【CN109847406A】一种用于纯化血红蛋白的阴离子交换层析柱的清洗方法【专利】

阴离子交换层析的名词解释阴离子交换层析（Anion Exchange Chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子的技术方法。

在生物医学研究和制药工业中广泛应用。

本文将对阴离子交换层析进行详细的名词解释，探讨其原理、应用和优点。

一、阴离子交换层析的原理阴离子交换层析是一种离子交换色谱的分支技术，利用官能团负电荷吸附和解吸样品中的阴离子。

通常使用酸性树脂作为固定相，通过其酸性官能团与阴离子之间的静电作用进行分离。

在阴离子交换层析过程中，样品先与预处理液相接触，使其电荷状态发生改变。

然后样品进入带有阴离子交换树脂的柱子中，样品中的阴离子与固定相上的酸性官能团发生静电相互作用，阴离子被吸附在固定相上，其他物质则以不同速率通过柱子。

最后，通过改变移动相的pH值或离子浓度等条件，使阴离子从固定相上解吸，并以纯形式收集。

二、阴离子交换层析的应用阴离子交换层析在生物医学研究和制药工业中有广泛的应用。

以下是该技术的几个常见应用领域：1. 蛋白质纯化：阴离子交换层析可以分离和纯化复杂的蛋白质混合物。

通过调节移动相中的离子浓度和pH值，可以将蛋白质依据其等电点的不同特性进行分离。

2. DNA和RNA纯化：DNA和RNA是生物学研究中重要的分子，阴离子交换层析可以用于纯化和富集DNA和RNA，去除杂质和有害物质。

3. 离子和小分子分析：阴离子交换层析也常用于分析离子和小分子，如药物和有机化合物。

通过调节移动相的离子浓度和pH值，可以分离不同化学性质的离子和小分子。

4. 生物药物制备：阴离子交换层析在制药过程中起到关键作用。

通过分离和纯化生物药物，去除杂质和副产物，保证药物的纯度和质量。

三、阴离子交换层析的优点阴离子交换层析作为分离和纯化生物大分子的常用技术，具有以下优点：1. 高选择性：阴离子交换层析对不同阴离子有较高的选择性。

可以根据离子的大小、电荷和水溶性等特性进行选择，并实现高效的分离。

2. 高分辨率：由于阴离子交换层析对样品中的不同阴离子具有不同的吸附和解吸速率，可以实现对不同物质的高分辨分离。

离子交换柱层析操作离子交换柱层析在生物分离和纯化中广泛应用，包括蛋白质分离和纯化。

蛋白质通常具有带电的氨基酸残基，可以与柱子上的离子交换基团发生静电相互作用。

在离子交换柱层析中，通过调节溶液的pH值和离子浓度，可以控制蛋白质与柱子上的离子交换基团之间的相互作用，从而实现蛋白质的选择性吸附和洗脱。

1.离子交换柱的选择：根据所要分离的目标分子的特性选择合适的离子交换柱。

离子交换柱可以根据其固定相的性质分为阴离子交换柱和阳离子交换柱，根据离子交换基团的类型分为疏水基团和孔隙基团等。

2.样品预处理：将待分离的样品进行预处理，包括清除杂质、富集目标分子等步骤，以获得较高的纯度和回收率。

3.样品加载：将预处理过的样品溶液加载到离子交换柱上。

样品溶液中的目标分子与离子交换基团之间发生静电相互作用，被柱子上的固定相吸附。

4.柱洗脱：通过调节洗脱缓冲液的pH值、离子浓度或盐浓度等条件，改变目标分子与离子交换基团之间的相互作用，使其从柱子上洗脱下来。

5.纯化目标分子：将洗脱得到的目标分子进一步纯化和收集，可以通过再次进行柱层析、凝胶过滤、电泳等方法进行。

离子交换柱层析操作对于蛋白质的纯化十分重要。

在蛋白质纯化中，可以根据蛋白质的等电点和溶液的pH值选择合适的离子交换柱，实现对特定蛋白质的选择性吸附和洗脱。

通过优化离子交换柱层析操作的条件，可以获得较高纯度和产量的蛋白质。

总结起来，离子交换柱层析操作是一种常用的用于生物分离和纯化的方法。

它利用样品中带电的离子与柱子上的离子交换基团之间的相互作用，实现对生物分子的选择性吸附和洗脱。

离子交换柱层析对于蛋白质的纯化具有重要意义，可以通过调节柱层析条件实现对特定蛋白质的纯化和富集。

离子交换柱层析操作是一种非常有用和广泛应用的生物分离技术。

色谱柱冲洗方法（最新版4篇）篇1 目录1.色谱柱冲洗的必要性2.色谱柱冲洗的方法2.1 水冲洗法2.2 有机溶剂冲洗法2.3 缓冲盐冲洗法2.4 反冲法3.色谱柱冲洗的注意事项篇1正文色谱柱是液相色谱系统中的核心部件，它在样品分离过程中起着至关重要的作用。

