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侵袭性真菌病临床实验室诊断操作侵袭性真菌病是一种由致病性真菌引起的严重感染性疾病，在临床上常常表现为快速进展的、具有高度侵袭性的感染。
诊断这种疾病对于及时采取恰当的治疗非常关键。
实验室诊断操作在确定侵袭性真菌病的病原体和提供治疗指导方面起着重要作用。
本文将介绍侵袭性真菌病临床实验室诊断的一般操作流程。
1. 样本采集与处理：1.1 采集样本：侵袭性真菌病的常见感染部位包括血液、呼吸道、皮肤和组织等。
根据患者症状和病灶位置，选择适当的样本进行采集。
例如，可以采集血液、呼吸道分泌物、皮肤刮擦物或活体组织标本。
1.2 样本处理：对于血液样本，应使用无菌技术将其接种于培养基上进行培养。
对于其他类型的样本，可以先进行显微镜检查，然后选择适当的培养方法。
2. 微生物学检测：2.1 直接检测：可以使用显微镜检查样本制片，进行真菌形态学观察。
采用染色方法如格罗科托菲洛玛抗体染色或维尔森染色，可以更好地观察到真菌的特征结构。
2.2 培养方法：将样本接种于适宜的真菌培养基，如Sabouraud葡萄糖琼脂培养基。
通过观察培养基上的菌落特征，如颜色、形态、菌落特点等，判断是否有真菌的生长。
2.3 生物化学鉴定：对于培养出的真菌菌株，可以使用生物化学鉴定方法，如API脂多糖、API快速20C系统等，对菌株的生化特征进行鉴定，以确定病原物种。
3. 分子生物学检测：3.1 核酸提取：根据样本类型，选择适当的核酸提取方法。
例如，对于血液样本，可采用商用核酸提取试剂盒，按照说明书进行提取。
3.2 PCR扩增：设计合适的引物和探针，选择特异性基因进行PCR扩增反应。
常用的基因包括ITS rDNA、18S rDNA和内转录间隔区等。
3.3 扩增产物检测：利用凝胶电泳或实时荧光定量PCR等技术，检测扩增产物，并根据产物大小和序列确定菌株的分类。
4. 药敏试验：4.1 药敏试验建立：对分离得到的致病真菌菌株，可以进行药敏试验以确定抗真菌药物的敏感性。
专家述评侵袭性肺部真菌感染的实验室检测方法郭鹏豪，廖康，伍众文，何宇婷，陈怡丽，刘敏基金项目：中山大学校级本科教学质量工程类建设项目(编号：80000-18832601)作者单位：510080广州，中山大学附属第一医院医学检验科作者简介：郭鹏豪(1984-),男，医学硕士，副主任技师，研究方向:真菌的流行病学及耐药机制。
**********************通讯作者；刘敏(1964-),女，大学本科，医学学士，主任技师，研究方向:感染及肿瘤标志物研究。
E-mail：137****************刘敏，中山大学附属第一医院医学检验科主任，中山大学医学检验学系主任。
本科毕业于中山大学中山医学院医学系临床医学专业,研究方向为感染及肿瘤标志物研究。
担任广东省医师协会检验医师分会、医院协会临床实验室管理专委会、精准医学应用学会精准检测分会、生物工程学会临床实验室分会、预防医学微生物及免疫分会、医疗行业协会检验分会、健康管理学会检验分会副主任委员；中国女医师协会检验分会常委;广东省女医师协会检验分会主任委员；中国医师协会检验医师分会委员。
主要从事临床医学检验、教学和科研及临床实验室管理等方面的工作，尤其是在感染、肿瘤标志物、自身免疫及产前筛查等方面有丰富的经验。
