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植物学通报 2006, 23 (3): 249￣254Chinese Bulletin of Botany收稿日期： ２００５－１２－２０； 接受日期： ２００６－０３－０７基金项目： 科技部重大基础研究前期研究专项（９７３预研） （２００３ＣＣＡ０１１００）＊ 通讯作者 Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ． Ｅ－ｍａｉｌ： ｚｎｙａｎｇ＠ｓｈｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．研究报告．拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究王鹏程１ 王晨１ 米华玲２ 周根余１ 杨仲南１＊（１上海师范大学生命与环境科学学院 上海 ２００２３４）（２中国科学院上海植物生理生态研究所 上海 ２０００３２）摘要 生物信息学分析表明， 模式植物拟南芥叶绿体中含有大约４ ０００多种蛋白质， 目前只分离得到１ ０００多种， 其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。
本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白ＡＴ５Ｇ４８７９０进行了亚细胞定位研究。
我们克隆了该基因５＇端长１７８ ｂｐ的ＤＮＡ片段， 与绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因构建重组载体ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ。
转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察， ＧＦＰ只在叶绿体中特异表达。
实验结果表明， ＡＴ５Ｇ４８７９０的确为叶绿体蛋白。
本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。
关键词 融合蛋白， 亚细胞定位， 转运肽Study of Subcellular Localization of the Expressed Protein inArabidopsis thalianaＰｅｎｇｃｈｅｎｇ Ｗａｎｇ１， Ｃｈｅｎ Ｗａｎｇ１， Ｈｕａｌｉｎｇ Ｍｉ２， Ｇｅｎｙｕ Ｚｈｏｕ１， Ｚｈｏｎｇｎａｎ Ｙａｎｇ１＊１（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｏｎｍｅｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２３４）２（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， ２０００３２）Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｈａｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ａｂｏｕｔ ４ ０００ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ； ｈｏｗｅｖｅｒ， ｏｎｌｙａｂｏｕｔ １ ０００ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｖａｌｉｄａｔｅｄ． Ｔｈｕｓ， ｗｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｖｅｒｉｆｙｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ａｔ５ｇ４８７９０ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ａｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ １７８ ｂｐ ｓｅｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ５＇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｆｕｓｅｄ ｗｉｔｈ ＧＦＰ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａｂｉｎａｒｙ ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＯＮ５３０－ｃＴＰ－ＧＦＰ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｏｎ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ－ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｇｎａｌｓ ｗｅｒｅ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｎｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ Ａｔ５ｇ４８７９０ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｃａｎ ａｌｓｏ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉ－ｇａｔｅ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｔｏ ｂｅ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ， ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ， ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ叶绿体是高等植物以及藻类中的一类重要的细胞器， 由叶绿体膜、类囊体和基质３部分构成， 其主要功能是进行光合作用， 另外还参与氨基酸、脂肪酸的生物合成（Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
福建农林大学学报(自然科学版)第36卷第4期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Editi on)2007年7月拟南芥D NA_J结构域蛋白的生物信息学分析及其亚细胞定位验证宁正元1,王爱荣1,2,林文伟2,林德书2,张冬梅2,刘 泓2,周 洁2,王宗华23(1.福建农林大学计算机与信息学院;2.福建农林大学功能基因组学研究中心,福建福州350002)摘要:对拟南芥RSS1蛋白进行了一系列生物信息学分析,结果表明:该蛋白是一C端含有DNA_J结构域的辅助蛋白,其N 端含有受体蛋白复合物AP22结合区DPF/W和Fx DxF区,中间区域含有可信度较低的丝氨酸富集区和谷氨酸富集区.该蛋白可能具有ATP结合活性、丝氨酸/苏氨酸激酶活性和磷酸酶活性,可调控细胞循环和蛋白的磷酸化和去磷酸化作用.利用洋葱表皮瞬时表达系统验证了RSS12GFP融合蛋白定位于细胞核中,为进一步研究该蛋白的分子和生物学功能奠定了良好基础.关键词:拟南芥;辅助蛋白;J结构域;生物信息学中图分类号:Q7;Q23文献标识码:A文章编号:167125470(2007)0420427208B i o i n forma ti cs and subcellul ar loca li za ti on ana lysis of a prote i n con t a i n i n gthe D NA_J doma i n of A rab idopsis tha lianaN I N G Zheng2yuan1,WANG A i2r ong1,2,L I N W en2wei2,L I N De2shu2,ZHANG Dong2mei2,L I U Hong2,Z HOU J ie2,WANG Z ong2hua2(1.College of Computer and I nfor mati on;2.Functi onal Genom ics Center,Fujian Agriculture and ForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)Abstract:A series of bi oinfor matics analysis of RSS1p r otein of A rabidopsis thaliana was analyzed.The result showed that RSS1had a J2domain,rese mbling clathrin2uncoating fact or auxilin at its C ter m inus.It als o contained an A s p2Pr o2Phe(DPF)adap t or p r otein2 binding motif and Fx DxF motif at the N ter m inus,which was known t o bind t o the appendage domain ofαorβsubunits of an adap2 t or p r otein comp lex