微生物实验指导书-教材

微⽣物实验指导书-教材

微⽣物学实验指导书

⽬录

实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术 (3)

实验⼆培养基的配制 (8)

实验三从⼟壤中分离微⽣物及纯化 (11)

实验四微⽣物的接种技术 (14)

试验五细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察 (17)

实验六细菌的简单染⾊和⾰兰⽒染⾊ (20)

实验七⼤肠杆菌⽣长曲线的测定 (23)

实验⼋实验室环境和⼈体表⾯微⽣物的检查 (25)

实验九乳酸菌的检测 (28)

实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术

【⽬的要求】1. 学习并掌握棉塞制作的⽬的、原理及⽅法；

2. 学习并掌握玻璃器⽫清洗及包扎⽅法；

3.掌握⾼压蒸汽灭菌的基本原理及操作⽅法。

4.了解其它常⽤消毒灭菌技术原理及技术

【基本原理】

棉塞的作⽤有⼆：⼀是防⽌杂菌污染，⼆是保证通⽓良好。因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有较⼤的影响。

微⽣物学实验所⽤的器⽫，⼤多数要进⾏清洗、消毒、灭菌，才能⽤来培养微⽣物。玻璃器⽫的包扎⽅法正确合理，在使⽤过程中才能有效防⽌杂菌的污染。玻璃器⽫包扎好后，⼀般⽤⾼压蒸⽓灭菌法进⾏灭菌。

⾼压蒸⽓灭菌是将待灭菌的物品放在⼀个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的⽔沸腾⽽产⽣蒸⽓。待⽔蒸⽓急剧地将锅内的冷空⽓从排⽓阀中驱尽，然后关闭排⽓阀，继续加热，此时由于蒸⽓不能溢出，⽽增加了灭菌锅内的压⼒，从⽽使沸点增⾼，得到100℃以上的⾼温，导致菌体蛋⽩质凝固变性⽽达到灭菌的⽬的。此外，常见灭菌⽅法还有⼲热灭菌、灼烧灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等。对空间灭菌常使⽤甲醛加⾼锰酸钾熏蒸、喷洒消毒灭菌药剂等消毒灭菌⽅法。

【实验⽤品】

棉花，试管，培养⽫，纱布，三⾓瓶，棉线，量筒，⽜⽪纸（或旧报纸），LDZX-50KBS ⽴式⾼压蒸⽓灭菌锅，常⽤灭菌⽤具、药剂等等。

【⽅法步骤】

⼀、棉塞的制作

正确的棉塞要求形状，⼤⼩，松紧与试管⼝（或三⾓瓶⼝）完全适合，过紧妨碍空⽓流通，操作不便；过松则达不到滤菌的⽬的。制作过程见图1，包括取棉花、整理、折⾓、卷紧、成形、塞试管等步骤。塞上棉塞时，应使棉塞长度的1/3在试管⼝外，2/3在试管⼝内。

A. 内部框架

B. 带盖外筒 图3 培养⽫⾦属灭菌筒 图1 棉塞制作过程做棉塞的棉花要选纤维较长的，⼀般不⽤脱脂棉做棉塞，因为它容易吸⽔变湿，造成污染，⽽且价格昂贵。此外，在微⽣物实验和科研中，往往要⽤到通⽓塞，即⽤⼏层纱布（⼀般8层）相互重叠⽽成，或是在两层纱布间均匀铺⼀层棉花⽽成。这种通⽓塞通常加在装有液体培养基的三⾓烧瓶⼝上。经接种后，放在摇床上进⾏振荡培养，以获得良好的通⽓促使菌体的⽣长或发酵，通⽓塞的形状如图2。A. 配制时纱布塞法；

B. 灭菌时包⽜⽪纸；

C. 培养时纱布翻出

图2通⽓塞

⼆、玻璃器⽫的清洗1. 不能⽤有腐蚀性的化学试剂，也不能使⽤⽐玻璃硬度⼤的物品来擦拭玻璃器⽫；新的玻璃器⽫应⽤2%的盐酸溶液浸泡数⼩时，⽤⽔充分洗⼲净。2. ⽤过的器⽫应⽴即洗涤。