承担或参与国家自然科学基金项目、863子课题项目、广东省科技厅项目及广州市协同创新重大专项基金项目等多项课题，发表SCI收录及中文核心期刊等论文数十篇。
其中2020年在BMJ以第一作者发表Use of p ersonal protective equipment against coronavirus disease2019by healthcare professionals in在《中华检验医学杂志》上以通讯作者发表文章《不同方式灭活口咽拭子标本对2019新型冠状病毒实时荧光定量PCR检测结杲的影响》，参与的项目“新型冠状病毒肺炎综合防控诊治体系"获广东省科技进步一等奖。
2022侵袭性真菌病实验室诊断方法临床应用专家共识（完整版）摘要侵袭性真菌病的诊断引起临床多学科关注，早期确切诊断是改善患者预后的关键。
其方法主要包括真菌直接镜检、真菌培养和鉴定、真菌血清学检查、分子生物学检测和组织病理学检查。
为了促进临床医师深入了解并合理应用这些方法，提高侵袭性真菌病诊断水平，我们邀请多学科专家共同编写了此共识。
本共识对侵袭性真菌病诊断方法的应用人群、送检要求、结果解读及临床意义进行了介绍并提出建议，强调对于侵袭性真菌病高危患者，应综合应用多种诊断方法、正确取材送检、提高结果解读能力、了解不同方法的临床意义，以便合理应用，更好地服务于患者。
侵袭性真菌病的患病率及病死率呈持续上升趋势，严重威胁患者健康。
常见的病原真菌包括念珠菌、曲霉、隐球菌和毛霉等。
这些致病真菌引发的疾病临床特征迥异；新发致病菌及多药耐药菌种不断出现，增加了诊疗难度。
侵袭性真菌病起病隐匿且临床症状不典型，早期诊断困难。
国内外近期推出的针对侵袭性真菌病临床诊疗指南或共识指出，对侵袭性真菌病的诊断均需依靠适宜的微生物学、组织病理学及影像学方法［1, 2, 3, 4］。
2020年，欧洲癌症研究和治疗组织（EORTC）和真菌病研究组教育研究协会（MSGERC）发布侵袭性真菌病诊疗共识修订版，该版共识除上述常规方法外，更强调分子生物学诊断的价值［1］。
我国医院内进行真菌相关微生物检查的实验室主要为检验科微生物室。
近期对全国348家医院微生物室真菌检验能力的调查显示，我国常规真菌检验项目（真菌涂片染色、真菌培养）及部分血清学检查（真菌1，3-β-D葡聚糖检测）覆盖率在70%以上，但真菌其他检验方法以及整体诊断能力较为欠缺，与国外差距较大［5］。
在进一步加强微生物实验室能力建设基础上，也需要将有重要价值的诊断方法介绍给广大临床医师，帮助大家加深认识，合理应用，提高侵袭性真菌病的诊断水平。
为此，我们邀请来自感染、呼吸、血液、重症等领域专家与医学真菌和临床微生物专家们共同参与制定本共识。
2022侵袭性真菌病实验室诊断方法临床应用专家共识（完整版）摘要侵袭性真菌病的诊断引起临床多学科关注，早期确切诊断是改善患者预后的关键。
其方法主要包括真菌直接镜检、真菌培养和鉴定、真菌血清学检查、分子生物学检测和组织病理学检查。
为了促进临床医师深入了解并合理应用这些方法，提高侵袭性真菌病诊断水平，我们邀请多学科专家共同编写了此共识。
本共识对侵袭性真菌病诊断方法的应用人群、送检要求、结果解读及临床意义进行了介绍并提出建议，强调对于侵袭性真菌病高危患者，应综合应用多种诊断方法、正确取材送检、提高结果解读能力、了解不同方法的临床意义，以便合理应用，更好地服务于患者。