然而，在色谱柱使用过程中，柱内可能会积累一些脏物或盐析物，影响色谱柱的分离效果。

因此，对色谱柱进行定期冲洗是非常必要的。

下面我们将介绍几种常见的色谱柱冲洗方法。

首先，水冲洗法是最常用的色谱柱冲洗方法。

此方法操作简便，只需将色谱柱连接到水流系统上，使用纯水进行冲洗。

篇2 目录一、色谱柱冲洗的必要性二、色谱柱冲洗的方法1.水冲洗法2.纯有机相冲洗法3.缓冲盐冲洗法4.反冲法5.专用清洗剂冲洗法三、不同类型色谱柱的冲洗方法1.反相色谱柱2.正相色谱柱3.离子交换色谱柱4.凝胶渗透色谱柱四、色谱柱冲洗的注意事项篇2正文色谱柱是高效液相色谱系统中的核心部件，其在样品分离过程中起到关键作用。

然而，在长时间的使用过程中，色谱柱内部可能会积累一些脏物，影响色谱柱的分离效果。

因此，对色谱柱进行定期冲洗是非常必要的。

色谱柱冲洗的方法有很多种，下面我们分别进行介绍：1.水冲洗法：这是一种最常用的色谱柱冲洗方法。

使用纯水或含有少量缓冲盐的水进行冲洗，可以有效去除色谱柱内部的脏物。

对于反相色谱柱，可以使用纯水或甲醇/水混合溶液进行冲洗。

2.纯有机相冲洗法：在冲洗色谱柱时，可以使用纯有机溶剂（如乙腈、甲醇等）来代替水相。

这种方法适用于具有疏水性的色谱柱，如 C18、C8 等。

3.缓冲盐冲洗法：在冲洗过程中，可以加入一定浓度的缓冲盐，以保持色谱柱内部的离子强度。

这种方法适用于离子交换色谱柱和凝胶渗透色谱柱。

4.反冲法：这是一种比较彻底的冲洗方法，可以有效去除色谱柱内部的沉淀物。

在反冲过程中，需要将色谱柱的流动相改为反向，并提高流速。

然而，反冲过程可能会对色谱柱造成一定程度的损伤，因此需要谨慎操作。

艾杰尔快速处理柱安全操作及保养规程艾杰尔柱（AJL）是一种用于化学分离和纯化的高效柱，广泛应用于制药、生物技术、食品和环境等领域。

在使用过程中，正确的操作和定期的保养不仅能保证其分离效果和寿命，而且能确保实验室和操作人员的安全。

本文将介绍柱的快速处理流程、安全操作和保养规程。

艾杰尔柱的快速处理流程柱的快速处理指的是在实验前对使用过的柱进行处理，以清除表面污物和残留物质，并恢复柱的分离效果。

快速处理流程如下：1.流率：以洗脱缓冲液（mobile-phase buffer）为溶液，以10倍柱子体积的流率进行冲洗。

流率 = 10 x 柱子体积 / 时间2.洗脱缓冲液pH：根据具体情况调整洗脱缓冲液pH，保证溶液的pH在柱的工作范围内。

3.洗脱缓冲液浓度：推荐使用74%甲醇剩余为水的洗脱缓冲液。

可根据需求使用纯甲醇或纯水对洗脱缓冲液进行稀释。

4.流程：–预冲洗：使用10倍体积的洗脱缓冲液，以流率将柱管和柱芯冲洗至均一。

–快速冲洗：使用10倍体积的洗脱缓冲液，以流率将柱芯进行快速冲洗。

–等温平衡：维持柱芯的流量和温度至少20分钟，使其达到平衡。

–样品处理：将样品溶液均匀地注入柱芯，且不要让样品进入柱的端口或过滤器。

–洗脱过程：使用合适的洗脱缓冲液，以缓慢的流率将样品洗脱，直至柱的读数达到相应的数值。

–柱再生：使用10倍体积的洗脱缓冲液，以流率将柱芯进行再生或调整。

艾杰尔柱的安全操作使用艾杰尔柱要注意以下安全操作。

1.操作环境：–操作环境应干燥、无闪电和无静电干扰。

–柱头插管端应对着流出水槽，防止流出物质污染实验用品。

–操作环境应通风良好。

2.柱的压力：–避免高于柱头壳体标准压力范围的柱压，以防止柱损坏或泄漏。

–当柱的压力超过标准范围时，应立即停止使用，并寻求技术支持。

3.操作人员：–操作人员需要具备柱的基础知识技能。

–操作人员必须佩戴防护手套和防护眼镜。

–禁止直接接触柱的端口和端口过滤器。

–在柱处理和倒空时，需注意柱的重心和固定座托架的稳定性。

离子交换柱层析操作规程（可溶性蛋白）1.装柱：1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水；1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积；2.柱的平衡与上样：2.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6；2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；3洗杂蛋白：3.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.3用含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.4用含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.5用含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.6用含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）4解离目的蛋白：4.1用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.2 用含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.3 用含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.4用含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul 做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）5.柱的清洗与保存：5.1用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液（PH7.6）以冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.3用过滤去离子水冲洗50ml；5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。