AP22.Moreover,there were a serine2rich regi on and a gluta m ic acid2rich regi on in RSS1.The bi oinf or matics data suggested that RSS1m ight have ATP2binding activity,serine/thrine kinase or phos phatase activity and it m ight regulate cell cy2 cle or phos phorylati on or dephos phorylati on of p r oteins.Subcellular l ocalizati on by instant exp ressi on of RSS12GFP fusi on p r otein on oni on ep ider m is showed that RSS1was l ocalized in nucleolus,which would hel p t o further characterize molecular or bi ol ogical func2 ti ons of the p r otein.Key words:A rabidopsis thaliana;auxilin;J2domain;bi oinfor maticsDNA_J结构域是一个非常保守的结构域,大约由70个氨基酸残基组成,其核心结构是组氨酸/脯氨酸/天冬氨酸(H is/Pr o/A s p,HP D)三肽[1].在大多数生物中都存在含J结构域的蛋白,其J结构域介导了与特异H s p70的相互作用[2,3].该结构域空间结构紧凑,由螺旋———转角———螺旋———环———螺旋———转角———螺旋组成一个疏水中心,2个螺旋在卷曲螺旋中起作用,HP D位于环和2个反向平行的螺旋之间的连接区域[4].拥有J结构域的蛋白是一个很大的家族.W alsh et al[5]将J蛋白家族分为3类.DnaJ和辅助蛋白(auxilin)分别代表了其中2种类型,前者与热激蛋白H s p70结合而调控ATP酶活性,对大量变性多肽具有亲和性[6];而辅助蛋白则与网格蛋白(clathrin)高特异性地结合,在胞吞(或胞吐)作用中调节网格蛋白被膜小泡的脱包被[7,8].尽管这二者的J结构域显著不同,但参与疏水核心形成的关键残基和基本的HP D片段是保守的[7].辅助蛋白有2种类型,分别称为辅助蛋白1(auxilin1)和辅助蛋白2(auxilin2).辅助蛋白1是动物大收稿日期:2006-11-12 修回日期:2007-05-18基金项目:福建省自然科学基金资助项目(D0510020);国家自然科学基金资助项目(30471178).作者简介:宁正元(1957-),男,教授.研究方向:算法设计分析与生物信息学.3通讯作者.Email:zonghua w@.824福建农林大学学报(自然科学版)第36卷 脑特异蛋白,因其C端的J结构域而被列入伴侣蛋白辅助因子的DnaJ家族,通过其C端的J结构域特异地与H s p70家族成员H sc70结合.它也有一个N末端片段,该片段含有肿瘤抑制基因(编码PTE N或与肌动蛋白相结合的张力蛋白)和网格蛋白结合功能域[9].辅助蛋白2在许多组织中都有表达,被称为与细胞周期G有关的蛋白激酶(cyclin G2ass ociated kinase,G AK)[10,11].除了在序列上与辅助蛋白1相似外,它在N末端还有一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域.然而,体外网格蛋白被膜小泡的脱包被过程仅需要这2种辅助蛋白中的网格蛋白结合结构域和J结构域就可以完成[8,12-14].在拟南芥(A rabidopsis thaliana)基因组中共有89个含J结构域的蛋白,根据序列比对以及对结构、功能的预测,将这些蛋白分成51个家族,各个家族的成员有1-6个[15].目前,我们获得一个抗核盘菌[S cle2 rotinia sclerotiorum(L ib.)de Bary]引致的菌核病的激活标签突变体,经分析它是一个编码含有J结构域、类似于辅助蛋白2的蛋白———A t1g30280基因.