2018年9月核酸与ELISA检测联合应用于血液筛查的效果
聂蒲芳（汉中市中心血站，陕西汉中，723000）摘要：目的分析核酸与ELISA方法联合检测汉中地区无偿献血者的血液标本的结果，评估核酸检测技术（NAT）应用于献血者血液筛查中的必要性和重要性。方法使用ELISA检测对2015年8月1日至2017年7月31日汉中地区无偿献血者的80869份标本进行检测，检测出的阴性标本用全自动核酸检测系统进行核酸检测。结果80869份血液标本中，1859份标本ELISA法检测结果为阳性，不合格率为2.30%；79010份标本ELISA法检测结果为阴性，对其进行核酸检测，有反应性的标本103份，其中，HBV-DNA阳性标本100份，阳性率为0.13%；检出HCV-RNA阳性标本3份，阳性率为0.004%；未检出HIV-RNA阳性标本。结论NAT能在ELISA检测阴性的献血者标本中筛查到有反应性的标本，有效缩短血液病毒的“窗口期”，进一步提高血液安全性。关键词：ELISA检测；核酸检测技术（NAT）；血液筛查；血液安全中图分类号：R446.61文献标志码：A文章编号：2096-1413(2018)25-0103-03CombinationapplicationeffectofnucleicacidandELISAtestforbloodscreeningNIEPu-fang(CentralBloodBankofHanzhong,Hanzhong723000,China)ABSTRACT:ObjectiveToanalyzedthenucleicacidcombinedwithELISAmethodtodetectthebloodsamplesofunpaidblooddonorsinHanzhongarea,andtoevaluatethenecessityandimportanceofnucleicacidtest(NAT)forbloodscreeningofblooddonors.MethodsAtotalof80869samplesofunpaidblooddonorsinHanzhongareafromAugust1,2015toJuly31,2017weredetectedbyELISA,andthenegativesamplesweregivenNATusingafullyautomaticnucleicaciddetectionsystem.ResultsOfthe80869bloodsamples,1859sampleswerepositivedetectedbyELISA,andthefailureratewas2.30%;79010sampleswerenegativedetectedbyELISA.AfterNAT,therewere103reactivesamples,ofwhich,therewere100HBV-DNApositivesamples,thepositiveratewas0.13%;3HCV-RNApositivesamples,thepositiveratewas0.004%;noHIV-RNApositivespecimensweredetected.ConclusionNATcoulddetectreactivesamplesfromELISAnegativedonors,itcanefficientlyreducethewindowphaseofbloodviruses,improvethesafetyofblood.KEYWORDS:ELISAtest;nucleicacidtest(NAT);bloodscreening;bloodsafety
一 ｌ 血液质量
Ｂｌｏｏｄ ０ｕａｌｉ
《中国卫生质量管理》第１９卷第４期（总第１０７￣）２０１２年【Ｊ７月
核酸扩增检测技术在血液筛查中的应用
孙振秀 许 雷 杨忠思 刘晓华
【摘要】从建立ＰＣＲ标准化实验室，制定标准操作规程；强化人员培训；正确选择设备设施，做好校准、维护与保 养；选择合格的实验耗材；制定严格的防污措施，做好环境质控；做好检测环节质控；确保记录完整等方面，总结了核酸扩
增检测技术在血液筛查中的应用实践。
【关键词】 核酸扩增检测技术；聚合酶链式反应（ＰＣＲ）；实验室
Ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ／ＳＵＮ Ｚｈｅｎｘｉｕ，ＸＵ Ｌｅｉ，ＹＡＮＧ
Ｚｈｏｎｇｓｉ，ｅｔ ａ１．／／Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，２０１２，１９（４）：７８—８Ｏ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｐａｐｅｒ ｓｕｍｍｅｄ ｕｐ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ＮＡＴ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ａｓｐｅｃｔｓ：ｔｈｅ ｅｓｔａｂ—
ｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ；ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ ｔｒａｉｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｃｏｒ—
ｒｅｃｔ ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ，ａｎｄ ｔｏ ｍａｋｅ ｉｔｓ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ；ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｕｐｐｌｉｅｓ；
ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｉｃｔ ａｎｔｉ—ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｓ，ｇｏｏｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ；ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ ｔｅｓｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ：ｅｎｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎ—
・ ７３２ ・ 国际检验医学杂志２０１３年３月第３４卷第６期Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｍａｒｃｈ ２０１３，＂７ｏ１．３４，Ｎｏ．６
（１ ６／１３５）、泌尿外科占１．９６ （３／１ ３５）、内分泌科占５．８８ ｏＡ（８／
１３５）、骨科占３．９２ （５／１３５）、其他占５．８８ （８／１３５）。
２．３ ５１株鲍曼不动杆菌对１７种抗菌药物的耐药率 见表１。
３讨 论
细菌对抗菌药物的耐药性尤其是多重药物耐药性严重地
困扰着抗感染治疗，已日益成为全球关注的重要公共卫生问题 之一［２】。鲍曼不动杆菌主要引起呼吸道感染，也可引起菌血
症，泌尿系感染，继发性脑膜炎，手术部位感染，呼吸及相关性
肺炎，静脉导管相关感染，感染率近年来不断升高，已成为医院
感染最常见的病原菌之 ，其多耐药性及引起的感染人群给临 床治疗带来极大困难 ］。有相关报道鲍曼不动杆菌检出频率
与患者疾病严重程度有关【 。本组资料显示，分离的鲍曼不
动杆菌在各类临床标本中的分布以痰液为主，说明鲍曼不动杆
菌引起的感染以呼吸道易患性最强，下呼吸道感染是医院感染
的主要途径和临床类型。在科室分布主要来自ＩＣＵ，其次神经
外科及呼吸内科，其主要原因是这些科室的患者大都存在相关
基础性疾病．或长期卧床及应用大量广谱抗菌药物。免疫抑制
剂，侵人性诊疗操作（气管插管、气管切开、呼吸机应用、长时间 留置静脉导管、导尿管等）应用等因素有关 ｌ，从表１可以看
出，鲍曼 动杆菌对１７种抗菌药物均产生了不同程度的耐药
性，对头孢噻肟，氨曲南，哌拉西林，哌拉西林／他唑巴坦，左氧
氟沙星，庆大霉素，替卡西林／克拉维酸，复方磺胺甲恶唑的耐
药率均大于４０ ，对头孢哌酮／舒巴坦，米诺环素，美罗培南，
亚胺培南，多黏菌素Ｂ的耐药性相对较低，高耐药率的产生可
能和这些药物的大量使用有关，应引起高度重视。此外多黏菌
素Ｂ在国内近期的报道显示是治疗泛耐药不动杆菌的重症肺
・ ８１８・ 旦堕 堕匡堂窒查 １ｏ年８月第３１卷第８期Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ａｕｇｕｓｔ ２０１０，Ｖｏ１．３１，Ｎｏ．８
核酸扩增检测技术在血液筛查中的应用 张健△，谢秀华，黄呈辉，黎淦平，黄建国 （广东省深圳市宝安区中心血站 ５１８１０１） ・临床研究・
【摘要】 目的探讨核酸扩增检测技术在血液筛查中的应用价值。方法用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）常规筛查血液，对 免疫指标合格的血液采用美国Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ Ａｍｐｌｉｃｏｒ全自动ＰＣＲ诊断系统检测ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＣＶ ＲＮＡ和ＨＩＶ一１ ＲＮＡ，样本混 合采用４８人份×５Ｏ Ｌ汇集，采用汇集池阳性的再分拆检测。结果 ７０ ９５３份无偿献血标本中，ＨＢＶ ＤＮＡ阳性１ｏ份 （１．４／１０ ｏｏｏ），未发现ＨＣＶ ＲＮＡ和ＨＩＶ １ ＲＮＡ阳性样本。结论血站系统采用微量标本混合方式使用核酸扩增检测技术筛 查血液是可行的，能有效提高临床用血的安全。 【关键词】肝炎病毒，乙型； 肝炎病毒； ＨＩＶ； 供血者； 核酸扩增技术 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１ ６７３—４１３０．２０１０．０８．０２１ ’ 中图分类号：Ｒ４５７．１；Ｒ４４６．６１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３ ４１３０（２０１０）０８—０８１８一Ｏ２ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｂｌｏｏｄ ｄｏｎａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｂａｎｋ ＺＨＡＮＧ Ｊ ｔａｎ，ＸＩＥ Ｘｉｕ ｈｕａ，ＨＵＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ ｈｕｉ，ｅｔ ａ１． （ＢｄＯ ａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ ０ｆ Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｃｈｉｎａ ５１８１Ｏ１，Ｃ ｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ（ＮＡＴ）ｆｏｒ ｂｌｏｏｄ ｄｏｎａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｂｌａｎｋ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｐｌａｓｍａ ｓａｍｐｌｅｓ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｌ｝ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｏｒ ＨＢｓＡｇ．Ａｎｔｉ—ＨＣＶ。Ａｎｔｉ ＨＩＶ ａｎｄ ＡＬＴ ｗｅｒｅ ｐｏｏｌｅｄ ａｃｃｏｒｄ ｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ４８×５０ ｕＩ ．