离子交换柱层析操作规程（可溶性蛋白）1.装柱：1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水；1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积；2.柱的平衡与上样：2.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6；2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；3洗杂蛋白：3.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.3用含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.4用含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.5用含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.6用含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）4解离目的蛋白：4.1用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.2 用含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.3 用含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.4用含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul 做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）5.柱的清洗与保存：5.1用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液（PH7.6）以冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.3用过滤去离子水冲洗50ml；5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。

阴离子交换微型柱层析分离肌酸激酶同工酶第17卷第1期1996年1月一76瑚北医科太学ActAcademlaeMedicinaeHubei阴离子交换微型柱层析分离肌酸激酶同工酶,/&0?刘志超张剑平'米华凤Vj】7NO11i996摘要采用DEE.sephadexA50离子交换微型柱屡析分离肌醣擞酶(CK)同工酶.继以紫卅赞光光崖诘铡其性的结果表明:血清及组织提取液CK同工酶分离洗脱均租完坌电林证实,MM.MB,b1洗出液分别只古CK肌型同工酶(CK—MM),心肌型同工酶(CK—MB)盐脑型同工酶(CK'BB)奉法精密度高,线性关系好.过柱回收率高敏感性强.而且快速简便主窟词肌酤澈酶同工酶类/分离和提纯;色谱法,离子交换中霉分类号Q55}Q503肌酸澈酶(CK)同工酶有CKMM,CKMB,CKBB3种厩工酶的测定对诊断心血管疾病,神经肌肉疾病,泌尿系统疾病,肿瘤等有重要意义测定CK同工酶常用电泳,免疫抑制,放射免疫和离子交换柱层析等法其中离子交换柱层析法(简称拄折法)虽操作程序较多,但经济易行,而且酶活性损失少,灵敏度极高. 柱析法谢CK同工酶虽有过报道.但其所研究重点多放在CKMB检测上,对CKBB及其在检测中的一些问题则往往被忽略.我们参照文献"].设计车课题,以期弥补上述不足1材料方法1.1柱层析1.1.1原理血清或组织提取液通过DEAE—sephadexA50层折柱时,CK被离子交换树酯中阴离子吸附,告NaCI浓度不同的洗脱剂能将MM, MB,BB分步洗脱而将其分离.1.1.2分离CK同工酶试剂(洗脱液):(1)MM洗脱缓冲液:0.05mol/ITrisHCI缓冲液,pH7.0告NaC10.1nml/I.(2)MB洗脱缓冲液:0.05mol/1.Tr[sHC1缓冲液,pH7.0告NaC10.2moliI.(3)BB洗脱缓冲液;0.05mol/ITrisHC1缓冲液,pH7.0台NaC10.4mol/I1.1,3DEAEsephadexA;50处理及装填层折I柱.1.1.3.1层析柱为长12crll,内径05cn1.尾端疏橙地填以脱脂棉的玻璃柱.I.1.3.2准确称取2.5干DEAE—SephadexA50(Pharmac[a,粒度40～12O)提于MM洗脱缓冲液500ml中,混摇静置过夜.次日吸除上清液,再加^MM洗脱液500m1.馄摇,静置使DEAE—SephadexA一50沉下,吸去上清液.移DEAE—SephadexA.50混悬浆于抽气瓶中,技1:d(混悬浆:MM洗脱液)加入MM洗脱液,混摇后将抽气瓶加塞,抽气减压除去气泡将处理后的混悬浆用吸管滴入层析柱,不应有气泡或断层.自然沉积高度6cm,置4C冰箱中II保存1个月.1.1.4标本处理t1)血清:正常人肘静脉采血4n1.置干燥净洁试管中尽快离心分离血清.即对测定或于3OC冰箱中待测,CK活力可稳定至少半月(2)组织提取渍:取等量大鼠心肌骨骼肌,脑组织,在2h内分别用MM洗脱缓冲液冲洗3次后取lg组织加人MM洗脱液lOm1中,用匀浆器粉碎,1500r/m[n后于4C中离心30nfin.