皱纹盘鲍的染色体研究

中国水产科学 2018年5月, 25(3): 536-545 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2017-09-04; 修订日期: 2017-10-26.基金项目: 山东省农业良种工程项目(2017LZQC009).作者简介: 江海林(1992–), 女, 硕士研究生, 专业方向为贝类遗传育种. E-mail: hailinchiang@ 通信作者: 冯艳微, 助理研究员, 研究方向为贝类遗传育种. E-mail: fywzxm1228@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2018.17315皱纹盘鲍4个养殖群体杂交子代生长与存活状况比较江海林1, 2, 冯艳微1, 刘春廷1, 2, 姜绪1, 刘相全11. 山东省海洋资源与环境研究院, 山东省海洋生态修复重点实验室, 山东 烟台 264006;2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306摘要: 为利用杂种优势培育皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai )优良新品种, 本研究以4个不同养殖群体[黄岛(HD)、荣成(RC)、日本(JP)、大连(DL)]的皱纹盘鲍为亲本, 设计4×4完全双列杂交, 建立了4个自交家系和12个正反杂交家系, 在利用微卫星标记进行亲子鉴定的基础上, 对各家系的F 1在1、5、13、17月龄时的生长性状、杂种优势率、生长速度和存活情况进行比较, 分析杂交效应。

结果表明, 在各个生长阶段均有部分杂交家系与自交家系相比表现出显著的生长优势; HDRC 、HDDL 和JPDL 家系的生长速度较高; HDDL 、HDJP 、RCDL 、JPRC 及RCHD 家系有着较高的存活率; 在杂种优势方面, HDRC 、HDDL 与DLHD 家系在各生长参数与生长速度上有明显的杂种优势, HDDL 、RCDL 、DLHD 家系在存活率上表现出明显的杂种优势。