3. 强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在废液缸内。

4. 含有琼脂培养基的器⽫可先将培养基刮去，或⽤⽔蒸煮，⾄培养基融化后倒出，然后再⽤洗洁精清洗。凡遇有传染性材料的器⽫，应经⾼压蒸汽灭菌后再进⾏清洗。5. ⼀般的器⽫可以⽤去污粉、肥皂或洗洁精清洗，油脂很重的器⽫应先将油脂擦去。沾有煤膏、焦油及树脂⼀类物质，可⽤浓硫酸或40%氢氧化钠或⽤洗液浸泡；沾有蜡或有油漆物，可加热使之熔融后揩去，或⽤有机溶剂（苯、⼆甲苯、汽油、丙酮等）揩去。6. 载玻⽚或盖玻⽚，先擦去油垢再清洗⼲净，然

后在稀的洗液⾥浸泡2 ⼩时，⽤清⽔冲净，最后⽤蒸

馏⽔冲洗，⼲后浸于95%酒精中保存备⽤。7. 洗涤后的器⽫应达到玻璃壁能被⽔均匀润湿

⽽⽆条纹和⽔珠。

三、玻璃器⽫的包装1. 培养⽫的包装

培养⽫常⽤旧报纸紧紧包裹，⼀包7～10套，包好后

⼲热或湿热灭菌。如果将培养⽫放⼊⾦属筒内进⾏⼲

热或湿热灭菌，则不必⽤纸包，⾦属筒有⼀圆筒形的

带盖外筒，⾥⾯放⼀装培养⽫的带底框架（图3），此

图5 LDZX-50KBS 灭菌锅

图6 LDZX-50KBS 灭菌锅及控制⾯板

框架可⾃圆筒内提出，以便装取培养⽫。2. 移液管的包装

准备好⼲燥的移液管，在距其粗头顶端约0.5 cm 处，塞约1.5 cm 长的棉花，以免使⽤时将杂菌吹⼊其中，或不慎将微⽣物吸出管外。棉花要松紧适当（过紧，吹吸液体太费⼒；过松，吹⽓时棉花会下滑），接着按图4⽅法包扎，后将移液管集中在⼀起，⽤⼀张⼤报纸包好，进⾏⼲热或湿热灭菌。图4 移液管的包扎⽅法与步骤3. 试管和三⾓瓶的包扎

试管管⼝和三⾓瓶瓶⼝塞上棉花塞或硅胶塞后，再⽤双层报纸包扎好（如有⽜⽪纸，效果更好），进⾏⼲热或湿热灭菌。试管较多时，⼀般7个或10个⼀组，再⽤双层报纸包扎。

四、灭菌及净化设备操作技术

（⼀）⾼压灭菌锅的使⽤

利⽤⾼压⽔蒸汽⾼强度穿透细胞杀灭⼀切微⽣物及细胞。

主要灭菌原理是⾼温度⽔蒸⽓（⼀般为121℃）作⽤于细胞⼀定时间（⼀般为20-30分钟）使细胞蛋⽩质凝固变性，⽽造成⼀切微⽣物变性死亡，是最为彻底的灭菌⽅法之⼀。主要操作技术见教材及实验操作步骤部分。

