样品中各成分分离。

物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在滤纸上的移动速率，用Rf来表示。

在一定条件下，每个物质都有特定的Rf值，因此，用Rf可鉴定不同的物质。

无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外照射）或显色法鉴定。

氨基酸层析图谱常用茚三酮作显色剂。

本实验利用单向上行层析法鉴定氨基酸。

【实验试剂和器材】(一) 试剂1. 氨基酸标准液(10mg/ml)：三种氨基酸是赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸，分别配成上述浓度的溶液。

2. 氨基酸混合液（每种氨基酸5mg/ml）3. 展层剂：正丁醇：12％氨水：95％乙醇＝13: 3: 3（V/ V）4. 0.1%茚三酮－正丁醇液。

(二) 器材聚酰胺薄膜，毛细管，层析装置，电吹风机，喷雾器，塑料手套等。

【实验方法】(一) 薄膜的剪裁取薄膜（7cm×10cm）一张，在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一直线，在此直线上每隔1厘米作一记号为点样处（外侧两点距边缘2c m）。

(二) 点样氨基酸的点样量以5ul为宜。

点样时，用毛细管吸取氨基酸样品，与薄膜垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径最大不超过2mm。

点样过程中，必须在第一点样品干后再点第二滴。

氨基酸的薄层层析一、实验目的1．掌握薄层层析法的一般原理。

2．掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。

3．掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。

二、实验原理1．薄层层析法是色谱分析技术的一种一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。

当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。

（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）硅胶吸附薄层层析吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶硅胶：表达式为SiO2·XH2O。

层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。

硅胶吸附薄层层析的特点：①硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。

②硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。

③硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。

但是实际操作时为70℃，活化1h 2．氨基酸与茚三酮的显色反应茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。

3．记录结果，计算Rf值混合氨基酸被分离后，在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。

层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。

由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

三、材料与方法：材料：（一）分析样品：氨基酸混合液（二）试剂：吸附剂：硅胶粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠、氨基酸的异丙醇溶液、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸。

氨基酸的薄层层析_实验报告实验目的：掌握薄层层析法的基本原理和实验操作技巧，了解氨基酸在薄层层析中的分离和检测方法。

实验原理：薄层层析法是以薄层硅胶或薄层纸片为固定相，利用液相作为移动相的一种物理分离技术。

氨基酸薄层层析法主要是将混合的氨基酸样品在薄层硅胶或薄层纸片上沿着其表面作为移动相的有机溶剂慢慢地溶解，不同的氨基酸成分会因吸附在薄层硅胶或薄层纸上的程度不同而在其中分离。

不同的氨基酸在薄层层析图谱上的Rf（相对移动率）值不同，是区分不同氨基酸的一种物理性质。

Rf值的计算公式为：Rf=色谱前行距离÷色谱柱高度。

实验操作：1、制备薄层层析板。

将硅胶胶涂在薄层层析板上，晾干后烘箱烘干。

2、制备样品。

将6种不同氨基酸分别以氨基酸质量浓度相等的方式混合制成样品，并分别标记。

3、将样品分别滴在薄层层析板上，注意每滴之间需使它们相距一定的距离，并在板子内侧写上标记。

4、放入有机溶剂。

将有机溶剂铺在盛有一点水的薄层层析槽中，使得铺上的有机溶剂厚度大约为硅胶层的三分之一。

5、将涂有样品的薄层层析板放在槽中，让它与槽中的有机溶剂接触，但不要使样品浸泡在有机溶剂中。

6、密闭容器，放置在不受光照的地方，等待样品进行分离。

7、取出薄层层析板，把它们晾干并用紫外灯照亮，用标尺测出不同色序分离的距离并计算它们的Rf值。

实验结果：对应不同氨基酸的Rf值，可以得出该试验的结果。

结果应与理论值相近，判断是否失真并计算误差。

氨基酸的薄层层析法是一种快速、简便的分离和检测氨基酸的方法，适用于从实验中得到定性和定量信息。

由于薄层层析板具有良好的重现性和灵敏度，它在生物化学和分析化学领域得到了广泛的应用。

实验4 氨基酸的薄层层析一、实验原理薄层层析是一种将固定相在固体上铺成薄层进行层析的方法。

由于该方法具有操作简便、层析展开时间短、灵敏度高、结果可视化等优点，已被广泛应用于生物化学、医药卫生、化学工业、农业生产和食品等领域，对天然化合物的分离和鉴定也已广泛应用。

