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黄连HPLC数字化指纹图谱研究及7种生物碱含量测定一、本文概述本文旨在通过高效液相色谱（HPLC）技术对黄连的数字化指纹图谱进行深入研究，并精确测定其中7种主要生物碱的含量。
黄连作为一种重要的中药材，具有清热解毒、燥湿止痢等功效，被广泛应用于中医临床。
其药效与其中的生物碱类成分密切相关，因此对黄连中生物碱的深入研究对于评价黄连质量、指导药材合理使用及优化生产工艺具有重要意义。
本研究将通过HPLC技术的精确分析，构建黄连的数字化指纹图谱，明确各生物碱在黄连中的含量，为黄连的质量控制提供科学依据。
本文还将探讨黄连中生物碱含量与其药效之间的关系，为黄连的药效评价和药物研发提供新的思路和方法。
二、材料与方法黄连药材购自全国各地具有代表性的药材市场，并经专家鉴定确保其质量。
甲醇、乙腈等色谱纯试剂购自公司，磷酸等分析纯试剂购自公司。
7种生物碱标准品（小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱、表小檗碱、非洲防己碱、木兰花碱）购自公司，纯度均大于98%。
高效液相色谱仪（HPLC，型号：）配备二极管阵列检测器（DAD）及化学工作站；电子分析天平（精度：01mg）；超声波清洗器；旋转蒸发仪；离心机等。
将黄连药材粉碎成细粉，过目筛。
精密称取粉末适量，加入甲醇，于室温下超声提取分钟，离心后取上清液，用甲醇定容至一定体积，得黄连提取液。
色谱柱为C18柱（mm×mm，μm）；流动相为乙腈-磷酸水溶液（梯度洗脱）；检测波长设定为nm；柱温为℃；进样量为μL；流速为mL/min。
将黄连提取液按设定的色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图。
采用相似度评价软件对所得色谱图进行预处理和相似度计算，构建黄连的HPLC数字化指纹图谱。
精密称取7种生物碱标准品适量，分别用甲醇溶解并定容至不同浓度，按设定的色谱条件进行HPLC分析，记录峰面积。
以峰面积为纵坐标，生物碱浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
将黄连提取液按设定的色谱条件进行HPLC分析，根据标准曲线计算各生物碱的含量。
黄连总生物碱的提取纯化及含量测定张中华;赵亚兰【摘要】目的:建立黄连醇提物、黄连总生物碱的提取纯化及含量测定.方法:黄连粗粉用22倍量70％乙醇提取,提取液回收乙醇,浓缩成干膏;取部分干膏用1 0倍量0.5％硫酸溶解、静置、过滤,酸水液加石灰乳调pH至10～ 12,过滤,滤液加浓HCL调pH为1～2,再加入药液量6％～ 10％的氯化钠盐析,放置,过滤,得沉淀A 与滤液A;将沉淀A溶于1 0倍量热水,加石灰乳调pH8.5 ～9,趁热过滤,再将滤液加HCL调至pH 2～3,放置,过滤,沉淀水洗至中性,抽干,将得到的总生物碱反复用热水溶解处理.将滤液A加氨水调至pH 8～9,放置,过滤,再将沉淀用乙醇重结晶,得小檗胺;用紫外分光光度法定总生物碱含量.结果:得黄连干膏,黄连总生物碱(纯度为92.84％) 15.8 9,小檗胺1.5g;盐酸小檗碱在浓度为0.579 μg/mL～8.682 μg/mL 范围内,线性方程为A=81.159C-0.02 2,r=0.999 9,浓度与吸光度呈现良好的线性关系.结论:制备黄连醇提物及黄连中总生物碱的方法简便易操作;盐酸小檗碱的含量测定方法稳定性好,精密度较高,重现性好,操作简便.【期刊名称】《西部中医药》【年(卷),期】2018(031)004【总页数】4页(P49-52)【关键词】黄连;总生物碱;提取纯化;紫外-可见分光光度法【作者】张中华;赵亚兰【作者单位】甘肃省中医院药学部,甘肃兰州730050;甘肃省中医院药学部,甘肃兰州730050【正文语种】中文【中图分类】R284黄连为毛茛科植物黄连(Coptis.chinensis Franch.)、三角叶黄连(Copfis.deltoidea C.Y.Chenget Hsiao)或云连(Coptis.teeta wall)的干燥根茎，作为中药始载于东汉《神农本草经》，被列为上品［1］。
其性寒味苦，可清热燥湿，泻火解毒。
HPLC法鉴定不同产地黄连饮片中含生物碱的研究摘要】目的：研究高效液相色谱法（HPLC）在不同产地黄连饮片中生物碱检测中的价值。
方法：选择HPLC法分别检测各区域黄连中生物碱情况。
结果：不同区域黄连中小檗碱、黄连碱、表小檗碱、巴马汀生物碱以及总含量具有一定差别，其中四川洪雅县的黄连生物碱含量较高，而云南德钦县较低。
结论：HPLC在不同区域黄连生物碱的检验中效果显著，操作较为方便，具有一定重复性，鉴定结果的准确率较高，值得广泛推广及应用。
【关键词】生物碱；黄连；高效液相色谱法；饮片【中图分类号】R927.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）21-0362-01黄连属于常见的中药饮片，具有泻火解毒、清热燥湿的功效，取得了较高的临床价值。
黄连的主要成分为生物碱，若能够准确掌握黄连中有效成分，选择疗效确切的鉴定方式在保证饮片质量中具有重要意义。
临床上常采取紫外分光光度计或者薄层扫描方式进行鉴定，虽然取得过一定检验价值，但效果并不明显[1]。
其中薄层扫描鉴定结果的准确性较低，而紫外分光光度计仅能够检出黄连中生物碱的总含量。
随着鉴定技术不断完善，临床认为采取HPLC法鉴定效果显著，不仅能够检出各生物碱含量，同时能够保证结果准确[2]。