第 卷第 期海洋与湖沼∂年 月 ≤∞ ∞× ≥ ≤ ≥皱纹盘鲍中国群体和日本群体的自交与杂交Φ1的ΡΑΠ∆标记3张国范王继红 赵洪恩 阙华勇刘晓中国科学院海洋研究所青岛大连水产学院大连大连市水产研究所大连提要利用皱纹盘鲍中国群体和日本群体野生个体的单自交和单正反杂交获得了 个ƒ家系 其中家系 ≤! ≤≤!≤≤ !⁄ 分别为日本α≅中国⎯!中国α≅中国⎯!中国α≅日本⎯和日本α≅日本⎯组合 采用 个引物对上述四个家系及其各自亲本个体的遗传结构进行了°⁄分析∀结果表明 四个家系的平均杂合度 ≤为 ≤≤为 ≤≤ 为 ⁄为 各家系两亲本间遗传距离 ≤为 ≤≤为 ≤≤ 为 ⁄ 为 ∀各家系子代群体与父母本的遗传距离 ≤为 和 ≤≤为 和 ≤≤ 为和 ⁄ 为 和 ∀各家系子代个体间的遗传距离 ≤为 ≤≤为≤≤ 为 ⁄ 为 而子代各群体间遗传距离均小于 ∀关键词皱纹盘鲍 不同地理群体 杂交子代 杂交优势 °⁄分子标记中图分类号±皱纹盘鲍 Ηαλιοτισδισχυσηανναι 是我国海珍品养殖的重要种类∀近年来由于频繁发生病害 张国范等 给其养殖产业造成了重大损失∀为了提高养殖鲍抗逆性和加快其生长速度 /杂种优势0的利用在生产实践中有很大的应用价值∀遗传育种的理论与实践都已证明杂交优势利用的关键在于找到强优势的杂交组合 亲本间遗传差异大时 它们的杂交优势亦强∀遗传差异的本质是⁄ 序列水平的差异∀用⁄ 分子生物学方法能正确地测定亲本间的分子差异或分子遗传距离 从而可作为预测杂交种优势的重要指标 帮助育种学家减少配制杂交组合时的盲目性∀分析和比较不同皱纹盘鲍群体间个体及其杂交子代的遗传结构是预测杂种优势的重要途径之一 而 °⁄标记技术为此提供了有效的手段∀°⁄标记现已用于动植物遗传作图!基因快速定位!特殊染色体区段的鉴定和分离!性别鉴定以及群体遗传变异的研究 季维志等 张细权等 梁利群等 滕春波等 宋林生等 孙致良等 石拓等 孙效文等 孙易等 张四明等 李斌等 刘萍等 ∏ √ εταλ εταλ3国家 资助项目 号 国家杰出青年科学基金资助项目 号∀张国范 男 出生于 年 月 博士 研究员 ∞2收稿日期 2 2 收修改稿日期 2 2期张国范等 皱纹盘鲍中国群体和日本群体的自交与杂交ƒ 的 °⁄标记∀近期其在杂种优势预测方面的应用又引起越来越多学者的关注 董在杰等 吕雪梅等 许明辉 李祥龙等 ∀对于海洋贝类 进行⁄ 多态性研究的比较多 主要用于种内与种间不同群体间的变异与分化!种质鉴定与系统进化研究等 刘必谦等 εταλ εταλ εταλ εταλ ∀在预测杂种优势等有关分子标记辅助育种方面的研究还未见报道∀本文中利用 °⁄技术对中国野生与日本野生皱纹盘鲍个体自交及正反杂交获得的 个子一代家系及其各自亲本个体的遗传结构进行了 °⁄研究 目的在于从分子水平上了解这 个家系及其父母亲本个体的遗传结构 为杂交育种的生产实践提供分子遗传学基础 为皱纹盘鲍种质资源的更好利用提供基础资料和科学依据 促进鲍杂交育种中的杂种优势预测及分子标记辅助育种工作的开展∀1材料与方法1 1材料1 1 1实验用鲍实验用皱纹盘鲍 Ηαλιοτισδισχυσηανναι 于 年 月分别采自辽宁大连长海县獐子岛和日本岩手县∀取野生中国和日本皱纹盘鲍雌雄亲本各 只进行杂交及自交 产生 个交配组合及其ƒ 家系 ≤ 日本α≅中国⎯ ≤≤ 中国α≅中国⎯ ≤≤ 中国α≅日本⎯ ⁄ 日本α≅日本⎯∀各家系ƒ 饲养至壳长 左右∀上述工作均在大连市水产研究所的协助下完成∀1 1 2仪器与试剂°≤ 扩增仪为°∞公司生产的°∞2 型∀引物!