薄层层析时一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。

当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。

即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开。

本实验应用硅胶作为固相支持物，用羧甲基纤维素钠作为粘合剂，以正丁醇、冰醋酸及水的混合液为展开剂，测定混合氨基酸中各分离斑点的R f值（R f值详见第一篇第三章第五节），以分离和鉴别混合氨基酸的成分。

氨基酸的显色反应：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。

二、实验材料（一）样品1．氨基酸标准溶液：（1）0.01mol/L丙氨酸：称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。

（2）0.01mol/L精氨酸：称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。

（3）0.01mol/L甘氨酸：称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。

2．混合氨基酸溶液：将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液。

（二）试剂1．硅胶G(C.P.)2．0.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）：取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清备用。

3．展开溶剂：按80:10:10比例（V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。

4．0.1%茚三酮溶液：取茚三酮（A.R.）0.1g溶于无水丙酮（A.R.）至100ml。

氨基酸的薄层层析[原理]氨基酸薄层层析属于吸附层析，主要根据各种氨基酸在吸附剂表面的吸附能力不同进行分离或提纯的一种方法。

将硅胶（吸附剂—作为固定相的支持剂）均匀地铺在玻璃片上，并将氨基酸样品点于吸附剂上。

在密闭容器中，由于吸附剂的毛细管作用使展开剂上行将样品展开。

被分离的氨基酸因结构不同，在吸附剂上的吸附亲和力也不同。

吸附力大的就容易被吸附剂吸附，而较难被溶剂所冲洗（即解吸）；吸附力小的就容易被溶剂携带至较远的距离。

氨基酸在吸附剂和展开剂之间反复多次的进行吸附和解吸附，从而使不同的氨基酸达到分离的目的。

[试剂]（一）硅胶G（二）0.2%羧甲基纤维素钠称取羧甲基纤维素钠1g溶于蒸馏水100 ml中，在沸水浴中煮沸至无气泡，冷却，置冰箱储存，临用前稀释至0.2%。

（二）氨基酸溶液制备下列各氨基酸的异丙醇（90%）溶液各10ml。

1．0.01mol/L精氨酸精氨酸15.9mg溶于90%异丙醇10ml中。

2．0.01mol/L甘氨酸甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇10ml中。

3．0.01mol/L酪氨酸酪氨酸18.1mg溶于90%异丙醇10ml中。

将上述溶液各取出1ml，混合均匀作为氨基酸混合溶液。

（三）展开剂按4：1：1体积比例混合正丁醇，冰乙酸及水。

临用时配置。

（四）0.5%茚三酮丙酮溶液茚三酮0.5g溶于无水丙酮100ml中。

[主要器材]（一）玻璃板（4×10cm）（二）层析缸。

（三）喷雾器。

（四）长颈漏斗。

（五）玻璃毛细管。

（六）恒温干燥箱。

[操作步骤]（一）薄板的制备1．称取硅胶G 0.5g放入研钵中，加1.5ml0.2%羧甲基纤维素钠，研磨成均匀的稀糊状。

2．将上述糊状物倾倒在4×10cm的玻璃片（图11）上，使之均匀地布满于玻片，将玻片轻轻地晃动，使硅胶G均匀分布，表面平坦，光滑，无水层及气泡，然后水平放置在空气中使其自然干燥。

1．薄板上硅胶干后，放入105℃的恒温干燥箱内活化，半小时后取出，晾凉备用。

试验一氨基酸的分离鉴定——薄层层析法注：每组带一个小格尺，一支铅笔一、实验目的1、掌握分配层析的原理2、学习氨基酸薄板层析的操作方法二、实验原理薄层层析（thin layer chromatography ）又称薄层色谱，是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板上，形成薄层后，在此薄层上进行层析分离的分析方法。

例如：以纤维素作为支持物，将其均匀的涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析，即纤维素薄层层析。

纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。

层析时吸着在纤维素上的水是固定相，有机溶剂是流动相，当被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，即可被分开。

三、实验材料和仪器1、实验材料：绿豆芽、黄豆芽或萌发小麦种子2、主要仪器：玻璃板5cm×15cm；层析缸；毛细管；喷雾器；研钵；吸管5mL；洗耳球；量筒10mL（或25 mL）；10mL塑料离心管；电吹风或烘干箱；电子天平；离心机四、实验试剂1、硅胶板2、层析溶剂系统：正丁醇（分析纯）：冰醋酸（分析纯）：水＝4：1：1（V/V）。