因此本文展开研究，探讨HPLC法在不同区域黄连生物碱的检验中的价值，现作出如下报道。
1.资料与方法1.1 仪器与试剂日本日立公司生产的高效液相色谱仪器、色谱柱、超声波清洗器、电子分析天平、色谱数据工作站、乙腈色谱纯试剂、盐酸小檗碱以及双蒸水等。
1.2 方法将盐酸小檗碱判定为对照，按照HPLC法分别检测黄连中各生物碱含量。
1.3 色谱条件色谱柱为4.6mm*250mm，5um；流动相50:50的乙腈-0.1%磷酸液体，与0.1g/100ml的十二烷基磺酸钠混合，柱温设置为30℃，检验波长345nm，流速1.0ml/min。
1.4 配置溶液将100℃干燥后的盐酸小檗碱放入流动相中，浓度设置成240.6ug/ml；取0.1g黄连粉末，放置于锥形瓶中，加入流动相（80ml），采取超声处理，频率200W，功率40kHz，时间控制35min左右。
HPLC法测定黄连药材及其炮制品中六种生物碱的含量阳勇;罗维早;孙建彬;王欣;花雷;李隆云;覃瑶【摘要】An HPLC method to determine six alkaloids of the Coptidis for Chinese Pharmacopoeia of 2015 Edition was established through C18 column. The mobile phase was CH3CN-0.25 mol·L-1 NH4Ac (36:64) (containing 8 mmol·L-1 SDS and adjusting pH 9.3 with ammonia) at the flow rate of 1 mL·min-1, the detective wavelength was 270 nm and the column temperature was 35 oC. The linear ranges of jatrorrhizine hydrochloride, columbamine hydrochloride, epiberberine hydrochloride, coptisine hydrochloride, palmatine hydrochloride and berberine hydrochloride were 0.006 96-0.233, 0.004 75-0.152, 0.003 30-0.528, 0.006 31-1.010, 0.004 71-0.753, 0.017 8-2.884 μg·mL-1, respectively. The average recoveries were 99.65%, 98.59%, 98.49%, 98.66%, 98.64%, 98.63% and RSD were 0.03%、0.15%、0.21%、0.12%、0.28%、0.23%, respectively. The method is simple and accurate, and can be used to determine the contents of jatrorrhizine, columbamine, epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in the Coptidis.%目的:测定黄连药材及其炮制品中盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的含量,制定2015年版《中国药典》中黄连及其炮制品的质量标准.方法:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-0.25 mol·L-1乙酸铵和8 mmol·L-1十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液(氨水调节pH 9.3)(36:64)为洗脱剂,流速1 mL·min-1,检测波长270 nm,柱温35℃.结果:盐酸药根碱、盐酸非洲防己碱、盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的线性范围依次为0.006 96-0.233、0.004 75-0.152、0.003 30-0.528、0.006 31-1.010、0.004 71-0.753、0.017 8-2.884μg·mL-1;加样回收率依次为99.65%、98.59%、98.49%、98.66%、98.64%、98.63%,RSD依次为0.03%、0.15%、0.21%、0.12%、0.28%、0.23%.结论:该方法简便、准确、可靠,可作为2015年版《中国药典》(一部)黄连质量标准中的含量测定方法.【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》【年(卷),期】2015(017)003【总页数】7页(P596-602)【关键词】黄连;HPLC;生物碱;含量测定【作者】阳勇;罗维早;孙建彬;王欣;花雷;李隆云;覃瑶【作者单位】重庆市中药研究院重庆 400065;重庆市中药研究院重庆 400065;重庆市中药研究院重庆 400065;第三军医大学大坪医院野战外科研究所药剂科重庆400042;重庆市中药研究院重庆 400065;成都中医药大学中药学院成都 610072;重庆市中药研究院重庆 400065;重庆市中药研究院重庆 400065;重庆市中药研究院重庆 400065;太极集团有限公司重庆 401147【正文语种】中文【中图分类】R284.1黄连为毛茛科植物黄连 Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall. 的加工品[1]，其化学成分主要为生物碱类物质[2-5]。