× ⁄ 聚合酶! ×°等试剂均购自上海≥ 公司∀1 2方法1 2 1基因组⁄ 的提取按萨姆布鲁克等 的方法略做改进∀将各家系的亲本野生鲍及其 个ƒ 个体活体取足部肌肉组织固定于 乙醇中 取 组织用蒸馏水清洗!切成碎沫并溶于 Λ 裂解液中 成分 × ≤ ∞⁄× ≥⁄≥ ∀加入蛋白酶 至终浓度为 Λ 来回颠倒离心管数次 置于 ε水浴中消化 在此期间转动离心管数次 以使之充分消化 ∀将上述消化液冷至室温 加等体积的酚抽提一次 以 转 离心 取上清液 再分别用等体积的酚 氯仿 酚Β氯仿Β异戊醇 Β Β 及氯仿 氯仿Β异戊醇 Β 各抽提一次 离心条件同上 取上清液∀向上清液中加入双倍体积的冷的 无水乙醇和十分之一体积的 ε冷冻 再用 乙醇洗涤⁄ 沉淀 次 沉淀置于室温凉干 ×∞溶解 ε保存∀1 2 2⁄ 定量使用 ∞≤ 公司生产的⁄ 型紫外分光光度计 将提取的模板⁄ Λ 稀释 倍至 Λ 进行测定∀在 时读数用于计算样品中核酸的浓度 ⁄值等于 时 相当于大约 Λ 双链⁄ 同时读取 ⁄ ⁄ 的比值 以估计所提⁄ 的纯度 纯⁄ ⁄ ⁄ 为 ) ∀同时辅以凝胶电泳肉眼观察所提⁄ 的完整性∀将⁄ 原液稀释到 Λ 于 ε保存待用∀1 2 3 °⁄条件 °⁄程序 ε预变性 后 ε变性 ε复性 ε延伸 个循环∀最后 ε延伸 ε保存∀ °⁄反应总体积为 Λ 其中含有 ÷ °⁄反应缓冲液 Λ ≤ ×° 引物 × 酶 基因海洋与湖沼 卷组⁄ ∀1 2 4电泳及成像扩增产物在 的琼脂糖凝胶中电泳 电压为 ∂ 左右∀电泳完成后以 ∂°公司的 ⁄≥ 型凝胶成像仪对凝胶进行观察!拍照及保存 并以 2 ° 软件包对图片进行计带处理 有带记为 无带记为 并对每个扩增带进行分子量的估算∀1 2 5数据处理各群体的平均杂合度∀纯合度 ϑ (ΕΞ ι)/ν,杂合度:Η ϑ∀其中:Ξι表示第ι个等位基因的频率,ν为测定位点数(季维志等, )∀遗传分化指数(ΓΣΤ)∀总群体的基因多样性(ΗΤ)分解为群体内基因多样性(ΗΣ)和群体间基因多样性(∆ΣΤ):ΗΤ ΗΣ ∆ΣΤ,ΓΣΤ ∆ΣΤ/ΗΤ∀这里ΗΣ ϑΣ (Εϑι)/Σ,其中Σ为群体的数目∀ϑι (ΕΞ ικ)/ν,这里ϑι是第ι个群体内的基因一致性,Ξικ是第ι个群体内第κ个等位基因的频率,ν是ι个群体的基因位点数目;∆ΣΤ (ΕΕ∆ιϕ)/Σ ,这里∆ιϕ (ϑι ϑϕ)/ ϑιϕ,其中ϑιϕ是第ι个和第ϕ个群体间的基因一致性:ϑιϕ (ΕΞικΞϕκ)/ν∀群体间的遗传距离∀根据 的计算方法计算∀∆ Ι,这里Ι ϑΞΨ/ (ϑΞϑΨ) / ,其中ϑΞ!ϑΨ和ϑΞΨ分别是所有位点上ϕξ!ϕψ和ϕξψ的算术平均值∀这里ϕξ ΕΞι,ϕψ ΕΨι,ϕξψ ΕΞιΨι,Ξι!Ψι分别是Ξ!Ψ群体中第ι个等位基因的频率∀群体内遗传距离∀随机扩增多态⁄ 片段的共享度根据下列公式 εταλ 计算 Φ {Ε[ Νξψ/(Νξ Νψ)]}/ν,Π Φ∀式中,Φ为相似率,Νξ和Νψ分别为个体ξ和个体ψ的随机扩增多态⁄ 位点数 Νξψ为两个体间相同的位点数,ν为个体间相比较的两两配对数,Π为遗传距离∀多态率∀多态率π ξ/ρ,其中ξ为具有多态性的位点,ρ为扩增出的总位点数∀2结果2.1ΡΑΠ∆扩增结果在 °⁄扩增中 所用引物为经过挑选的扩增谱带清晰稳定的 条引物 ≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ !≥ ∀选择扩增片段大小在 ) 之间的位点进行统计分析∀结果共检测到 个位点 平均每个引物扩增出 个位点∀其中 ≤的多态位点数为 个 多态率为 ≤≤的多态位点数为 个 多态率为 ≤≤ 的多态位点数为 个 多态率为 ⁄ 的多态位点数为 个 多态率为 ∀多态位点的显性频率为 家系 ≤在 ) 之间 家系 ≤≤在 ) 之间 家系≤≤ 在 ) 之间 家系⁄ 在 ) 之间∀各引物的扩增情况见表 ∀扩增结果显示 不同引物得到的扩增片段数各不相同 所揭示的多态性也不尽相同∀图 显示的是引物≥ 对 个家系的扩增结果 可以看出扩增位点数虽然居中 却显示很高的多态性 并且在 ! ! 处呈现子代所扩增的谱带强度比亲本大为增强的现象∀图 是引物≥ 对 个家系的扩增结果 可以看出扩增位点极多 且几乎皆为单态∀另外从整体的 °⁄扩增情况来看 亲本出现的谱带都能在子代中找到 并且有的像父本 有的像母本 有的是两者基因型的综合 符合典型的孟德尔共显性遗传规律∀表1各引物序列及四个家系的ΡΑΠ∆扩增情况× × . ∏ °⁄ ∏引物序列 .) .产物的总片段数产物的多态数≤ ≤≤≤ ≤⁄ ≤ ≤≤≤ ≤⁄≥ × ×≤ ≤ ≥ ×≤× × ≥ ≤≤ ≤×× × ≥ × × ≤≤≤≤ ≥ ≤ ≤ ×≤ ≥ ××≤≤≤≤≤≤ ≥ ≤ ×≤≤ ≤ ≥ × × ≤× ≥ × ≤ ≤ ≥ ≤× ≤≤ ≤≤ ≥ ≤≤× ≤ ≤ ≥ ≤≤ ≤≤× ×≤ ≥ ×≤ ×≤≤ ≥ ×≤×≤≤ ≤≤≤× ≥ ≤≤ ≤≤≤ ≤ ≥ ≤ ≤ ≤≤×≤ ≥ ≤ ×× ×≤ ≥ ×≤ ≤ ≤ ≤ ≥ × ≤≤×≤ ≥ ≤≤ ≤≤ ≤ ≥ ≤≤ ≤× ≤≤ ≥ × ≤≤≤ ≤≤× 合计2 24个家系各群体内的遗传距离家系 ≤中父母本之间的遗传距离为 父本对其子代的遗传距离为 母本对其子代的遗传距离为 子代个体间的遗传距离为 家系 ≤≤中父母本之间的遗传距离为 父本对其子代的遗传距离为 母本对其子代的遗传距离为 子代个体间的遗传距离为 家系≤≤ 中父母本之间的遗传距离为 父本对其子代的遗传距离为 母本对其子代的遗传距离为 子代个体间的遗传距离为 家系⁄ 中父母本之间的遗传距离为 父本对其子代的遗传距离为 母本对其子代的遗传距离为 子代个体间的遗传距离为 ∀期张国范等 皱纹盘鲍中国群体和日本群体的自交与杂交ƒ 的 °⁄标记图 个家系的 °⁄扩增情况ƒ × °⁄ ∏≥ 引物对四个家系的扩增产物大多为多态扩增位点数中等 ≥ 引物对四个家系的扩增产物大多为单态扩增位点数很高 引物∀ ) 家系 ≤ 表示母系 表示父系 其余为子代 ) 家系 ≤≤ 表示母系 表示父系 其余为子代 ) 家系≤≤ 表示母系 表示父系 其余为子代 )家系⁄表示母系 表示父系 其余为子代2 3 4个家系各群体内的平均杂合度家系 ≤子代群体的平均杂合度为 家系 ≤≤子代群体的平均杂合度为 家系≤≤ 子代群体的平均杂合度为 家系⁄ 子代群体的平均杂合度为 ∀2 4 4个家系子代群体间的遗传距离个家系子代家系间遗传距离的观察值为 ) 但最大值不是发生在 ≤≤和⁄之间 表 ∀表2 4个家系群体间的遗传距离× × ≤≤≤≤≤⁄≤ ≤≤ ≤≤ ⁄2 5 总群体的基因多样性及基因分化系数个子代总群体的基因多样性为 基因分化系数为 ∀海 洋 与 湖 沼 卷期张国范等 皱纹盘鲍中国群体和日本群体的自交与杂交ƒ 的 °⁄标记3讨论从扩增图片来看 °⁄呈典型的孟德尔共显性遗传规律 虽不能区分某一座位扩增出的⁄ 片段是纯合的还是杂合的 但其探测基因多态性效率高 是研究杂种优势的极好工具 可以从分子水平上提供基因多态性与杂种优势的关系∀个家系的平均杂合度说明两个杂交组合家系的杂合度均高于两个自交组合 从而可以预测杂交可能产生杂种优势 而这其中尤以亲本遗传距离最大的家系 ≤最为突出∀ ≤的两亲本间遗传距离为 家系 ≤≤的两亲本间的遗传距离为 家系≤≤ 的两亲本间遗传距离为 家系⁄ 的两亲本间遗传距离为 ∀说明本文中所用亲本的两不同地理群体的个体间的遗传距离确实大于两同一地理群体的亲本个体间遗传距离 但因样本少所以尚不能定论∀而中国与日本野生亲本的遗传距离都较大的事实说明 皱纹盘鲍的野生资源保护较好∀由亲本间较大的遗传距离可以产生子代群体较大杂合度这一事实说明 亲本间遗传差异大是产生杂种优势的基础∀然而 家系≤≤ 的亲本遗传距离虽较 ≤≤!