侵袭性真菌病的患病率及病死率呈持续上升趋势，严重威胁患者健康。
常见的病原真菌包括念珠菌、曲霉、隐球菌和毛霉等。
这些致病真菌引发的疾病临床特征迥异；新发致病菌及多药耐药菌种不断出现，增加了诊疗难度。
侵袭性真菌病起病隐匿且临床症状不典型，早期诊断困难。
国内外近期推出的针对侵袭性真菌病临床诊疗指南或共识指出，对侵袭性真菌病的诊断均需依靠适宜的微生物学、组织病理学及影像学方法［1, 2, 3, 4］。
2020年，欧洲癌症研究和治疗组织（EORTC）和真菌病研究组教育研究协会（MSGERC）发布侵袭性真菌病诊疗共识修订版，该版共识除上述常规方法外，更强调分子生物学诊断的价值［1］。
我国医院内进行真菌相关微生物检查的实验室主要为检验科微生物室。
近期对全国348家医院微生物室真菌检验能力的调查显示，我国常规真菌检验项目（真菌涂片染色、真菌培养）及部分血清学检查（真菌1，3-β-D葡聚糖检测）覆盖率在70%以上，但真菌其他检验方法以及整体诊断能力较为欠缺，与国外差距较大［5］。
在进一步加强微生物实验室能力建设基础上，也需要将有重要价值的诊断方法介绍给广大临床医师，帮助大家加深认识，合理应用，提高侵袭性真菌病的诊断水平。
为此，我们邀请来自感染、呼吸、血液、重症等领域专家与医学真菌和临床微生物专家们共同参与制定本共识。
旨在明确目前国内侵袭性真菌病诊断方法的应用价值，促进临床医师对这些方法的合理应用，加强实验室与临床之间的联系，提高我国侵袭性真菌病的诊疗水平。
经讨论，对侵袭性真菌病诊断方法：微生物学检查（真菌直接镜检、真菌培养和鉴定、真菌血清学检查、分子生物学方法）和组织病理学检查的临床应用达成以下共识（表1）。
一、微生物学检查的临床应用（一）真菌直接镜检真菌直接镜检操作简便、适用多种临床样本［支气管肺泡灌洗液（BALF）、痰液、尿、粪、分泌物、脑脊液、引流液等］、可快速报告结果，有重要临床价值，但存在假阴性、敏感性不高等问题。
●怀疑真菌感染患者BALF及无菌体液（除血液外）标本，应做真菌直接镜检，同时做真菌培养及血清学检查。
●非无菌部位标本（痰、尿、粪等），如果做真菌培养，需要在培养同时做真菌直接镜检。
●真菌直接镜检敏感性不高，多次送检能提高检出率。
●活检组织标本在进行组织病理和真菌培养检查的同时，应做直接压片，荧光染色后进行真菌直接显微镜检查。
荧光染色可显著提高真菌镜检的敏感性［6］，临床应用价值更大，但需要注意：在皮肤、呼吸道等非无菌部位，荧光染色检查发现个别孢子有可能是定植真菌，非致病真菌，需要结合临床综合判断。
呼吸道标本的直接涂片镜检也可以采用革兰染色。
怀疑肺孢子菌肺炎的患者，对诱导痰或BALF 涂片后进行六胺银染色（GMS）。
怀疑隐球菌性脑膜炎患者，脑脊液直接真菌镜检一般采用墨汁染色。
真菌直接镜检报告阴性，由于敏感性问题，不能完全排除真菌感染。
报告阳性时，如果是无菌部位标本，可以确诊存在真菌感染，但确认致病真菌种类还需要真菌培养结果；如果是非无菌部位，则需要结合患者免疫状态、临床表现、真菌培养结果及真菌血清学检查综合判断；BALF来源于肺部，非完全无菌部位，但免疫抑制人群（尤其是血液病、骨髓移植、化疗患者）出现阳性结果，且根据镜检时真菌形态提示为曲霉时，对诊断肺曲霉病有重要意义；对于痰、尿、粪等非无菌标本，真菌直接镜检阳性，根据形态提示念珠菌时，要考虑局部真菌定植问题。