HPLC法测定不同产地黄连饮片中生物碱的含量罗文汇;李养学;胥爱丽;孙冬梅【摘要】目的考察不同产地黄连饮片中生物碱的含量.方法采用高效液相色谱法测定不同产地黄连饮片中表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱4种生物碱的含量,以乙腈-0.1%磷酸溶液(50:50)(每100Ll加十二烷基磺酸钠0.1g)为流动相,Agilent ZORBAx Eclipse XDB C18柱(4.6mm×250mm,5μm)为固定相,流速为1.0L/min,柱温为35℃,检测波长为345nm.结果盐酸小檗碱在0.096～0.480 μg范围内呈线性关系,回收率为97.95%,RSD为1.03%.结论本法测定黄连饮片中4种生物碱含量简单、快速、准确、重现性好,符合含量测定建立的要求,可以为判断黄连饮片质量的方法之一.【期刊名称】《中国医药指南》【年(卷),期】2010(008)030【总页数】2页(P223-224)【关键词】黄连饮片;表小檗碱;黄连碱;巴马汀;小檗碱;高效液相色谱法【作者】罗文汇;李养学;胥爱丽;孙冬梅【作者单位】广东省中医研究所,510095【正文语种】中文【中图分类】R282.710.3黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Fanch.、三角叶黄连Coptis deltoideaC.Y.Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎。
具有清热燥湿，泻火解毒的功效，用于湿热痞满，呕吐吞酸，泻痢，黄疸，高热神昏，心火亢盛，心烦不寐，心悸不宁，血热吐衄，目赤，牙痛，消渴，痈肿疔疮；外治湿疹，湿疮，耳道流脓。
黄连有效成分为多种生物碱[1]。
本文采用高效液相色谱法以盐酸小檗碱为对照，分别计算表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的含量，比较了8个产地黄连饮片，为更好的控制黄连饮片质量提供了依据。
1 仪器与试药Agilent 1200高效液相色谱仪（美国）；Mettler-Toledo XS205DU电子分析天平（瑞士）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱。
HPLC法测定黄连中生物碱的含量作者：毛英王欢游仙丹等来源：《农业开发与装备》 2016年第1期毛英1，王欢2，游仙丹1，刘思1，连琰1*（1.怀化学院化学与材料工程学院，湖南怀化 418000；2.湖南大学化学化工学院，湖南长沙 410083）摘要：目的：研究中药材黄连中生物碱的HPLC测定方法。
方法：采用BDS Hypersil C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；以乙腈、0.05mol·L-1磷酸二氢钾溶液（50：50）（每100ml中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH值为4.0）为流动相；检测波长为345nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：30℃；进样量：20μL。
结果：盐酸小檗碱在0.3～1.2μg范围内呈良好的线性关系，R2＝0.9935（n＝5），加样回收实验的平均回收率达到100.41%，RSD＝1.2%（n＝9）。
结论：该方法简便、准确、重现性好，可用于黄连药材中生物碱含量的控制方法。
关键词：高效液相色谱法；黄连；生物碱；药理研究；盐酸小檗碱0 引言黄连为多年生毛茛科草本植物[1-2]，药用部分主要取自黄连、三角叶黄连、峨嵋山野连或云连的根茎[3]。
野生黄连主要产于四川、云南、湖北，现今多采用荫棚栽培。
秋季采挖，除去须根和泥沙，干燥。
黄连作为临床常用药物，用于治疗湿热痞满、呕吐吞酸、泻痢、黄疸、高热神昏、心火亢盛、心烦不寐、血热吐衄、目赤、牙痛、消渴、痈肿疔疮；外治湿疹、湿疮、耳道流脓等[4]。
此外，黄连还具有很多药理作用譬如：抗病毒作用、抗阿米巴作用、抗炎、抗腹泻作用、对心血管作用、降血糖作用、降血脂作用、抗氧化作用、对血液系统的影响、抗溃疡作用[5-6]。
由于黄连的种类与炮制方法都非常多，地理分布也比较广泛，因此作为药材它们的质量不易控制。
黄连的主要药用成份生物碱的含量的准确测定对评价不同产地黄连与质量监控具有重要意义。
HPLC 法测定黄连药材及其炮制品中主要生物碱的含量阳勇1，李铁刚1，朱晶晶2，钟国跃1，王欣1，王智民2，武小 1，罗维早1*（1.重庆市中药研究院，重庆400065；2.中国中医科学院中药研究所，北京100700）收稿日期：2009-11-18基金项目：国家科技支撑计划项目-川产道地药材川贝母、白芷、黄连的系统研究与开发（2007BAI40B03）；《中国药典》2010版姜黄连炮制品标准制定（Yz-252）；《中国药典》2010版酒黄连炮制品标准制定（Yz-251）；《中国药典》2010版萸黄连炮制品标准制定（Yz-253）；《中国药典》2010版黄连饮片标准制定作者简介：阳勇（1979－），男，助理研究员，主要从事中药化学研究。