所有操作均在O～4℃下进行,上清液升装,于30C保存.用其它动物相应组织为标奉亦可.1.1.s柱层析步骤取DEAE—sephadexA一50微型层析柱用潭来贴,等.阴离子交换型拄层析分离肌酶澈酶同工酶'33' MM洗脱液冲洗2次,每次1mL,待流尽后将待测新鲜血清或组织提取液1n】l滴人层析柱,收集洗出液于标有MM"的刻度管中,再用MM洗脱液冼7次.每次1m1.洗出液收集于"MM"管内,共8n1l.再同样分别用MB,BB洗脱液洗脱MB,BB8次,每次1mL.洗出液分装于MB,BB管内,各得8ml.即测或置一30C冰箱中待删;勿反复冻融,阻免影响CK活性.层析流速控制在0.5～1mltmin1.2琼脂糖电泳1.2l电泳试剂【1)电泳缓冲液:Tris—Barbital缓冲液.将5Ommol/1Trls与50mrnol/Ibarbital按l0;l_5比例混台而成.(2)琼脂糖平板制作:取纯琼脂糖粉1g加人100mlTris一天冬氨酸缓冲液(Tris浓度11.1 mmoL/I,天门冬氨酸浓度8.89mmo|/I,庶糖】.{,pH7.O).沸水浴至不再有气施形成.每支8m1分装于12支净洁试管中,置4C冰箱中备用用时取1支于1o0C水浴溶化,液体铺于净洁,水平玻板(10crfl×12cn1)上凝固即可1.22电泳步骤按美国Beckman公司"MBCKisoenxyme eleclrophorcsisparamgon"使用说明书进行.用点样条于电泳板一端点样10个.每点10I:置板于电泳槽中,电压100V.30rain后覆浸透CK试剂的滤纸,37C温浴25rain{去掉纸片,以双蒸水小心冲洗板面,Iu～70L烘干,在波长360nm荧光分析仪下观察CK同工酶带1.3CK同工酶活性测定37C下参照Rosalki法n],按上二海长征医学科学有限公司CK—NACREAGENT使用说明书进行.用日产G80001型自动打印式紫外分光光度计测定.步骤:置K试剂及洗出液各加0.2mJ于容积0.6ml的石英比色杯中混匀,预温1rain印可按说明书操作2结果2.1拄层析分离CK周工酶教累每管1ml收集CK同工酶洗出液.各管酶活性分布见图1,2,3,4.总CK活力:骨骼肌168.9U¨|I.肌2a8o.3U/[,脑10288U/J.LLj一…藩号U门.50403020田2太■骨譬阻摄取萱晨斯田境出堆号●■■E__且S■—■■●■_-l&●■■■■●●■■__.巳3■鼍●■_-量2M■■■__■●h34?湖北医科大学Ul1.50(I4003002OO1O0U门SO403020l0MMM日髓圈3丈一脑担甥提取液层辑田圈4土面积脑梗塞毫者血清晨析田2.2特异性用电泳法鉴定.将心脑组织提取液等体积混合后取lml层折分离3种同工酶,洗出液分别装人I(MM:即古MM洗出液),2(MB),3 (BB)号透析袋浓缩后行电泳鉴定证实:l,2号液分别只古MM,MB,3号液除BB为主外尚古少量MB(在薄层扫描仪下可见).2.3精密度稀释脑提取液分成3种浓度,每浓度以l0支层折柱分离测定CK—BB活性(士j)分别为606.8±41.8U/L,282.1士27.6U/L,57士BBM日MMCX第"卷洗出畦号琬出麓号16.8U/L,其批内变异分别为6.8,9.8,¨.8.将3种浓度脑提取液每天每滩度层折分离CK—BB1次,连续l0d,各浓度CK—BB活性分别为l51.8±11.8U/I,33.4士3.9U/I,15.O±1.8U/t;挑同变异分别为7.8,l1.7%,l2.2.2.4线性等窖混台鼠心,脑提取液,等比稀释成5种总CK活力,分别层析测CK一阴,MB,MM活性.各同工酵线性关系良好.详见圈5.田55种KC活性晨析后备同工一曲鼓性荚摹寞好CK蘑畦(U/L)口—目HⅡ■誓量3_日__H嘲_,M.r.卜.卜.卜.L担来勋+等.明育子文换型拄层析分离肌鞋酶同工酶?35?2.5柱瑶析CK获得率试验以MM洗脱液稀释20份正常人血清后测其过柱前总CK(T—CK)活性.每份血清取1ml柱析分离测CK同工酶活性,相加后为过柱后T—CK活性.结果:过柱前T—CK45.2土21.66u/i;过拄后,CK—MM35.18±19.79U/I+MB6.30±4.05U/!,BB3.62±2.07U/I…TCK48.81±l9.83U/L.柱析获得率92.58.2.6敏感性试验测得CK活性最低值为CK—BB1.53U/L,CK—MB1.4U/L.3讨论3.1离子交换柱层析法能将CK同工酶很好地分离,并用动力学法测定酶活力,以助诊断心脏,中枢神经系统等的疾病.用本法分离CK同工酶,虽有过报道,但其研究重点多放在CK—MB上;对CK—BB的层析分离研究往往被忽略.本组资料证实:拄层析分离CK—BB也具有分离完全,特异性好,精密度大+线性关系好等特点.更兼灵敏,快速,能出的CK—BB话性晟低值为1.53U/i:同时柱析20份血清完成同工酶分离仅耗时30rain,如上测定时间,在50rain 内即可完成整个操作(电泳法器3～4h);层析获得率高达92.58,具有很大的临床应用价值.CK—BB大量存在于中枢神经维织中.当该组织病损时,可使血清CK—BB括性升高.本资料中用柱析法测1例大面积脑梗塞患者血清CK—BB活性升高达20u/1.,远高于用其它方法测定的正常值.3.2应用车法时,尚应注意以下问题:(1)琉基括化荆的应甩:柱析时CK需用琉基试剂活化.