为了解该基因所编码的抗菌核病蛋白RSS1(resistance t o S.sclerotiorum)的结构和功能,我们对其进行了一系列生物信息学分析,并进行了亚细胞定位验证.1 材料与方法1.1 蛋白序列的获得及分析筛选获得的激活标签突变体,经T A I L2PCR扩增、测序和序列比对得到T2DNA插入位点临近基因的序列,并以此在T A I R网站中得到激活基因所编码的RSS1氨基酸序列,通过MotifScan找出潜在功能区;运用PredictPr otein预测该蛋白的二级结构,通过ScanPr osite预测其结构域;利用S wiss2Model数据库预测该蛋白的三维结构;通过GoFigure预测其分子功能和生物学途径;利用LOCtree(cite)软件进行亚细胞定位预测.1.2 相似性比较利用NCB I数据库和T A I R数据库对RSS1保守J结构域的氨基酸序列进行BLASTP搜索,找到序列相似性较高的基因号及其氨基酸序列;然后利用Clustal X进行多重比对,并建立系统关系树.1.3 RSS12GFP融合蛋白的瞬时表达以野生型拟南芥(Col24生态型)基因组DNA为模板,利用RSS1基因的特异引物RSS1F(5′GGGG A2 CAAGTTTGT ACAAAAAAGCAGGCTT CATGG ACG AAT CTTGGCGT ATG3′)和RSS1R(5′GGGG ACCACTTTG2 T ACAAG AAAGCTGGGTCGCTCG AG AGTCCTTCATTTGTT AC3′)对ORF进行PCR扩增;并将扩增产物克隆到含有GFP基因的Gate way载体35S2G W2GFP中;然后利用洋葱表皮瞬时表达该融合蛋白;在Zeiss510 MET A型激光扫描共聚焦显微镜(德国产)上进行观察.2 结果与分析2.1 RSS1蛋白序列分析该蛋白含有455个氨基酸残基,其氨基酸序列如图1所示.对其结构域的搜索发现,该蛋白的C端具有一个DNA_J结构域(图2A).多重比对结果表明该结构域与拟南芥中的几个类辅助蛋白的J结构域具有很高的同源性,其中与A t1g75100的进化距离最近(图5).该结构域与人(Ho m o sapiens)和鼠(M us m us2 culus)的G AK蛋白和辅助蛋白的J结构域也有较高的同源性,在该结构域的中间也含有高度保守的H is/ Pr o/A s p(HP D)三肽(图2B).在该蛋白的N端含有很短的保守Fx DxF区(图3).此外,该蛋白中还含有谷氨酸富集区和低可信度的丝氨酸富集区;而在A t1g75310、A t4g12770、A t4g12780、A t4g36520四个蛋白中含有谷氨酸富集区;在A t1g75100、A t4g36520、A t1g21660三个蛋白中也含有一丝氨酸富集区(图2A、图4).整个蛋白中共有15个蛋白激酶C磷酸化位点、5个N2肉豆蔻酰化位点、11个酪蛋白激酶II磷酸化位点、5个c AMP2和cG MP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、1个N2糖基化位点(表1).图1 RSS1的氨基酸序列Fig .1 Am ino acid sequence of RSS1p r otein表1 利用M oti fScan 对RSS1蛋白功能域的预测结果Table 1 The domain p redicti on result of RSS1p r otein by MotifScan功能域信息相匹配的氨基酸序列区蛋白激酶C 磷酸化位点4-6,46-48,78-80,109-111,114-116,157-159,169-171,174-176,211-213,225-227,260-262,291-293,324-326,339-341,366-368依赖于c AMP 2和cG MP 的蛋白激酶磷酸化位点47-50,115-118,171-174,175-178,212-215酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点54-57,93-96,109-112,132-135,147-150,260-263,332-335,342-345,348-351,366-369,387-390N 2豆蔻酰化位点68-73,74-79,101-106,210-215,301-306N 2糖基化位点126-129丝氨酸富集区114-180谷氨酸富集区267-360DNA 2J 结构域386-452 A.ScanPr osite 软件对RSS1结构域的预测结果;B.拟南芥中几个辅助蛋白的J 结构域与人和老鼠中几个辅助蛋白的J 结构域比较(3号表示同一氨基酸存在于所有蛋白质中).图2 RSS1的C 端J 结构域Fig .2 J domain at C 2ter m inus of RSS1p r otein图3 RSS1和拟南芥中类似于辅助蛋白的N 端短保守区Fig .3 N 2end conserved regi on of RSS1and other auxilin 2like p r oteins924 第4期宁正元等:拟南芥DNA_J 结构域蛋白的生物信息学分析及其亚细胞定位验证图4 RSS1及其同源蛋白的功能域Fig .4 The domains of RSS1and its ′homologs图5 拟南芥RSS1J 结构域同源蛋白的系统关系分析Fig .5 Phyl ogenetic analysis of RSS1and its homol ogs in A rabidopsis2.2 RSS1二级和三级结构的预测表2 RSS1二级结构分析结果Table 2 The anaysis result of RSS1second structure 条目分析结果序列长度(氨基酸)455二级结构螺旋=26.2%,股=7.7%,环=66.2%卷曲螺旋区域无跨膜螺旋无非正规二级结构区78-245 在明确了RSS1氨基酸序列及其功能域后,进一步用PredictPr otein 软件对RSS1的二级结构进行分析.