E-mail ：yangychem@ *通讯作者：罗维早（1962－），男，研究员，主要从事中药化学及新剂型方向的研究工作。
Tel ：（023）89029026E-mail ：loweizao@ 关键词：黄连；HPLC ；盐酸表小檗碱；盐酸黄连碱；盐酸巴马汀；盐酸小檗碱摘要：目的：测定黄连药材及其炮制品中盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的含量，制定2010年版《中国药典》中黄连及其炮制品的质量标准。
方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈－50mmol /L 磷酸二氢钾溶液（50ʒ50）（混合液中加15mmol /L 十二烷基硫酸钠，再以磷酸调节pH 为4.0）；流速：0.6mL /min ；检测波长：345nm ；柱温：30ħ。
结果：黄连药材中盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱的含量分别不得少于0.93%、1.80%、1.45%、6.00%；黄连饮片、酒黄连、姜黄连和萸黄连中盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱含量分别不得少于0.70%、1.50%、1.10%和5.00%。
结论：该方法简便、灵敏、重现性好，适用于黄连及其炮制品质量品质的控制。
中图分类号：R283文献标识码：A文章编号：1001-1528（2010）09-1540-05Determintion of main alkaloids in crude and processed Rhizoma Coptidis by HPLCYANG Yong 1，LI Tie-gang 1，ZHU Jing-jing 2，ZHONG Guo-yue 1，WANG Xin 1，WANG Zhi-ming 2，WU Xiao-yun 1，LUO Wei-zao 1*（1.Chongqing Academy of Chinese Materia Medica ，Chongqing 400065，China ；2.Institute of Chinese Materia Medica ，China Academy of Chinese Medi-cal Sciences ，Beijing 100700，China ）KEY WORDS ：Rhizoma Coptidis ；HPLC ；epiberberine ；coptisine ；palmatine ；berberineABSTRACT ：AIM ：The contents of epiberberine hydrochloride ，coptisine hydrochloride ，palmatine hydrochlo-ride ，and berberine hydrochloride in the crude and processed Rhizoma Coptidis were determined to establish their quality standards for editing Chinese pharmacopoeia of 2010edition.METHODS ：The C 18column was used ，the mobile phase was acetonitrile-50mmol /L monopotassium phosphate （50ʒ50）（containing 15mmol /L SDS and ad-justing pH =4.0with phosphoric acid ）at the flow rate of 0.6mL /min ，the detective wavelength was set up at 345nm and the column temperature was 30ħ.RESULTS ：The contents of epiberberine hydrochloride ，coptisine hydrochloride ，palmatine hydrochloride ，and berberine hydrochloride in Coptidis above 0.93%，1.80%，1.45%and 6.00%，respectively.The contents of epiberberine hydrochloride ，coptisine hydrochloride ，palmatine hydro-chloride ，and berberine hydrochloride in Rhizoma Coptidis decoctin pieces ，Rhizoma Coptidis processed with wine ，Rhizoma Coptidis processed with ginger and Rhizoma Coptidis processed with Fructus Evodia above 0.70%，1.50%，1.10%，5.00%，respectively were of the utmost importance.CONCLUSION ：The method is simple and accurate ，and can be used to control the quality of the curde and processed Rhizoma Coptidis.451黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的加工品［1］，常用的炮制品有黄连饮片、酒黄连、姜黄连、萸黄连。