（⼆）超净⼯作台的使⽤1） 依次打开电源开关及⼯作开关，紫外灯照射20 min ，开启⿎风机运转10 min ，⽅可进⾏实验操作。

2） 将紫外灯切换到照明灯（⿎风机保持运转），打开玻璃门（玻璃门开启幅度不能过⾼，以不超过下巴为宜），⼿臂进⼊操作台前先点燃酒精灯，再⽤75%

的酒精棉球擦净⼯作

图7 摆斜⾯

图9 电热⼲燥箱外观和结构

图8微孔滤膜过滤器装置构 ⾯，并对

⼿进⾏消毒。3） 操作时，应在⼯作台中央⽆菌区域进⾏（尽量

不要讲话）。4） 操作完毕后熄灭酒精灯，清理⼯作台。离开前，

关闭⼯作台⼯作开关及电源开关，将所有物品归位，并带

⾛废弃物。

（三）其他常⽤灭菌⼯具

五、实验具体操作步骤1. 器⽫清洗：将试管、三⾓瓶、培养⽫等玻璃器具清洗⼲净；

2. 烘⼲：将经清洗⼲净的试管、三⾓瓶、培养⽫等玻璃器⽫放⼊烘箱中，并相互之间保持适当间距，以保证烘⼲效果；打开烘箱电源，设置适当温度（可根据具体情况⽽定）与时间，进⾏烘⼲处理；3. 制作棉塞：按照选取棉花、棉花整理、折⾓、卷紧、成形、试塞、调整⼤⼩等步骤，制作合适棉塞，应使棉塞长度的1/3在试管⼝外，2/3在试管（或三⾓瓶）⼝内。另⽤量筒或吸管取适量⾃来⽔于三⾓瓶和试管中，包扎好以制备⽆菌⽔。4. 包扎：⽤⽜⽪纸或旧报纸，⼀次包扎7～10套培养⽫，按照裁剪⽜⽪纸、放置培养⽫等玻璃器⽫、卷紧、折边、包扎等步骤，包扎好后空培养⽫、移液管等，做到美观⼤⽅、放置不到、包扎紧密，严防玻璃器⽫等露出。5. 灭菌处理：1） 打开电源与开关，检查⽔位显⽰灯，视⽔位显⽰灯状况，不加或添加适量⽔（⾼⽔位：不必加⽔；低⽔位：视情况⽽定；缺⽔：必加⽔；⽆显⽰：视情况⽽定）。2） 加灭菌物品（注意：物品不能过于密集，否则会影响灭菌效果）。

3） 将锅盖旋到灭菌锅正上⽅密封处（注意：锅盖⽤⼿提着缓慢旋⾄正上⽅，不要触及密封圈，造成密封圈破损，也不要将锅盖旋得太⾼，否则锅盖⽆法归位⾄正上⽅）。4） 按待灭菌物品的要求，设定温度和时间。

5） 进⼊⼯作状态后，查看排⽓（⽔）阀，将阀门旋⾄排⽓处。

6） 待有⼤量⽩⾊蒸汽产⽣时，关闭排⽓阀，关闭后温度持续上升

（注意：在使⽤⾼压

蒸⽓灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空⽓的排除是否完全极为重要）。7）灭菌结束，压⼒降⾄“0”时，打开排⽓阀，⽓体排尽后，⽅可开盖，利⽤锅内温度烤⼲棉塞和纱布后再取物。（注意：压⼒⼀定要降到"0"时，才能打开排⽓阀，开盖取物，否则就会因锅内压⼒突然下降，使容器内的培养基由于内外压⼒不平衡⽽冲出烧瓶⼝或试管⼝，造成棉塞沾染培养基⽽发⽣污染，甚⾄灼伤操作者）。3、其他常见灭菌⽅式