⁄ 大很多 在家系的杂合度上并未表现出明显的增高 这其中原因尚不能很好说明∀但可以肯定的是 杂种优势是一复杂的遗传现象 亲本间的遗传差异无疑是重要的原因之一∀由表 可以看出 家系⁄ 与 ≤≤的子代群体间的遗传距离小于其他群体间的遗传距离 这其中的原因有可能是由于当初实验设计受实验条件所限造成的系统的部分开放所致∀另一原因可能是这种单交子代群体仅仅由单一个体父母亲本产生 而且各群体个体间的遗传变异水平较高∀因此 由两对个体产生的子代群体的群体间遗传距离能否与其这两个群体的两对父母本的遗传距离有对应的线性关系还值得讨论∀现有的理论只能比较个体与个体或群体与群体间遗传距离 还无法比较一对父母本对另一对父母本之间的遗传距离∀两个纯合子代群体在某一位点的基因频率很可能会同时都很高 导致/两个纯合子代群体间0的 值高于/一个纯合子代群体与一个杂合子代群体间0或/两个杂合子代群体间0的 值 从而造成在两个纯合子代群体间Π值 即群体间遗传距离 最小的事实∀因此 不能简单地用父母本间的遗传距离来推断子代群体间遗传距离∀各家系子代群体与父母亲本的遗传距离表明皱纹盘鲍的子代倾向于父本基因型的几率稍大 即雄性遗传占主导地位 在兴国红鲤Χψπρινυσχαρπιο√ .σινγυονενσισ与德国镜鲤Χψπρινυσχαρπιο√ σπεχυλαρισ的杂交中也出现类似结果 董在杰等 这其中的具体原因尚待进一步研究∀皱纹盘鲍在基因组水平上杂合度提高的贡献权重雄性占优这一结果在理论上有重要意义∀这一结果的应用价值在于 只要引进雄性亲本进行杂交 即有可能获得杂种优势∀皱纹盘鲍的繁殖特点是成熟雌性的产卵量只有几十万到百万 精子量则以数十亿计∀因此 在生产上只要引进雄性亲本并与本地群体杂交即可获得杂种优势 这样可大大降低生产成本 其潜在的经济效益是巨大的∀各家系子代间的遗传距离表明各家系子代个体间的遗传距离都远远低于其野生父母亲本间的遗传距离及子代与亲本的遗传距离 而子代各群体间遗传距离均小于 指示人工繁育过程中 一定要避免用人工培育群体内或群体间的子一代个体作为父母亲本 以免引起种质资源的严重退化 也提醒我们保护好现有的各地理群落的野生资源对鲍养殖业的可持续发展是非常重要的∀海洋与湖沼 卷从本文中的实验结果可以看出 直接利用中国野生皱纹盘鲍与日本野生皱纹盘鲍杂交可能获得较好杂种优势 本文为此提供了充分的分子生物学证据 同时也说明 °⁄做为一种简单快捷的分子标记 是预测杂种优势的极好手段 可以广泛应用于分子标记辅助育种∀但本文中提供的分子生物学证据也仅限于提供了杂种优势产生的趋势和标记∀由于杂种优势遗传机理极其复杂 一个杂交组合能否表现杂种优势不仅与双亲遗传差异有关 还与双亲遗传背景!所携带等位基因的类型!基因效应种类以及环境等一系列因素有关 许明辉 ∀杂交子代在生产上能否产生某些优良性状以及这些性状能否与这种标记相对应尚需做进一步研究∀致谢在实验过程中得到中国水产科学研究院黑龙江水产研究所孙孝文研究员!