鼻窦组织标本由于培养阳性率较低，更建议做真菌直接镜检。
少量肺部穿刺组织直接压片，进行荧光染色后镜检，可快速发现肺部曲霉或毛霉等丝状真菌感染，有确诊意义，适用于高度怀疑肺部真菌感染患者。
真菌直接镜检中真菌形态的描述对某些菌种有提示意义，但不能替代真菌培养。
（二）真菌培养及鉴定真菌培养是真菌感染的重要诊断方法，对于诊断感染以及确认致病真菌种类有重要价值［7］。
培养出的真菌还可以进行体外药敏检测，指导临床药物选择。
真菌培养存在耗时较长、阳性率低以及难以区分定植与感染的问题。
因此建议：●在送检真菌培养检查同时，应尽可能同时送检真菌直接镜检。
●组织标本进行组织病理检查时，同时应进行真菌培养检查。
●真菌培养所需时间长于细菌培养，一般需要7 d，特殊情况需要2~4周以上，如果怀疑双相真菌感染（马尔尼菲篮状菌、组织胞浆菌等），应同时在28 ℃和37 ℃两个温度下培养。
●非无菌部位真菌培养阳性，存在污染菌或定植菌可能，所以需要对培养出的真菌进行判断，是否有临床意义（即致病真菌），需要结合真菌直接镜检、组织病理检查、患者临床表现以及真菌致病性等进行综合判断。
●真菌鉴定一般需要鉴定至种或复合群（complex）水平。
根据菌种类型，参考相应真菌感染诊疗指南选择抗真菌药物治疗。
少见真菌或从疑难重症患者分离到的致病真菌应做体外药敏实验，作为临床用药参考。
真菌培养与细菌培养不同，需要适宜真菌生长的温度、培养基和时间，所以如果怀疑真菌感染的患者送检标本（尤其是组织标本）时应做标注，提示实验室用于真菌培养。
真菌培养的标本取材方法与细菌培养类似，原则上越多越好。
培养物取材后应及时送检（一般2 h内），组织、无菌体液或骨髓等标本采集后立刻送检（最好15 min内），组织标本要注意禁止福尔马林固定。
真菌生长慢于细菌，念珠菌、曲霉、马尔尼菲篮状菌一般需要7 d，组织胞浆菌需要时间较长，一般要3~6周，其他致病真菌培养时间介于1~3周之间，肺孢子菌难以体外培养。
真菌培养敏感度不高，阴性结果不能完全排除真菌感染。
特别应注意在使用抗真菌药物之前送检标本。
出现阳性结果时，要关注真菌种类，结合临床判断是否有临床意义。
判断时应考虑真菌直接镜检或组织病理提示，是否与真菌培养结果相符；临床上，培养真菌是否可以导致相应临床表现；是否存在定植菌或污染可能。
难以判断时，可多次重复送检。
真菌血培养阳性时要判断是致病菌还是污染菌。
血培养可以培养出酵母菌、双相真菌。
如果血培养培养出丝状真菌，则需要进一步判断，如果是曲霉或毛霉，污染菌的可能性很大。
如果是镰刀菌或赛多孢霉，致病菌的可能性很大。
真菌培养后鉴定一般鉴定至种或复合群水平，常规微生物实验室均可完成。
真菌复合群中包含若干个种。
例如曲霉是属水平，烟曲霉是复合群水平，烟曲霉复合群中还包括若干个种。
如果存在复合群，进一步鉴定至种水平时需要DNA测序，仅限特殊情况时应用［8］。
某些真菌存在天然耐药，一般根据菌种鉴定结果，参考各种真菌感染诊治指南或共识，选择恰当的抗真菌药物治疗。
念珠菌获得性耐药有增多趋势，推荐对确认致病的念珠菌进行体外抗真菌药敏实验［9］，定植念珠菌可不做体外药敏检测。
曲霉等丝状真菌一般不常规进行体外药敏检测。
若患者有唑类药物暴露史或治疗失败者，可对分离到的曲霉进行体外药敏检测［10］。
真菌体外药敏实验结果，不同方法有相应判定折点，可根据折点判定敏感或耐药。