ＨＢＶ ＤＮＡ，ＨＣＶ ＲＮＡ ａｎｄ ＨＩＶ １ ＲＮＡ ｉｎ ｐｏｏｌｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ＡｍｐｌｉＳ— ｃｒｅｅｎ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｏｏｌｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｔｅｓｔｅｄ ａｇａｉｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ １０ ｏｆ ７０ ９５３ ｄｏｎａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＨＢＶ ＤＮＡ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｖ ＮＡＴ，ｂｕｔ ａｌｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ＨＣＶ ＲＮＡ ｏｒ ＨＩＶ １ ＲＮＡ ｗｅｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｉｔ ｉＳ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｔｏ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅ ＮＡＴ ｉｎｔｏ ｂｌｏｏｄ—ｄｏｎａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ＨＢＡ ＤＮＡ，ＨＣＶ ＲＮＡ ａｎｄ ＨＩＶ一１ ＲＮＡ，ＮＡＴ ｗｉｌｌ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｓｕｐｐｌｙ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ；ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ； Ｈ１Ｖ； ｂｌｏｏｄ ｄｏｎｏｒｓ； ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 输血相关传染病的预防和控制是全社会关注的焦点之一， 对献血者严格筛选是提高血液安全的重要措施之一。核酸扩 增检测技术（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ＮＡＴ）是近年来开 展的一项新技术，欧美、日本等发达国家的输血机构已普遍应 用于血液筛查，能弥补酶联免疫吸附试验（ｅｎｚｙｍｅｑｉｎｋｅｄ ｉｍ ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＩ ＩＳＡ）的不足，检测处于病毒“窗口期”的 献血者。本站２０００年开始核酸检测的研究探索 ］，２００４年 开始全面应用于血液筛查，笔者就核酸扩增技术在血液筛查巾 的应用价值进行探讨。 材料与方法 １．检测标本 本站２００４年１月至２００７年１２月无偿献 血标本９０ ６７９份。献血者样本留取２份，１份采用肝素抗凝， 用于血液ＥＩ ＩＳＡ常规检测；１份采用广州阳普公司生产的无 菌ＥＤＴＡ抗凝带分离胶的样管留取，用于ＮＡＴ检测，留取标 本５ ｍＩ ，于８ ｈ内送回血站并离心隔离出血浆，并置于２～ ８。Ｃ冰箱保存。 ２．血液的常规检测 初检采用国产ＥＩ ＩＳＡ试剂盒检 测乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、抗一ＨＣＶ、抗一ＨＩＶ和抗一ＴＰ，ＡＬＴ 采用速率法检测。复检采用进口试剂盒：ＨＢｓＡｇ（Ｏｒｔｈｏ或 Ｍｕｒｅｘ公司）、抗一ＨＣＶ（Ｏｒｔｈｏ公司）、抗一ＨＩＶ（Ｏｒｇａｎｏｎ或Ｂｉｏ— Ｒａｄ公司）和抗一ＴＰ（ＴＰＰＡ，日本富士公司）。 ３．标本汇集 挑选ＡＩ Ｔ、ＨＢｓＡｇ、抗一ＨＣＶ、抗一Ｈ１Ｖ和 抗ＴＰ等免疫指标全部合格的样本，本研究的样本共７０ ９５３ 份。按照４８份为一组，每份样本留取５Ｏ Ｌ，汇集于３．０ ｍＩ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中。全部为技术员手工操作。 △ 通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：Ｏ７５５ｚｈａｎｇｊｉａｎ＠１６３．ＣＯＦＩ１。 ４．核酸提取 采用美国Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃｓ Ｔｅｃｈ公司的Ａｃｕｐｕｒｅ ＤＮＡ／ＲＮＡ提取试剂盒。汇集样本以离心半径８ ＣＮ，２３ ０００ ２４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心，沉淀（６０±４）ｒａｉｎ，留取底层血浆１００“Ｌ，加 ６００／１Ｉ 裂解液，混匀后室温孵育１Ｏ～１５ ｍｉｎ，加入７００ Ｉ 的异 丙醇，离心沉淀，沉淀颗粒用１ ｍＩ ７０ 的乙醇漂洗。 ５．ＮＡＴ检测 采用美国Ｒｏｃｈｅ公司生产的ＰＣＲ试剂 盒，检测ＨＢＶ ＤＮＡ、ＨＣＶ ＲＮＡ和ＨＩＶ一１ ＲＮＡ，具体操作按 照试剂说明书进行。样本检测为阳性时，再按照２４ｘ ２、１２× ２、６×２依次检测，最后对６个单份样本检测。 ６．检测设备 瑞士哈美顿ＡＴ Ｐｌｕｓ２全自动加样仪、瑞 士哈美顿ＦＡＭＥ２４／２Ｏ全自动酶免分析仪、美国ＲＡ１０００生化 分析仪、日本Ｏｌｙｍｐｕｓ ＰＫ７２００全自动血液分析系统、美国 Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ Ａｍｐｌｉｃｏｒ全自动ＰＣＲ诊断系统。 结 果 ７０ ９５３份ＡＬＴ、ＨＢｓＡｇ、抗一ＨＣＶ、抗一ＨＩＶ和抗一ＴＰ免疫 指标阴性样本的ＮＡＴ检测结果，见表１。