梁利群副研究员 以及中国科学院海洋研究所宋林生研究员和刘保忠博士的热心指导 谨致谢忱∀参考文献石拓 孔杰 刘萍等 中国对虾遗传多样性的 °⁄分析)))朝鲜半岛西海岸群体的⁄ 多态性 海洋与湖沼 )吕雪梅 杨关福 张细权等 蛋鸡品系 °⁄变异及其与杂种优势关系的分析 遗传 )刘萍 孔杰 石拓等 中国对虾黄渤海沿岸群亲本及子一代 °⁄分析 海洋水产研究 ) 刘必谦 戴继勋 巨蛎属牡蛎遗传多样性研究 水产学报 )刘必谦 戴继勋 喻子牛 °⁄标记在大连湾牡蛎种群研究中的应用 青岛海洋大学学报 )许明辉 烟草数量性状遗传距离与杂种优势关系的研究 遗传 )孙易 宋文芹 钟贻诚等 用 °⁄和 ƒ °的方法对中国卤虫 种及亲缘关系的研究 遗传学报 )孙效文 梁利群 鲤鱼的遗传连锁图谱 初报 中国水产科学 )宋林生 相建海 周岭华等 六种海产虾类基因组⁄ 多态性的 °⁄标记研究 海洋与湖沼 ) 宋林生 相建海 李晨曦等 日本对虾野生种群和养殖种群遗传结构的 °⁄标记研究 海洋与湖沼 )李斌 鲁成 周泽扬等 °⁄标记构建家蚕分子连锁图 遗传学报 )李祥龙 田庆义 马国强等 波尔山羊杂交后代及其亲本随机扩增多态⁄ 研究 遗传 )孙致良 张超良 金德敏等 °⁄技术在玉米自交系亲缘关系研究中的应用 遗传学报 )张细权 李加权 杨关福 动物遗传标记 北京 中国农业大学出版社 ) )张国范 李霞 我国贝类大规模死亡的现状 中国水产 )张四明 邓怀 晏勇等 中华鲟随机扩增多态性⁄ 及遗传多样性研究 海洋与湖沼 )季维志 宿兵 遗传多样性研究的原理与方法 杭州 浙江科学技术出版社 )梁利群 孙效文 闫学春 °⁄技术分析荷包红鲤抗寒品系与亲本的基因组变化 中国水产科学 ) 滕春波 孙效文 沈俊宝等 利用异源精子激发雌核发育的银鲫及亲本的 °⁄分析 水产学报 ) 董在杰 夏德全 吴婷婷等 兴国红鲤和散鳞镜鲤杂种优势的 °⁄分析 上海水产大学学报 )萨姆布鲁克 弗里奇∞ƒ 曼尼阿蒂斯×著 金冬雁 黎孟枫 张励等译 分子克隆 北京 科学出版社 )° × ⁄ √ √ ≤ Χρασσοστρεαϖιρ2γινιχα )∏ √ ≤ 2 ° ⁄ √ √ • 2 ) ⁄ ⁄⁄ εταλ ° ∏ Πεχτενµαξµιυσ • √ ⁄ ∞ ° ≥ )期张国范等 皱纹盘鲍中国群体和日本群体的自交与杂交ƒ 的 °⁄标记× ⁄εταλ ⁄ Τετραηψµενατηερµοπηιλα )≠ ∂ ∏ ∏¬≠ ⁄ ∞εταλ, ×≤ ≤ × ∞∏ 2 Οστρεαεδυλισ )• ∏ ∏ ° ≥ )∞ • ∏ ∞ ° εταλ ƒ ° √ ∏ 2 Πατινοπεχτενψεσσοενσισ ≥° ∞ ≤ εταλ × ∏ °⁄ ∏ Πλαχοπεχτενµαγελλανιχυσ ≥ )≤ √ ≤ ∏ ∏ ∏ ∏ ⁄ 2 Χρασσοστρεαϖιργινιχα )ΤΗΕΡΑΠ∆ΜΑΡΚΕΡΟΦΣΕΛΦ−ΒΡΕ∆ΑΝ∆ΗΨΒΡΙ∆ΠΡΟΓΕΝΨΒΕΤΩΕΕΝΧΗΙΝΕΣΕΑΝ∆ϑΑΠΑΝΕΣΕΠΟΠΥΛΑΤΙΟΝΣΟΦΗΑΛΙΟΤΙΣ∆ΙΣΧΥΣΗΑΝΝΑΙΙΝΟ∏ 2ƒ • 2 2∞ ± ∞ ∏ 2≠ ÷(ΙνστιτυτεοφΟχεανολογψ,ΤηεΧηινεσεΑχαδεµψοφΣχιενχεσ,Θινγδαο, )(∆αλιανΦισηεριεσΥνιϖερσιτψ,∆αλιαν, )(∆αλιανΙνστιτυτεοφΦισηεριεσΡεσεαρχη,∆αλιαν, )Αβστραχτ× ⁄ °⁄ ∏ ∏ √ 2 Ηαλιοτισδισχυσηανναι ∏ ≤ × ≤ α≅≤ ⎯ ≤≤ ≤ α≅≤ ⎯ ≤≤ ≤ α≅ ⎯ ⁄ α≅ ⎯ × √ ∏ ≤ ≤≤ ≤≤ ⁄ ∏ ∏ 2 ∏ × ≤ ≤≤ ≤≤ ⁄ √ ∏ 2 ∏ ∏ 2 ∏ √ ∏ ≤ ∏ √ × 2 ∏ ≤ ≤≤ ≤≤ ⁄ 2 × ∏ ≤ ≤≤ ≤≤ ⁄ × √ ∏ ¬ √ ∏ΚεψωορδσΗαλιοτισδισχυσηανναι ⁄ ∏ °⁄。