结果(表2)表明,其中26.2%的序列是螺旋结构,7.7%的序列是β2折叠结构,而66.2%的序列是环形结构,没有卷曲螺旋和跨膜螺旋区域,但有一个非正规的二级结构区(在78-245个氨基酸残基之间).J 结构域的核心三肽HP D 位于2个螺旋之间的连接区域(图6).利用S wiss 2Model 数据库预测该蛋白的三维结构,结果如图7所示.034福建农林大学学报(自然科学版)第36卷 图6 RSS1蛋白的二级结构预测的部分结果Fig .6 The partial p redicted secondary structure of RSS1图7 RSS1蛋白三级结构的预测结果Fig .7 The p redicted tertiary structure of RSS12.3 RSS1蛋白的分子功能和生物学途径预测利用GoFigure 对该蛋白的分子功能及生物学途径等进行预测,结果发现该蛋白可能具有ATP 结合活性、丝氨酸/苏氨酸激酶活性和磷酸酶活性,可调控细胞循环和蛋白氨基酸的磷酸化和去磷酸化作用(图8、9).但是,进一步分析图8、9中所标出的几种蛋白的结构,发现RSS1蛋白的结构与这几种推导出其分子功能和生物学途径的蛋白的结构有很大不同.它们虽然都含有J 结构域,但RSS1蛋白不含蛋白激酶结构域、张力蛋白的磷酸酶和C2结构域和脯氨酸富集区(图2A 、图10).因此,RSS1蛋白是否具有上述功能还有待于进一步研究证实.2.4 RSS1蛋白亚细胞定位分析LOCtree 的预测结果显示该蛋白是DNA 结合蛋白,定位于细胞核中(表3).表3 RSS1蛋白的亚细胞定位预测结果Table 3 The p redicted subcellular l ocalizati on of RSS1by p r ogra m LOCtree (cite )项目分析结果蛋白预测工具testSeq 预测定位区DNA 2结合可靠性指数4亚细胞定位预测非分泌,细胞核,DNA 2结合亚细胞定位预测的可靠性指数10,9,4为验证该预测结果,将RSS12GFP 融合,利用洋葱表皮对RSS12GFP 融合蛋白进行瞬时表达,观察其亚细胞定位,结果发现对照GFP 仅在细胞膜上有分布,而RSS12GFP 融合蛋白在细胞膜和细胞核中有分布(图11).3 讨论RSS1蛋白C 端有一J 结构域,类似于网格蛋白脱包被因子的辅助蛋白(图2).在胞吞作用中网格蛋白与受体蛋白复合体共同组成网格蛋白被膜小泡[16].辅助蛋白的J 结构域与热激蛋白H sc70相结合,并将H sc70靶向网格蛋白,然后网格蛋白与辅助蛋白的氨基末端相互作用[17].辅助蛋白的氨基末端有不保守的网格蛋白结合区域,并且在这个区域都含有一个A s p 2Pr o 2Phe /Tr p (DPF /W )受体蛋白结合区[秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans )的辅助蛋白除外][9,18,19].已知这个区域与一个受体蛋白复合物AP 22的α或β亚基的附加结构域相结合形成的一个异源四聚体是形成网格蛋白被膜小泡所必需的.在RSS1和拟南芥其它3个类辅助蛋白中均发现有1个DPF motif (A t1g21660、A t4g12770和A t4g12780)[20]. 最近,A t4g12770被证明可在体外使网格蛋白被膜小泡脱包被,表明它是一个拟南芥的辅助蛋白[21].A t1g12770可与拟南芥中含SH3结构域的蛋白1(A tSH3P1)相互作用,参与网格蛋白被膜小泡的转运过程[21].A t4g12770和A tSH3P1通过一个富含脯氨酸的结构域而相互作用.这个富含脯氨酸结构域在RSS1中不存在,表明RSS1在依赖A tSH3P1的网格蛋白被膜小泡脱包被过程中不起作用.除了DPF /W motif 外,Phe 2x 2A s p 2x 2Phe (Fx DxF,x 是任意氨基酸)motif 也被认为是AP 22的一个附加结合motif,它在网格蛋白被膜小泡的装配过程中几种不可缺少的附加蛋白中均有发现[22].拟南芥的类辅助蛋白如RSS1、A t1g75100、A t4g12770和A t4g12780在N 端的保守片段中都含有这个motif (图2C ).