常用琉基酵,NAC.血清标本最好即刻测定,也可每1.2ml血清加28mmol/I巯基乙醇50l,一30℃冰箱中保存.(2)拖尾现象,本资料MM,MB洗出液分别只含CK—MM,MB,而BB洗出液杂含镦量MB.除急性心肌梗塞外,血清CK—MB含量甚低,且仅微量混人BB洗出液,并不影响对BB 分析,不威胁其临床应用价值.(3)洗脱液pH值及其最适用量:通常CK—MM,MB洗脱液pH均为8.0,明显高于CK反应最适pH6.8,CK同工酶舞垒洗脱器洗脱液量多,酶被稀释,测酶括性对加人基质后的反应液pH也难纠正列最适pH.本试验用pile.0洗脱液洗脱MB,当MB<7U/L时不能测出.参照Y asminch改良法用pH7.0后,能精确测出l_4U/L的CK—BB.一般CK同1酶用洗脱液洗至5ml时已完全洗脱(附图),但血清CK—MB,BB不可能达到图示组骞{提取液的浓度,如附图大面积脑梗塞急性期病人血清分离图表明,用洗脱液至3ml时CK—BB已被完全洗脱故洗脱剂用量以6,4,4ml为妥.参考文麓lMercerDW.Sparation0ftlssueandserumec tirekinaseisceatytaeshyion-exchangeco]olTmchromatography.ClinChem,1974l2o:36.2MercerDW.Detectionofc^rdiac-specificcreadne kinaseisoenzymeinserawithnormalOFslightly increasedIotaIcreatineklnaaeactivity.C1inChem+1975;2l:l088.3RosalkiSB.Animprovedprocedureforserum(-lea—tirephosphokinasedetermination.JLabClinMed.1967{69:696.(1995—05-29收瞢)36?瑚北医科大学SeparationofTissueandSerumCreatineKinaseIsoenzymes byIon—ExchangeMinocolumnChromatographyTanIaixun,LiuZhiehao,HeShanshu.etal (DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospital,HubeiMedicalUniversity. Wuhan430060,China)Abstract第17卷TheresultsofmeasurementofereatinekinaseisoenzymeactivitybyusingaDEAE—sephadexA一50minocolumnchromatographyindicatethattheCKisoenzymesinserumandtissuearcsepa —ratedcompletely.Agarosegelekctr0ph0resdemonstratedtherewereCK—MM,CKMBand CK—BBseparatelyincolumneffluentsofMM.MBandBB.QuantificationofCKisoenzymebythe assaydescribedisalsosensitive,exact,anditslinearrelationshipisverygood.rapidandeasyas wel1.MeSHcreatinekinase1s0enzyn1es/TP{chromatographytionexchange胆总管内串珠样结石1例报告吕仁更瑚北省耐贸医院.武投430015癀倒报告息者男性.{7岁.农民因右上腹阵发性庠璃8月加重伴皮肤发黄2月,于I989年1O月l1日^院^院时体拉:T36.7c.P6O敬/rain,R2O敬/min.BP13.2/8kPa急性消瘦病窖,营养差.皮肤巩膜明显黄染.心肺昕诊未见异常,肝牌不大,疽部平软+右上腹有禄压痛,Murhy's(+),肝区叩击囊(+).B超提示:胆总管内多发性结石,其中最大光团为z.1cm×1.5cm,最小为O.7cm×0.gca,胆囊12.5cm×5cm.肝内外胆管扩张,内径22cm.术中所见:患者于l0月16日在连续硬礁外麻醉下.经右上膜腹直肌切口,常规进睫,木中见胆囊约I3crn×6cm大小.张力较大,囊壁增厚呈慢性炎症改变.常规切际胆量.胆总管直径约23ca,其内可扪及多千结石.切开胆总管探查:位于胆总管下端有一直径为2ca 大小结石+取石时不慎夹碎,其余为多十大小不等结石.由一发丝样鞠串在一起,两蜡固定.中问结石为算珠样一可来回移动.术后病理诊断:慢性胆囊炎.胆色素结石一但其发丝样狗结构不清讨论据文鼓费辑报导:糙总管结石.约有80%属于呢抄样或疏橙块状的胆色素结石其中5有胆道蛔虫病病史.该病饲虽无明显蛔虫病史,病理拉查发墼样物序认为无虫体结树,但蕊其患者生括环境,卫生条件来看,仍应考虑为蛔虫死后残体在胆总管内经阻汁的化学作用而发生结构改变形成的发丝辑物.阻总管内因有异物,其结石成因也就因为异物引起胆道反复感染.大硒杆菌产生葡萄请睦双融,使可水解于胆汁中的双暂萄糖醛酸胆红素成为撤离胆红素.与钙结台后沉淀为胆红素钙,井以异物为中心形成胆色素结石.但象车病侧一蛔虫残体在胆总管内形成条索,发丝样物并贯穿多十结石中心,实属罕见.。