第37卷　第4期2006年7月海　洋　与　湖　沼OCEANOLOGI A ET L I M NOLOGI A SI N I CAVol 137,No 14July,2006皱纹盘鲍(H a liotis discus hanna i I no)胚胎RNA 分离和c D NA 文库构建3刘　晓　赵　敏　高其康　张国范(中国科学院海洋研究所　青岛　266071)(中国科学院海洋研究所　青岛　266071;中国科学院研究生院　北京　100039)(浙江大学分析测试中心　杭州　310029) 3国家自然科学基金项目,30271018号;国家863计划项目,2004AA626070号;青岛市自然科学基金项目,03222JZP 29号资助。

刘　晓,博士,研究员,E 2mail:liuxiao@m s .qdi o .ac .cn收稿日期:2005202216,收修改稿日期:2006201222提要 从皱纹盘鲍胚胎样本中分离RNA 并构建了c DNA 文库。

分别收集孵化8、10和12h 的皱纹盘鲍胚胎,用抽滤除菌的海水反复悬浮胚胎,将这3个发育阶段的胚胎样本等量混合后用T R I Z OL 试剂提取总RNA,将提取物用酚2氯仿2异戊醇再抽提2次,分离获得高质量的总RNA 。

从总RNA 中分离mRNA,构建了皱纹盘鲍混合胚胎的c DNA 文库,未扩增胚胎文库的滴度为510×106pfu /m l,重组率为94112%,插入片段均大于400bp,7016%克隆的插入片段分布在1000—1500bp 之间,扩增后的文库滴度为3106×109pfu /m l 。