目前还不清楚植物中Fx DxF 或DPF /W motif 是否也作为AP 22的附加结合结构域而起作用.辅助蛋白缺失的酿酒酵母(Saccha 2ro m yces cerevisiae )[23,24]和秀丽隐杆线虫[13]突变体,由于网格蛋白被膜小泡脱包被受损而表现出生长缺陷.但RSS1突变体对野生型的生长与发育没有影响.但该蛋白的过量表达突变体表现出对菌核病的抗性增强,而缺失突变体对菌核病的抗性减弱.可否通过网格蛋白介导的胞吞作用调节植物对核盘菌的抗性有待于进一步研究.对RSS1相互作用蛋白进行鉴定,可能有助于阐明RSS1在调节植物对菌核病抗性中的作用.134 第4期宁正元等:拟南芥DNA_J 结构域蛋白的生物信息学分析及其亚细胞定位验证图8 RSS1蛋白的生物学功能预测结果Fig .8 The p redicted bi ol ogical functi ons ofRSS1图9 RSS1蛋白的分子功能预测结果Fig .9 The p redicted molecular functi ons of RSS1234福建农林大学学报(自然科学版)第36卷 图10 与RSS1同源性较高的蛋白的结构域预测Fig .10 The p redicted domains of RSS1and its homologsA.对照GFP 蛋白(左为激光,右为明场);B.RSS12GFP 融合蛋白(左为激光,右为明场).图11 洋葱表皮瞬时表达RSS12GFP 融合蛋白的亚细胞定位Fig .11 Subcellular l ocalizati on of RSS12GFP fusi on p r otein by oni on ep ider m is instant exp ressi on syste m参考文献[1]KE LLEY W L.The J 2domain fam ily and the recruit m ent of chaper one power[J ].Trends B i ochem Sci,1998,23:222-227.[2]BUK AU B,HOR W I CH A L.The H s p70and H s p60chaper one machines[J ].Cell,1998,92:351-366.[3]WALTER S,BUCHNER J.Molecular chaper ones 2cellular machines f or p r otein f olding[J ].Angewandte Che m ie I nternati onalEditi on,2002,41(7):1098-1113.[4]PE LLECCH I A M ,SZYPERSKI T,WALL D,et al .NMR structure of the J 2domain and the Gly/Phe 2rich regi on of the Esche 2richia coli DnaJ chaper one[J ].J Mol B i ol,1996,260(2):236-250.[5]WALSH P,BURS AC D,LAW Y C,et al .The J 2p r otein fam ily:modulating p r otein asse mbly,disasse mbly and transl 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第1篇实验目的：本研究旨在通过亚细胞定位技术，确定目标蛋白质在细胞内的具体分布位置，为进一步研究该蛋白质的生物学功能提供实验依据。
实验材料：1. 目标蛋白质表达质粒2. 表达载体（如pEGFP-N1）3. 农杆菌（如GV3101）4. 烟草植株5. 激光共聚焦显微镜6. 其他实验试剂和仪器实验方法：1. 构建表达载体：将目标蛋白质基因与表达载体（如pEGFP-N1）连接，构建融合表达质粒。
2. 农杆菌转化：将构建好的融合表达质粒电转化农杆菌，获得转化子。
3. 农杆菌培养：将转化子接种于YEB液体培养基中，在170rpm/min的条件下培养1小时。
4. 农杆菌悬浮：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接于10ml YEB液体培养基中，悬浮农杆菌。
5. 收集菌体： 4000rpm/min，离心4分钟，去除上清。
6. 重悬菌体：用10mM MgCl2（含120uM AS）悬浮液重悬菌体，调整OD600至0.6左右。
7. 注射烟草：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1ml注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注。
8. 培养烟草：将注射完成的烟草植株弱光培养2天。