色谱柱清洗与再生色谱柱常见问题解决方法色谱柱清洗与再生除非特别说明，在全部情况下，所用溶剂的体积应当是色谱柱体积的40—60倍。

应在清洗过程开始和结束时各测一次柱效和容量因子等，比较色谱柱性能的改善，以确定清洗的效果。

确保色谱柱中没有样品和缓冲溶液，清洗前所用的溶剂应与最初清洗时所用的溶剂相溶。

应确保试验测试时所用的流动相与色谱柱中最后的溶剂相溶。

1.正相填料用四氢呋喃冲洗。

用甲醇冲洗。

用四氢呋喃冲洗。

二氯甲烷冲洗。

用无苯正己烷冲洗。

2.反相填料用HPLC级水冲洗，冲洗时进4等份的200μl的二甲亚砜（DMSO）。

用甲醇冲洗。

用氯仿冲洗。

用甲醇冲洗。

3.阴离子交换填料用HPLC级水冲洗。

用甲醇冲洗。

用氯仿冲洗。

4.阳离子交换填料用HPLC级水冲洗；在冲洗的过程中进4等份200μl的DMSO 四氢呋喃冲洗。

5.蛋白质凝胶过滤填料去除蛋白质尺寸排阻介质中的污染物有两种清洗/再生的方法。

弱保留蛋白质用30moL/L pH3.0磷酸盐缓冲液冲洗。

强保留蛋白质用100%的水到100%的乙腈梯度洗脱60min。

6.多孔石墨化碳多孔石墨碳有四种再生的方法，选用哪一种方法倚靠于被分析物和所用的溶剂。

酸碱再生适合于使用极性流动相分析离子类分析物。

将色谱柱倒装用50ml含0.1%三氟乙酸的四氢呋喃／水（1:1）溶液1ml/min 流速冲冼。

用50ml含0.1%三乙胺或氢氧化钠的四氢呋喃／水（1:1）溶液1ml/min流速冲冼。

用50ml含0.1%三氟乙酸的四氢呋喃／水（1:1）溶液1ml/min 流速冲冼。

用95%甲醇水溶液冲洗重新平衡。

将色谱柱改为正向。

强有机溶剂再生适合于水相分析极性或离子类分析物。

用50ml丙酮以1ml/min流速冲洗。

用120ml二丁醚以1ml/min流速冲洗。

用50ml丙酮以1ml/min流速冲洗。

用水冲冼至平衡。

正相再生适合于紧要使用正相流动相的多孔石墨化碳柱。

用50ml二氯甲烷以1ml/min流速冲洗。

湖北阴离子交换柱工作原理
湖北阴离子交换柱是一种常用的分离和纯化离子的技术工具，其工作原理如下：
1. 柱填充阴离子交换介质：柱中填充有一种阴离子交换介质，通常是一种具有大量阴离子交换基团的树脂。

这些基团具有亲和性，可以与待分离溶液中的阴离子发生离子交换。

2. 样品加载：待分离的溶液通过柱的顶部或侧面加入，样品溶液中的阴离子与阴离子交换基团发生离子交换反应。

根据样品的性质和需要，可以通过控制样品流速和溶液pH等条件来调
节样品中阴离子与阴离子交换基团的交换程度。

3. 阴离子吸附与洗脱：阴离子交换基团与样品中的阴离子进行离子交换后，被吸附在柱内，不被洗脱出来。

其他未被吸附的样品成分则通过柱底部排出。

为了完全洗脱目标物质，可以使用具有不同离子强度的洗脱缓冲液来冲洗柱子。

4. 目标物质的收集：经过多次洗脱后，目标物质会被逐步洗脱到柱的底部，可以使用收集管或分馏釜等设备来收集目标物质。

收集的目标物质可以进一步进行分析、纯化或其他处理。

总之，湖北阴离子交换柱通过阴离子交换基团与样品中的阴离子发生离子交换反应，实现了对目标物质的分离、纯化和富集。

其工作原理与样品的性质、离子交换基团的特性以及柱的设计等因素密切相关。

1. 目的1.1 本规程规定了用于层析柱的清洗与保存的方法和步骤，以提高柱子在蛋白纯化过程中的分离效果，实现良好的重现性；1.2 处理后可以减少蛋白间的交差污染和内毒素污染。

2. 范围2.1 本规程适用于所有的预装柱和个别内部填充的层析柱。

3. 职责3.1 在开始操作前，操作人员必须阅读并理解本规程规定的内容。

3.2 本操作中，会使用到危险化学品，应采取相应的保护措施。

4. 定义4.1 CV: 柱体积(Column Volume)5. 相关文件和记录5.1 N/A6. 规程6.1 通用操作6.1.1 所有的柱子在每次使用完后（一个循环）都应进行再生处理。

在位清洁（CIP）是为了除去上一个纯化循环中残留的已变性或是被牢牢吸附的沉淀物质。

6.1.2 所有的柱子都应在每次使用完后或是下面情况下立即进行清洁：●在进行下一批蛋白纯化前；●发现柱压异常升高；●5天以上不会使用。

6.1.3 按照层析柱的类型选择合适的清洁●以下操作中规定的都是最小清洁使用的体积，深度清洁可以增加清洁用体积；●相同类型的柱子可以串联起来一起进行整批清洁；6.1.4 每一步清洁结束后的UV 280nm就小于100mAU(如果有在线紫外检测装置的话)，否则，需要重复该步骤；6.1.5 发现以下情况，应将柱子或是树酯作废：●树酯颜色已变化●柱子反压力特别大●柱塞和胶之间出现空隙6.2 离子交换树酯葡聚糖凝胶柱的清洁（Q、SP Sepharose）6.2.1 将柱子反方向接到AKTA系统上；6.2.2 以2 CV 1M NaOH和2CV水冲洗，除去牢结在柱上的疏水蛋白或脂蛋白；6.2.3 以2 CV 2 M或更高浓度的NaCl溶液冲洗，除去强离子结合蛋白；6.2.4 最后，以5 CV 20 % 乙醇溶液清洗。

