人中性粒细胞碱性磷酸酶NAP酶联免疫分析ELISA

酶联免疫吸附试验 elisa原理酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见的实验室技术，用于检测生物分子如蛋白质、抗体、荷尔蒙和病毒等。

ELISA技术基于抗原和抗体的特异性结合，通过酶标记物和底物的反应来检测分子的存在或浓度。

ELISA技术的原理可以分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA 和夹心ELISA等几种。

其中，间接ELISA是最常见的类型，下面将详细介绍其原理和步骤。

一、间接ELISA的原理间接ELISA利用抗体与抗原的特异性结合来检测分子的存在或浓度。

该方法需要用到两种抗体：第一种是特异性抗体，用于检测目标分子；第二种是酶标记抗体，用于检测第一种抗体的结合情况。

具体步骤如下：1. 将抗原溶液加入微孔板中，并在室温下孵育一定时间，使抗原吸附于微孔板表面。

2. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的抗原和杂质。

3. 加入一定浓度的非特异性蛋白质，如牛血清蛋白或奶粉，以防止非特异性结合。

4. 加入一定浓度的特异性抗体，使其与抗原结合。

5. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的抗体和杂质。

6. 加入一定浓度的酶标记抗体，使其与第一种抗体结合。

7. 将微孔板洗涤干净，以去除未结合的酶标记抗体和杂质。

8. 加入底物，使酶标记抗体产生颜色反应。

9. 测量吸光度，来确定目标分子的存在或浓度。

二、间接ELISA的优缺点间接ELISA具有以下优点：1. 可以检测极低浓度的分子，如病毒和荷尔蒙。

2. 可以同时检测多个样本。

3. 可以检测多种类型的生物分子，如蛋白质、抗体、荷尔蒙和病毒等。

4. 可以使用多种酶标记抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）和过氧化物酶（POD）等。

5. 可以使用多种检测方法，如发光、荧光和色谱法等。

间接ELISA的缺点包括：1. 检测过程需要多个步骤，比较繁琐。

2. 需要特异性抗体和酶标记抗体，成本较高。

3. 受到非特异性结合的影响，可能会出现假阳性结果。

三、间接ELISA的应用间接ELISA广泛应用于医学、生物学、生物工程和食品安全等领域。

酶联免疫检测法一、概述酶联免疫检测法是一种常见的生物分子检测方法，它利用酶作为标记物来检测目标分子，具有高灵敏度、高特异性、易操作等优点，广泛应用于医学、生物学、化学等领域。

二、原理酶联免疫检测法基于抗原-抗体反应原理，包括直接酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等多种类型。

其中，最常见的是直接和间接ELISA。

1. 直接ELISA直接ELISA是将已知抗体固定在微孔板上，并加入待检样本中含有目标抗原的溶液，经过一定条件下的反应后，再加入与目标抗原结合的酶标记二抗，在适当条件下进行染色反应并测定吸光度值。

其优点是操作简单快捷，但缺点是灵敏度略低。

2. 间接ELISA间接ELISA是将已知抗体固定在微孔板上，并加入待检样本中含有目标抗原的溶液，在适当条件下进行反应后加入与目标抗原结合的一抗，再加入与一抗结合的酶标记二抗，在适当条件下进行染色反应并测定吸光度值。

其优点是灵敏度高，但操作稍复杂。

三、步骤酶联免疫检测法的基本步骤如下：1. 预处理样本：根据不同的样本类型和检测要求，可以进行不同的处理方法，如离心、洗涤、稀释等。

2. 固定抗原或抗体：将已知抗体或抗原固定在微孔板上。

3. 加入待检样本：加入含有目标分子的待检样本。

4. 洗涤：将未结合的物质洗去。

5. 加入酶标记二抗或一抗：根据实验设计需要选择适当的酶标记二抗或一抗，并加入微孔板中与目标分子结合。

6. 洗涤：将未结合的物质洗去。

7. 加入底物：加入适当底物后，在适当条件下进行染色反应。

8. 停止反应并测定吸光度值：在反应停止后，使用光谱仪等设备测定吸光度值，并根据标准曲线计算待检样本中目标分子的浓度。

四、应用酶联免疫检测法在医学、生物学、化学等领域有广泛的应用，常见的应用包括：1. 临床诊断：如肝炎病毒、艾滋病毒等感染的诊断。

2. 药物检测：如抗生素、激素等药物残留的检测。

3. 食品安全：如农药残留、食品添加剂等的检测。

临床感染和炎症指标的临床意义详解感染性疾病在临床上是最为常见的疾病，可以发生在人体任何部位,是医院各个科室的常客，并且经常伴有各类并发症。

而针对大多数的感染性疾病，配合准确的诊断并在短时间内得到良好的治疗，预后效果一般良好，因此感染相关的诊断和治疗手段是所有临床医生应具备的基本功之一。

但感染性疾病发病特征通常不明显，单靠疾病症状、体征以及影像学不足以满足早期诊断。

感染：病原微生物侵入机体，与宿主免疫系统相互作用所呈现的病理生理变化。

炎症：具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的复杂防御反应。

通俗来说，感染，就是有病原体侵入机体导致生病了。

而炎症，就是我们通常所说的“发炎”，主要表现为红、肿、热、痛及功能障碍。

感染可能引起炎症，医生在在怀疑有感染性炎症存在时，一般会让查感染及炎症指标。

那么，感染及炎症指标一般有哪些，各有什么作用和优缺点呢？一、白细胞血常规中白细胞计数(WBC)及分类比例(DC)对于临床鉴别感染来说是最基本、最常用的指标，升高和降低的幅度也被检验医师和临床医师用作诊断疾病的手段。