关键词 皱纹盘鲍,胚胎,c DNA 文库,基因表达中图分类号 Q132 皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai I no )自然分布于北太平洋海区。

从上世纪80年代中期实现人工育苗以来,我国的皱纹盘鲍养殖业发展较快,现已成为重要的养殖贝类。

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1418542A[43]公开日2003年5月21日[21]申请号02144515.X[21]申请号02144515.X [22]申请日2002.11.01[71]申请人中国科学院海洋研究所地址266071山东省青岛市南海路7号[72]发明人张国范 赵洪恩 刘晓[74]专利代理机构沈阳科苑专利代理有限责任公司代理人许宗富 周秀梅[51]Int.CI 7A01K 67/033权利要求书 1 页 说明书 5 页[54]发明名称一种橘红壳色皱纹盘鲍新品系的制种方法[57]摘要本发明涉及皱纹盘鲍，具体地说是一种橘红壳色皱纹盘鲍新品系的制种方法。

它利用皱纹盘鲍橘红壳色突变体间的单交或群交，获得壳色性状一致的皱纹盘鲍新品系，具体是：取性成熟的皱纹盘鲍橘红壳色的突变体作为种鲍，置于海水中，饲以天然饵料，充天然空气，至性腺发育成熟；再采用阴干、升温和紫外线照射海水刺激方法进行催产；然后将分别获得的雌雄配子以单交或群交方式进行人工授精，经常规孵化及后期培育获得橘红壳色皱纹盘鲍新品系苗种。

本发明利用了自然群体或人工繁育群体内壳色突变体培育出具有鲜明特色的皱纹盘鲍新品系，没有外源基因的导入，方法简便，具有较强的可操作性，生产性状明显优于普通皱纹盘鲍，可以实现产业化应用。

02144515.X权 利 要 求 书第1/1页1.一种橘红壳色皱纹盘鲍新品系的制种方法，其特征在于：利用皱纹盘鲍橘红壳色突变体间的单交或群交，获得壳色性状一致的皱纹盘鲍新品系；可按如下步骤操作：1)种鲍选择：取自然地理群体或人工繁育群体中的性成熟皱纹盘鲍橘红壳色突变体作为种鲍；2)种鲍促熟：取大小为中等偏上的性成熟个体，置于16～20℃的海水中，培育密度为25～80枚/m3，饲以天然饵料，每天全量换水一次，充天然空气，有效积温900～1400度·日，培育环境照度为20～100Lux，至性腺发育成熟；3)催产：将性腺发育成熟的个体采用阴干、升温和紫外线照射海水刺激方法进行催产，具体为：在18～20℃、空气湿度为50～90％的条件下阴干60～120分钟，然后将雌雄种鲍分别置于不同的容器内，雌雄个体严格分离，注入升温至22～23℃、照射强度为300～1000mwh/L的紫外线处理海水，40～90分钟后可获得雌雄配子；4)将分别获得的雌雄配子以单交或群交方式进行人工授精；5)按常规孵化及后期培育方法即可获得橘红壳色皱纹盘鲍新品系苗种。

不同温度条件下皱纹盘鲍家系的生长比较和
综合评价
皱纹盘鲍是一种重要的经济海产品种，其生长受到温度等环境因素的影响。

为了了解不同温度条件对皱纹盘鲍家系的生长效果和综合评价，我们进行了一项实验研究。

在实验中，我们选择了三个不同温度条件，分别为低温组（15℃）、中温组（20℃）和高温组（25℃）进行比较研究。

每个温度组设置了相同的养殖池，并且每个组中有相同数量的皱纹盘鲍进行观察和测量。

经过一段时间的实验观察，我们发现在15℃的低温组中，皱纹盘鲍的生长速度相对较慢。

这可能是由于低温下代谢率降低、食物摄入量减少等因素的影响。

相比之下，在25℃的高温组中，皱纹盘鲍的生长速度相对较快。

可能是因为较高的温度提高了代谢活动，促进了食物消化吸收和细胞分裂，从而促进生长。

然而，仅仅考虑生长速度是不够全面的评价标准。

我们还需要综合考虑其他因素，例如鲍体形态、鲍壳硬度和免疫能力等。

在综合评价中，我们发现在20℃的中温组中，皱纹盘鲍表现出最佳的综合性能。

与低温组相比，在中温组中，皱纹盘鲍的体形更加匀称，壳硬度更高，并且免疫能力较强。

这可能是因为20℃的温度条件既提供了适宜的代谢活动，又避免了高温对鲍体造成的不利影响。

综上所述，不同温度条件对皱纹盘鲍家系的生长速度和综合评价有明显影响。

虽然高温组下生长速度较快，但综合性能方面中温组表现最佳。

这些研究结果可能对皱纹盘鲍的养殖管理和选育工作提供重要参考，有助于提高产量和品质。