2005年版《中国药典》一部黄连含量测定项下仅以小檗碱作为对照，采用薄层色谱扫描法测定，且仅规定了黄连药材中小檗碱的标准。
小檗碱虽是黄连的活性成分之一，但在黄柏、三棵针、十大功劳、唐松草等植物中都存在，且目前已有作为医药原料药的小檗碱生产上市，显然以此作为黄连唯一的指标成分客观性和专属性较差；薄层色谱扫描法影响因素多，操作较复杂，已逐渐被HPLC替代进行含量测定；黄连炮制品系黄连用药的主体，故不仅要求对黄连药材进行质量控制，更需要制定其炮制品的质量标准。
本实验在参考文献［2-4］的基础上，采用液相色谱法，对不同来源、批次的黄连药材及其炮制品进行了含量测定，并制定了相应标准。
1仪器与试药岛津LC－2010型液相色谱仪（含自动进样器，Class VP6.1－sp1色谱系统）；三用紫外线分析仪（上海顾村电光仪器厂）；KQ250DB型数控超声波清洗器（巩义市予华仪器有限责任公司）；AUW220D 型电子天平（十万分之一，日本岛津公司）；BS224S 型电子天平（万分之一，德国赛多利斯公司）；盐酸巴马汀对照品（批号：110732—200506），盐酸小檗碱对照品（批号：110713—200208），盐酸药根碱对照品（批号：0733—200005），以上3个均由中国药品生物制品检定所提供；盐酸表小檗碱对照品、盐酸黄连碱对照品由本院药化室提供，纯度98%以上；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
黄连药材及其炮制品来源于2010年版《中国药典》项目，均经重庆市中药研究院生药室钟国跃研究员鉴定确认。
2方法与结果2.1色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈－50mmol/L磷酸二氢钾溶液（50：50）（混合液中加15mmol/L十二烷基硫酸钠，再以磷酸调节pH为4.0）；流速：0.6mL/min；检测波长：345nm；柱温：30ħ；进样量：10μL。
理论板数按盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱峰计算应均不低于5000。
2.2对照品溶液的制备取盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱对照品各适量，精密称定，用甲醇制成每1mL含有9、17、12、60μg的混合对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备取药材粉末（过二号筛）约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇－盐酸（100ʒ1）的混合液50mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液2mL至10mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4样品测定取黄连药材及其炮制品样品，照2.3项下制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，色谱图见图1 2，结果见表1 5（带*的数据为Q检验和G检验的不合格数据）。
图1混合对照品HPLC图谱Fig.1HPLC chromatogram of referencestandards图2样品HPLC图谱Fig.2HPLC chromatogram of sample运用统计方法中的Q检验法和G检验法对极值及相关数据进行检验，淘汰不合格数据，将剩余值求平均值。
黄连药材的盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱平均值分别为0.93%、1.85%、1.45%、6.01%；黄连饮片的盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱平均值分别为0.73%、1.50%、1.13%、5.02%；酒黄连饮片的盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱平均值分别为0.60%、1.18%、0.97%、4.26%；姜黄连饮片的盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱平均值分别为0.65%、1.32%、0.99%、4.46%；萸黄连饮片的盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱平均值分别为0.67%、1.32%、1.06%、4.60%。
再综合分析，规定限度：确定黄连药材含盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱分别不得少于0.93%、1.80%、1.45%和6.00%；黄连饮片、酒黄连、姜黄连和萸黄连中盐酸表小檗碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马1451汀和盐酸小檗碱含量分别不得低于0.70%、1.50%、1.10%和5.00%。