9. 观察与拍照：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，在激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。
实验结果：通过激光共聚焦显微镜观察，发现融合表达质粒中的绿色荧光蛋白（GFP）信号在烟草叶片中呈现明显的细胞内分布。
根据GFP信号的位置，可以初步判断目标蛋白质在细胞内的分布情况。
结果分析：1. 细胞核定位：若GFP信号主要分布在细胞核区域，则表明目标蛋白质定位于细胞核。
2. 细胞质定位：若GFP信号主要分布在细胞质区域，则表明目标蛋白质定位于细胞质。
3. 细胞膜定位：若GFP信号主要分布在细胞膜区域，则表明目标蛋白质定位于细胞膜。
根据实验结果，可以初步判断目标蛋白质在烟草细胞中的定位情况，为进一步研究其生物学功能提供实验依据。
讨论：1. 亚细胞定位实验是研究蛋白质生物学功能的重要手段之一。
拟南芥中八个SR蛋白的亚细胞定位和功能研究概述：拟南芥是一个小型的花卉模型植物，被广泛应用于分子遗传学和生物学领域。
其中，SR蛋白家族作为调节基因剪接的重要蛋白家族，在拟南芥中具有广泛的重要作用。
通过对拟南芥中八个SR蛋白的亚细胞定位和功能研究，可以更深入地了解SR蛋白在基因剪接调控中的作用机制。
一、SR蛋白家族的概述SR蛋白家族是受到剪接启动因子的调节，参与导致转录本编码区的剪接。
它通常包含一个或多个RNA结合域并在C-末端包含一个RS区域。
SR蛋白家族在真核生物中广泛存在，参与多种细胞过程，包括转录调控、转录本剪接、转录本核移位等等。
在拟南芥中，SR蛋白家族共拥有十个成员，其中八个是核定位的SR蛋白。
二、 SR蛋白家族的亚细胞定位SR蛋白在亚细胞定位中起着重要的作用，通过对其亚细胞定位的研究可以更好地了解SR蛋白在基因剪接调控中的作用机制。
针对拟南芥中八个核定位的SR蛋白的研究发现，它们主要存在于细胞核和核仁中，并且呈现出不同的分布模式：SR34和SR45蛋白主要存在于细胞核中，SR30和SR33蛋白则主要存在于核仁中；SR34和SR45蛋白均表现出强烈的核质分布，SR30和SR33蛋白表现出弱的核质分布。
三、 SR蛋白家族在基因剪接调控中的功能SR蛋白家族是调节剪接启动因子的重要蛋白家族。
通过与其他调控剪接因子的相互作用，它们可以影响基因剪接的发生及剪接后mRNA的稳定性。
在拟南芥中，SR蛋白在许多生物过程中持续发挥重要作用。
例如，在植物感染病毒的过程中，SR34和SR34B蛋白可以调节基因剪接，从而防止病毒感染。
拟南芥SR30蛋白参与了许多发育过程的调节，如花发育和种子发育等。
SR33蛋白在植物幼苗抗逆境中起着重要作用，可以促进植物对低温和干旱的抵抗力。
四、 SR蛋白调节基因剪接的机制SR蛋白家族是调节基因剪接的重要蛋白家族，其作用机制是通过与其他调节剪接因子相互作用，影响基因剪接的发生和选择。
蛋白亚细胞定位方法
蛋白质的亚细胞定位是指确定蛋白质在细胞内的具体位置。
这对于理解蛋白质的功能和细胞生物学过程至关重要。
以下是一些常用的蛋白质亚细胞定位方法：
1. 免疫荧光技术：这是一种基于抗体特异性结合的方法。
通过使用针对目标蛋白质的特异性抗体，将其标记上荧光染料，然后观察荧光信号在细胞内的分布，从而确定蛋白质的亚细胞定位。
2. 荧光蛋白标记：将目标蛋白质与荧光蛋白（如GFP、RFP 等）融合表达，使其在细胞内发出特定颜色的荧光。
通过观察荧光的分布，可以确定蛋白质的亚细胞定位。
3. 细胞器特异性染料：使用细胞器特异性染料对细胞进行染色，然后观察目标蛋白质与这些染料的共定位情况。
例如，使用线粒体染料可以确定蛋白质是否定位于线粒体。
4. 免疫组织化学技术：该方法用于检测组织切片中的蛋白质定位。
通过使用针对目标蛋白质的抗体，将其标记上可见的染料，然后观察染料在组织切片中的分布。
5. 蛋白质相互作用分析：通过研究蛋白质与其他已知亚细胞定位的蛋白质之间的相互作用，可以间接推断目标蛋白质的亚细胞定位。
这些方法可以单独使用，也可以结合使用，以提高蛋白质亚细胞定位的准确性。
在进行蛋白质亚细胞定位研究时，需要选择合适的方法，并结合其他实验手段进行综合分析。
蛋白质表达的亚细胞定位及其在细胞生理学中的应用研究蛋白质是细胞内最基本的分子组成单位，它在细胞生理学中起着至关重要的作用。
了解蛋白质的亚细胞定位是研究其功能和调控机制的关键一步。
随着科技的发展和技术手段的改进，人们对于蛋白质表达的亚细胞定位有了更深入的认识。
本文将探讨蛋白质亚细胞定位的研究方法和其在细胞生理学中的应用。
一、蛋白质亚细胞定位的研究方法1. 免疫共沉淀（immunoprecipitation）免疫共沉淀是通过特异性的抗体与目标蛋白质结合，进而将蛋白质-抗体复合物沉淀下来。
通过这种方法可以精确地确定蛋白质与其他细胞组分之间的相互作用关系，并推测其亚细胞定位。