上述溶剂需在临用时配制。

每组配25~30mL。

层析缸内平衡几分钟。

3、显色剂：0.1％茚三酮－丙酮溶液。

4、若干种氨基酸混合标准液：天冬、亮、苯丙、脯氨酸等各取5mg，溶于1mL 0.01mol/L 盐酸溶液中，每种氨基酸浓度为5mg/mL。

五、实验步骤1、氨基酸的提取：取已萌发好的小麦种子2g左右（或绿豆芽下胚轴2g），放入研钵中，加入95％乙醇4mL及少量的石英砂，研成匀浆后，倒入离心管中3000r.min-1离心15min，上清液为氨基酸提取液，用滴管小心吸入点样瓶备用。

2、点样：用刀片将薄层板上薄层的左右两边各让出0.5cm，防止边缘效应。

在纤维素薄板上距一端1.5cm处，用铅笔轻轻划出点样记号。

点样间距合适（1.3cm左右）。

用毛细管吸取样品，在记号处点样，即分次滴加在薄板原点处，样品斑点直径控制在2mm左右。

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一、实验目的1、掌握薄层层析法的一般原理。

2、掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。

3、掌握如何根据移动速率（Rf 值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。

二、实验原理1、薄层层析原理：将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。

液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不同，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不同，因此，不同的氨基酸样品在固定相上的移动速度也不同，可以彼此分离，以此分离鉴别不同氨基酸。

2、氨基酸显色反应原理：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。

三、材料与方法：以流程图示意Rf 值= 原点到层析斑点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离1、材料：层析板、尺子、铅笔、烧杯、玻璃棒、量筒、毛细管、层析缸、药匙、烘箱、氨基酸标准溶液（0.01mol/L丙氨酸、0.01mol/L精氨酸、0.01mol/L甘氨酸）、混合氨基酸溶液、0.5%的羧甲基纤维素钠、硅胶、展开-显色剂（正丁醇、乙酸、茚三酮溶液）2表格 1 氨基酸的薄层层析实验步骤四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。

1、结果：①实验数据：表格 2 制作层析板的试剂及用量表格 3 各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离及展层剂前沿至样品原点中心距离记录表格 4 结果记录 ② 现象：图一制板图二层析图三显色（从左到右分别为丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、混合氨基酸）表格 5 实验现象2、讨论：①由表格4可知，混合点1Rf值与精氨酸相近，混合点2Rf值与甘氨酸相近，混合点3Rf值与丙氨酸相近。

薄层层析的原理与操作薄层色谱,或称薄层层析(thin-layer chromatography),是以涂布于支持板上的支持物作为固定相,以合适的溶剂为流动相,对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。

这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法,从50年代发展起来至今,仍被广泛采用。

一、基本原理薄层层析是把支持物均匀涂布于支持板(常用玻璃板,也可用涤纶布等)上形成薄层,然后用相应的溶剂进行展开。

薄层层析可根据作为固定相的支持物不同,分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析(纤维素)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶)等。

一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄层吸附层析。

吸附是表面的一个重要性质。

任何两个相都可以形成表面,吸附就是其中一个相的物质或溶解于其中的溶质在此表面上的密集现象。

在固体与气体之间、固体与液体之间、吸附液体与气体之间的表面上,都可能发生吸附现象。

物质分子之所以能在固体表面停留,这是因为固体表面的分子(离子或原子)和固体内部分子所受的吸引力不相等。

在固体内部,分子之间相互作用的力是对称的,其力场互相抵消。

而处于固体表面的分子所受的力是不对称的,向内的一面受到固体内部分子的作用力大,而表面层所受的作用力小,因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响,就会被吸引而停留下来。

吸附过程是可逆的,被吸附物在一定条件下可以解吸出来。

在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡,称为吸附平衡。

吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。

例如用硅胶和氧化铝作支持剂,其主要原理是吸附力与分配系数的不同,使混合物得以分离。

当溶剂沿着吸附剂移动时,带着样品中的各组分一起移动,同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。

由于各组分在溶剂中的溶解度不同,以及吸附剂对它们的吸附能力的差异,最终将混合物分离成一系列斑点。