6.3 肝素（葡聚糖凝胶柱Heparin Sepharose）6.3.1 将柱子反方向接到AKTA系统上；6.3.2 以2 CV 0.1M NaOH和2CV水冲洗；6.3.3 以2 CV 2 M的NaCl溶液冲洗；6.3.4 最后，以5 CV 20 % 乙醇溶液清洗。

液相色谱柱该如何清洗？展开全文1、反相色谱柱分别用甲醇：水=90：10，纯甲醇（HPLC级），异丙醇（HPLC 级），二氯甲烷（HPLC级）等溶剂作为流动相，依次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积，然后再以相反的次序冲洗。

2、正相色谱柱分别用正己烷（HPLC级），异丙醇（HPLC级），二氯甲烷（HPLC级），甲醇（HPLC级）等溶剂做流动相，顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的柱体积(异丙醇粘度大，可降低流速，避免压力过高)。

注意使用溶剂的次序不要颠倒，用甲醇冲洗完后，再以相反的次序冲洗至正己烷，所有的流动相必须严格脱水。

3、离子交换色谱柱长时间在缓冲溶液中使用和进样，将导致色谱柱离子交换能力下降，用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生，反之，用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生。

另外，还可以选择能溶解柱内污染物的溶剂为流动相做正方向和反方向冲洗。

但再生后的色谱柱柱效是不可能恢复到新柱的水平的，如果柱子装反了，可以调回来，但可能会造成柱内担体塌陷，在不得已的情况下尽量不要反装色谱柱。

一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。

所用的溶剂都是随溶剂强度增加，经常后一个溶剂是非常疏水的(如醋酸乙酯甚至是烃) 可以用来溶解非极性物质如脂质和油类。

我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互混。

清洗过程要结束时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。

例如，异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。

但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。

当然，如果使用紫外检测器的话，避免溶剂在紫外区域有吸收，要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。

对于典型的硅胶键合柱来说如果没有缓冲溶液的话推荐使用以下溶剂系列：100% 甲醇100% 乙晴75% 乙晴 - 25% 异丙醇100% 异丙醇100% 二氯甲烷100% 正己烷用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶剂相容性柱子必须用异丙醇冲洗后才能用原来的水相溶剂。

IC-PAK阴离子交换柱使用指南2.3平衡The Ion Exclusion 色谱柱运输过程采用10％甲醇溶液储存，在用测试溶液和向之前必需平衡活化色谱柱平衡色谱柱：1.将色谱柱安装到仪器上。

2.用要求的洗脱液以0.5Ml/min的流速平衡10分钟，将大部分甲醇冲出色谱柱。

3.以0.1mLl/min的梯度的缓慢增加流速到1.0mL/min4采用1.0mL/min流速平衡20分钟，或者当基线平稳后才开始分析。

如果基线不稳，检查LC系统的其他部分。

3.1准备洗脱液指导原则：1.推荐的洗脱液是稀释的酸的水溶液注意：当流动相采用高浓度的有机相（超过20％）降低柱子的使用效果。

避免胺类，金属类，碱类和腐蚀剂，例如HCL.2.用0.45um或者更小孔径的滤膜过滤洗脱液以除去微生物。

用超纯水（18 megohm resistivity）,例如MILLI-Q的水。

3.使用真空脱气机/超声波去掉可溶于水的气体（影响泵）4.使用Waters 在线过滤系统保护系统。

3.2样品制备和过滤如果样品中含有那些可溶解的并且可能污染色谱柱的污染物或微粒，选用以下其中一种步骤：1.用Waters Sample Clarification包，或者Millex过滤样品，避免色谱柱堵塞反压增加。