2. 免疫荧光染色（immunofluorescence）免疫荧光染色是通过将特异性抗体与荧光染料结合，使其能够与特定蛋白质结合。
这种方法可以直接观察蛋白质在细胞中的分布情况，并判断其亚细胞定位。
3. 蛋白质组学（proteomics）蛋白质组学是通过全面分析蛋白质组成和表达水平，探索蛋白质在细胞中的定位和功能。
通过检测细胞内不同组分中蛋白质的表达水平和亚细胞定位，可以更全面地了解蛋白质在细胞内的分布规律。
二、蛋白质亚细胞定位的研究进展1. 细胞器定位细胞器定位是研究蛋白质亚细胞定位的重要方面。
通过免疫染色等方法，已经确定了许多蛋白质的定位，例如线粒体、内质网、高尔基体等。
这些发现为我们进一步了解细胞器功能和调控提供了重要线索。
2. 信号序列研究蛋白质的亚细胞定位通常与其信号序列有关。
研究人员通过对信号序列的分析，可以预测蛋白质的亚细胞定位，并验证其功能。
这一研究领域已经取得了很大进展，并为我们理解蛋白质定位和功能提供了依据。
三、蛋白质亚细胞定位在细胞生理学中的应用1. 疾病诊断与治疗蛋白质亚细胞定位在疾病的诊断和治疗中发挥着重要的作用。
通过研究蛋白质在正常和疾病细胞中的定位差异，可以发现一些疾病的标志物，并为疾病的早期诊断提供依据。
蛋白质亚细胞定位与功能的研究进展蛋白质是生物体内最基本的组成部分之一，同时也是细胞进行多种生物学功能的关键分子。
蛋白质的亚细胞定位与功能研究是现代生物学领域的热点之一。
通过了解蛋白质在细胞内的定位以及其功能的研究进展，我们可以更好地理解生物体内的生理过程，并为疾病治疗和生物技术发展提供重要依据。
一、蛋白质亚细胞定位的研究进展蛋白质的亚细胞定位是指蛋白质在细胞内的分布位置。
准确了解蛋白质的亚细胞定位有助于揭示蛋白质在细胞内的功能以及相互之间的相互作用关系。
近年来，随着细胞生物学、蛋白质组学以及高通量定位技术的不断发展，研究者们对蛋白质亚细胞定位的研究取得了许多重要进展。
1. 免疫荧光染色和显微镜技术免疫荧光染色和显微镜技术是最常用的研究蛋白质亚细胞定位的方法之一。
通过标记特定的蛋白质，并利用荧光染料或荧光蛋白进行显微镜观察，可以直观地观察蛋白质在细胞内的分布。
然而，该方法的分辨率有限，难以观察到蛋白质的亚细胞定位信息。
2. 亚细胞定位数据库为了方便科研工作者查询蛋白质的亚细胞定位信息，相应的数据库应运而生。
亚细胞定位数据库通过整合大量的实验证据，提供了蛋白质亚细胞定位的准确信息。
研究者们可以通过输入蛋白质的名称或序列进行查询，获得该蛋白质的亚细胞定位信息。
目前，多个亚细胞定位数据库已经建立，如UniProt、LOCATE和GO等。
二、蛋白质功能的研究进展蛋白质的功能取决于其结构和相互作用关系。
随着结构生物学和蛋白质相互作用技术的迅速发展，研究者们对蛋白质功能的研究也取得了长足的进展。
1. 结构生物学结构生物学是研究蛋白质结构的重要手段。
通过采用X射线晶体学、核磁共振等技术，研究者们能够解析蛋白质的三维结构，并从中揭示其功能机制。
目前，已经有大量的蛋白质结构数据被解析，其中一些蛋白质还形成了结构数据库，如PDB数据库。
2. 蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用是实现细胞内多种生理功能的基础。
研究者们利用蛋白质亲和纯化、酵母双杂交和质谱等技术，系统地研究了蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系。
蛋白质亚细胞内定位的生物学研究蛋白质是细胞内活动的重要分子，它们需要在细胞内的不同位置起特定的生物学功能。
蛋白质亚细胞定位是非常重要的研究领域，因为它对于理解蛋白质功能与调控的机制具有重要的意义。
蛋白质亚细胞定位包括在细胞质、细胞核、线粒体、内质网、高尔基体等不同的细胞器中的分布。
每一种亚细胞定位都有与之对应的负责蛋白质的运输机制和调控方式。
研究表明，蛋白质亚细胞定位受到多种因素的影响，如蛋白质胺基酸序列特异性、信号肽、蛋白质结构与亲疏水性、翻译后修饰等。
这些因素相互作用，形成了复杂的蛋白质定位机制。
以线粒体亚细胞定位为例，线粒体是细胞内的能量合成中心，同时也参与了细胞凋亡、细胞周期等生物学过程。
研究表明，线粒体定位的蛋白质往往含有线粒体定位信号肽。
当细胞准备将蛋白质运输到线粒体时，信号肽被翻译后修饰，大量带正电荷的氨基酸使得蛋白质靶向到线粒体内质膜，并被线粒体的翻译机器所处理。
类似于线粒体亚细胞定位机制，其它亚细胞定位的机制也仍有很多不为人知的秘密等待研究。
理解亚细胞定位机制的基础以及其调节方式，对于研究生物系统的正常功能和疾病进展提供了非常重要的数据。
例如，在肝细胞等人体组织中富含的核糖体蛋白P的过度表达会导致粘多糖沉积症和铜沉积病等等。
因此，对于蛋白质亚细胞定位的生物学研究在未来的潜在意义上逐渐体现出重要性。
研究者可以在深入探究蛋白质生物学机制的同时，进一步发掘可治疗、改善人类健康的可能性。