相对少见的致病真菌目前无临床折点，可根据最小抑菌浓度（MIC值）选择药物。
值得注意的是，抗真菌药物体内疗效与体外药物敏感性并不完全一致，体外药敏结果可作为临床用药参考。
（三）血清学检查血清学抗原检查适用于侵袭性真菌病的早期诊断，耗时短，结果报告迅速，是传统真菌学检查有益的补充。
不同血清学检查方法的临床意义及适用真菌感染种类不同，在不同高危人群中应用价值也有差异。
血清学抗体检查适用于无明显免疫抑制人群，主要包括曲霉IgG抗体和IgE抗体。
●样本类型多为血清，部分检查可用于脑脊液、BALF或其他体液。
●常用方法为：隐球菌抗原检测、曲霉半乳甘露聚糖抗原检测（GM实验）和真菌1，3-β-D葡聚糖检测（G实验）。
●隐球菌抗原检测用于诊断隐球菌病，脑脊液或血清抗原阳性是隐球菌病的确诊证据。
●GM实验适用于怀疑侵袭性曲霉感染的患者，检查血清或BALF。
阳性结果是侵袭性曲霉病临床诊断证据之一。
还需要结合临床表现、其他真菌学检查以及影像学表现综合判断。
●G实验可用于怀疑侵袭性真菌病（包括念珠菌病、曲霉病、肺孢子菌病等，不包括隐球菌病、毛霉病）的患者。
阴性结果排除真菌感染的意义更大。
●抗体检测适用于无明显免疫抑制人群。
慢性空洞性肺曲霉病可检测曲霉IgG抗体，变应性支气管肺曲霉病患者可检测曲霉特异性IgE抗体。
隐球菌抗原检测通过检测隐球菌中的荚膜多糖类抗原来诊断隐球菌感染。
目前荚膜多糖抗原检测主要用于脑脊液和血清样本。
采用方法为乳胶凝集实验或胶体金免疫沉淀实验，快速简便，具有较高的灵敏度及特异性。
在2008年EORTC和MSGERC共同发布的诊断标准中，脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原阳性可以作为隐球菌性脑膜炎确诊证据［11］。
在肺隐球菌病中，血清荚膜多糖抗原阳性同样具备很高的敏感性和特异性，在2020年EORTC/MSGERC诊断标准更新中，血液隐球菌抗原阳性也成为确诊证据之一［1］。
隐球菌抗原阳性，无论滴度大小，均作为阳性诊断指标，但滴度变化及转阴不能作为疗效监测和判断停药指标，是否停药以微生物学检查和临床改善情况为准。
隐球菌抗原检测出现假阴性与抗原浓度过低有关。
另外，抗原浓度过高时也可出现弱阳性或假阴性（前带效应），可以通过稀释后检测以避免。
隐球菌抗原检测特异性好，和多种真菌均无交叉反应，但有文献报告毛孢子菌可能会引起假阳性［12］。
半乳甘露聚糖是存在于曲霉细胞壁上的特异性多糖抗原。
GM实验用于侵袭性曲霉病的早期诊断，具有较高的特异性［13］。
GM实验在血液恶性疾病、化疗以及接受造血干细胞移植患者合并曲霉感染中的诊断价值更大。
该检测适用于血浆、血清、BALF［14］或脑脊液样本。
不同试剂的阳性判定界值及适用标本有差异，一般为0.5，以试剂说明书为准。
在临床应用中，还需要关注GM数值，EORTC/MSG2020年诊断指南中建议单次血清或血浆GM值≥1.0；或BALF的GM值≥1.0；或单次血清或血浆GM 值≥0.7并且BALF的GM值≥0.8；脑脊液GM值≥1.0可作为侵袭性曲霉病的阳性诊断标准。
连续2次以上动态监测出现GM阳性的诊断提示意义更大［1］。
GM实验已经作为重要的微生物学证据列入EORTC/MSG 2020年更新的侵袭性曲霉病诊断标准中［1］，可用于诊断侵袭性曲霉病。