2.用SEP-PAK小柱净化样品，避免污染物降低柱寿命。

更多的信息请看WC02.3.用IC-PAK保护柱，能吸收化学和物理污染物。

附录A是保护柱清单。

4.1色谱柱指南注意：新色谱柱使用前，请按4.2方法测试样品的分离。

指导原则：下面的操作指南能帮助您在Waters色谱柱上得到最好的的效果。

1.不要超过13MPa ( 13atm或2000psi )压力下使用2.过滤所有的洗脱液。

决不能使用混浊，有沉淀的流动相。

3.保护色谱柱，避免振动，机械性外力（导致洗脱液成分改变）4.当用水做流动相组分时，请用Milli-Q 水系统纯化的水。

我们可以选择去离子水或瓶装色谱级水，某些有机化合物改变柱子的敏感性。

层析柱反向冲洗的作用层析柱反向冲洗是一种常用的分离技术，在化学、医药、环境等领域都有广泛的应用。

它通过改变流动方向，从而实现对柱内样品的洗脱。

本文将从层析柱反向冲洗的原理、方法以及应用等方面进行介绍。

我们来了解一下层析柱反向冲洗的原理。

层析柱反向冲洗是基于固定相和流动相之间的相互作用原理。

在层析柱中，固定相是一种具有特定亲和性的材料，如树脂或纤维素等。

流动相则是一种溶液，可以是水、有机溶剂或其它适当的溶液。

当样品通过层析柱时，固定相与样品中的目标物质发生特异性的吸附作用，从而实现对目标物质的分离和纯化。

层析柱反向冲洗的方法有很多种，其中最常见的是使用洗脱剂进行冲洗。

洗脱剂可以是水、有机溶剂或其它适当的溶液，可以根据需要选择不同的洗脱剂。

在反向冲洗过程中，洗脱剂通过层析柱，与固定相中的目标物质发生相互作用，从而将其从固定相上解吸下来。

这样就实现了对目标物质的洗脱。

层析柱反向冲洗的方法不仅可以用于分离和纯化目标物质，还可以用于去除干扰物质。

在某些情况下，样品中可能存在一些与目标物质相似的结构物质，它们与固定相之间的相互作用可能会降低目标物质的纯度。

通过反向冲洗，可以去除这些干扰物质，提高目标物质的纯度。

层析柱反向冲洗在化学领域的应用非常广泛。

例如，在有机合成中，反应产物与副产物往往具有相似的性质，通过层析柱反向冲洗可以有效地将它们分离开来。

在药物研发中，目标物质的纯度对药物的安全性和有效性有着重要的影响，层析柱反向冲洗可以用于药物的纯化和分离。

此外，在环境监测和食品安全领域，层析柱反向冲洗也被广泛应用于对有害物质的检测和分析。

总结起来，层析柱反向冲洗是一种重要的分离技术，通过改变流动方向，实现对柱内样品的洗脱。

它在化学、医药、环境等领域都有着广泛的应用。

层析柱反向冲洗的原理是基于固定相和流动相之间的相互作用，通过使用洗脱剂进行冲洗，可以分离目标物质和去除干扰物质。

层析柱反向冲洗在化学合成、药物研发、环境监测等方面都发挥着重要的作用。

C18色谱柱的冲洗方法
C18色谱柱是一种常用的反相色谱柱，广泛应用于分离和纯化生物大分子、有机化合物等物质。

为了保证色谱柱的稳定性和使用寿命，有必要进行适当的冲洗。

以下是C18色谱柱的冲洗方法：
1. 使用纯水预洗：首先使用高纯度的水（如去离子水）预洗色谱柱，既可清除杂质，也可减少游离硅胶的溶解。

预洗时间一般为30分钟至1小时。

2. 醇洗法：使用有机溶剂如甲醇、乙醇等进行洗脱，可清除游离硅胶表面的疏水杂质与氧化物。

洗涤方法是按照以下顺序，首先使用甲醇洗脱5-10柱体积，随后使用水甲醇（95:5）混合液洗脱5柱体积。

最后用纯水洗脱2-3柱体积，以消除杂质和有机残留。

3. 酸洗法：使用pH值为2-3的酸溶液进行洗脱，可清除碱金属离子、氧化物等硅胶上的杂质和污染。

一般使用的酸为1%三氟乙酸（TFA）或1%醋酸溶液。

洗脱顺序为先使用甲醇洗脱5柱体积，然后使用酸溶液洗脱5柱体积，最后用酸性水洗脱2-3柱体积。

请根据具体情况选择合适的冲洗方法，尽量避免出现对色谱柱产生伤害的情况。

阴离子交换柱使用手册Chrompack HPLC IonoSpher A Columns注意Chrompack IonoSpher A色谱柱填充的是改性硅胶材料。

向柱内导入碱性溶剂（pH>6.5）或酸性溶剂（pH<2.5）会溶解硅胶材料导致柱子损坏。

在使用这个柱子之前，你要充分地熟悉这本手册讲述的内容。

1．简介Chrompack IonoSpher A 柱填充硅胶基质的强阴离子交换材料，含有季胺功能团。

特别设计用于使用常规HPLC分析有机和无机阴离子。

2．色谱柱老化在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。

一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。

要老化这类柱子，首先要使用甲醇淋洗，然后使用去离子水。

再用你选用的洗脱液进行平衡。

在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。

因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。

3．洗脱液推荐在这类柱上使用的洗脱液要求低电导，或者UV吸收的缓冲液，例如磷酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5。

绝对不能使用水杨酸缓冲液，因为水杨酸分解产物会改变固定相的性质。

另外，硝酸铵（1mM）可以改善峰型，而且不会明显影响保留时间，检测或定量结果。

洗脱液在使用以前要脱气，并用0.45微米滤膜过滤，防止发生检测和泵送问题。

一定要在开始使用系统以前检查有否微生物生长，否则你的柱子会堵塞，柱压会升高到无法接受的水平。

4．流量和压力增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。

如果你想更换柱子，，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。

拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。

高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。

使用保护柱（见第6节）会防止污染物沉积在分析柱上。

5．样品准备保持柱子长寿的关键是进样前适当的的样品处理。

你必须防止将疏水性/与流动相极性差别很大的化合物泵入色谱柱，不管是来自流动相还是样品。

特别地，要禁止导入颗粒杂质。