【实验结果】

记录⾃⼰制作的实验⽤品（含⽆菌⽔）的名称、规格与数量。

【注意事项】1. 实验前，熟悉实验室布局，了解实验仪器⽤品摆放规律及⽤途；

2. 制备⽆菌⽔时，试管装⽔量⼀般控制在试管⾼度的1/5~3/5，三⾓瓶装⽔量不宜超过规格

容量的1/2（装量过多，灭菌过程中易喷出或润湿棉塞）；3. 灭菌锅的操作安全。

【实验思考题】1. ⾼压蒸⽓灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空⽓排尽？

2. 灭菌完毕后，为什么待压⼒降低⾄“0”时，才能打开排⽓阀，开盖取物？

3. 在使⽤⾼压蒸⽓灭菌锅灭菌时，怎样杜绝⼀切不安全的因素？

4. 灭菌在微⽣物实验操作中有何重要意义？

实验⼆培养基的配制

【⽬的要求】1. 掌握培养基的配制原理；

2. 通过对⼏种培养基的配制，掌握配制培养基的⼀般⽅法和步骤。

【基本原理】

培养基是⼈⼯配制的适合微⽣物⽣长繁殖或积累代谢产物的营养基质，⽤以培养、分离、鉴定、保存各种微⽣物或积累代谢产物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、能源、⽆机盐、⽣长因素和⽔。本实验通过配制适⽤于⼀般细菌、放线菌和真菌的三种培养基来了解和掌握配制培养基的基本原理和⽅法。

培养细菌⼀般⽤⽜⾁膏蛋⽩胨培养基，它是⼀种应⽤⼗分⼴泛的天然培养基，其中的⽜⾁膏为微⽣物提供碳源、能源、磷酸盐和维⽣素，蛋⽩胨主要提供氮源和维⽣素，⽽NaCl 则提供⽆机盐。⾼⽒Ⅰ号培养基是⽤来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基，此合成培养基含有多种化学成分已知的⽆机盐，这些⽆机盐可能相互作⽤⽽产⽣沉淀，因此，在混合各成分时，⼀般按配⽅要求的顺序依次溶解各成分；此外，合成培养基有的还要补充微量元素，如⾼⽒Ⅰ号培养基中的FeSO4·7H2O的⽤量仅为0.001%，在制备培养基时需预先配成⾼浓度的微量元素贮备液，然后再按⼀定的量加到培养基中。查⽒培养基是⽤来分离和培养霉菌的合成培养基；麦⽒培养基是⽤来分离和培养酵母菌的半合成培养基。

培养基各成分添加完成后，⽤稀酸或稀碱将其pH值调⾄所需酸碱度，在配制固体培养基时，还要加⼊⼀定量的琼脂作为凝固剂。培养基配制完成后，应⽴即进⾏灭菌。【实验⽤品】1. 药品、试剂⽜⾁膏，蛋⽩胨，NaCl，可溶性淀粉，KNO3，K2HPO4·3 H2O，MgSO4·7 H2O，

FeSO4·7 H2O，蔗糖，NaNO3，KCl，葡萄糖，KCl，酵母膏，醋酸钠，lmol/L NaOH，lmol/L HCl，琼脂

2. 仪器及其它⽤品试管，三⾓瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，⽜⾓匙，pH试纸，棉花，

⽜⽪纸，记号笔，线绳，纱布，漏⽃，漏⽃架，胶管等

【⽅法步骤】

⼀、⽜⾁膏蛋⽩胨培养基的配制

（⼀）配⽅：⽜⾁膏5g，蛋⽩胨10g，NaC1 5g，琼脂15~20g，⽔1000mL，pH7.4~7.6；（⼆）步骤：1. 称量按配⽅计算实际⽤量后，称取各种药品放⼊烧杯中。⽜⾁膏常⽤玻璃棒挑取，放

⼊⼩烧杯或表⾯⽫中称量，⽤热⽔溶化后倒⼊烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放⼊热⽔中，待⽜⾁膏与称量纸分离，⽴即取出纸⽚。蛋⽩胨极易吸潮，故称量时要迅速。2. 溶化在烧杯中加⼊少于所需要的⽔量，置放在电热套上，⼩⽕加热，并⽤玻棒搅拌，

待药品完全溶解后再补充⽔分⾄所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放⼊⼰溶

图10 简易分装器 图11 倒平板⽅法 解的药品中，加热融化，最后补⾜所失的⽔分。3. 调pH 检测培养基的pH ，若pH 偏酸，可滴加lmol/L NaOH ，边加边搅拌，并随时⽤pH 试纸检测，直⾄达到所需pH 范围。若偏碱，则⽤lmol/L HCl 进⾏调节。pH 的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH 值不要调过头，以免回调⽽影响培养基内各离⼦的浓度。4. 过滤 液体培养基可⽤滤纸过滤，固体培养基可⽤4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供⼀般使⽤的培养