血常规由于个体差异，影响指标的因素极多，且患者不同的疾病、甚至是不同的生理状态会引发血常规发生改变，其在感染方面诊断特异性差，容易出现误诊情况。

1、白细胞升高①白细胞升高合并中性粒细胞比例升高，常提示急性细菌性感染,特别是革兰阳性球菌（如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎链球菌等）感染。

少数病毒感染，如流行性乙型脑炎和流行性出血热也可有上述表现。

此外，血液与实体肿瘤、血管炎、成人StiII病及肾上腺皮质激素的使用等多种非感染原因，也可引起白细胞及中性粒细胞升高。

其生理性增高见于新生儿、月经期、妊娠、分娩及情绪变化等。

②白细胞总数升高合并淋巴细胞比例升高常提示急性病毒感染，如传染性单核细胞增多症，若长期持续升高，需注意与血液系统疾病，如白血病等进行鉴别。

③白细胞升高合并嗜酸粒细胞比例升高常提示寄生虫感染，也可见于结核、变态反应、肿瘤及药物等原因。

中性粒细胞碱性磷酸酶（N-ALP NAP）碱性磷酸酶包括一组在PH中性以上能够从很多醇和酚的单磷酸酯释放出碱的同功酶。

一．正常分布：人体血液与造血细胞的碱性磷酸酶活性，主要存在于中性粒细胞系统的成熟阶段中，其他成分如嗜酸、嗜碱、淋巴、单核以及巨核细胞，血小板，浆细胞等均为阴性反应，网状内皮细胞和巨嗜细胞的反应为强阳性。

二．生理变化：1．年龄变化：新生儿ALP极高，随后下降，成人较儿童期减低，老年期（>6）最低。

2．性别差异：无差别，但也有报道女>男。

3．季节变化：夏季为高。

4．应激状态下的变化：紧张、恐惧、休克、激烈运动等。

5．妊娠期的变化：妊娠2~3个月时。

NAP轻度高。

以后逐月趋于显著。

6．与激素的关系：肾上腺皮质激素，雌激素和ACTH都有使NAP活性升高，有人认为ACTH的作用是通过肾上腺皮质而发生的。

三．临床意义：1．重度增高：类白血病反应：NAP活性极度增高与CML鉴别。

感染：细菌感染的NAP改变比较明显，其中，NAP活性高度增高者见于各种急性化脓性感染（如败血症、大叶性肺炎、化脓性脑膜炎等）。

2．中度增高：感染：见于支气管肺炎、肾盂肾炎。

贫血：AA。

非AL性骨髓增生性疾患：PV、骨髓纤维化、CML合并骨髓硬化症、持发性ITP、AL：ALL。

恶性淋巴瘤：何杰金氏淋巴瘤。

3．轻度增高：感染：上呼吸道感染、肺结核等。

网状细胞增高，遗传性低NAP症。

AL：MM、神经母细胞瘤。

贫血：溶血性贫血。

4．降低：贫血：镰形细胞贫血和阵发性睡眠性血红蛋白尿。

AL：CML显著减低感染：病毒性感染、特别是病毒性肺炎。

5．正常或无规律：急粒的NAP活性可减低也可正常。

并发感染时可有中度升高。

当治疗后充分缓解时，有些NAP活性可恢复正常。

单核细胞改变缺乏的规律性，绿色瘤和M6与急粒相似。

网状细胞肉瘤多数病例增高，少数在正常范围内。

淋巴肉瘤可增高，可正常。

MDS可增高、正常和减低。

主要鉴别：1．CML—类白2．PNH—AA 3．ALL—ANLL4．PV—反应性PV 5．细菌升高—病毒（特别是肺炎）四．染色方法：碱性磷酸酶是一种能分解磷酸酯的水解酶，方法不同，原理不同。

酶联免疫试验操作方法酶联免疫试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测样本中特定抗原或抗体的存在与数量。

ELISA方法的原理是将特定的抗原或抗体与检测物质打标记，然后通过可以与标记物结合的特异性抗体反应来检测目标物质的存在与浓度。

下面将介绍ELISA的操作方法。

1. 试剂准备：(1) 底物：将所需底物溶于缓冲液，根据实验需求选择适当的底物，如TMB、ABTS等。

(2) 酶标记抗体：将所需的酶标记抗体充分稀释至适当浓度，通常为1:1000至1:10000。

(3) 试样：将待测样品按照需要进行稀释或处理。

如果检测抗体，则需将样品加入酶标记抗体反应，在室温下孵育。

(4) 洗涤缓冲液：常见的洗涤缓冲液为PBS-T（含有Tween 20）。

准备好PBS-T或其他适当的洗涤液，以用于洗涤步骤。

(5) 制备标准曲线：根据实验需求，选择适当的标准品并制备浓度梯度的标准曲线。

2. 板涂覆：(1) 取出ELISA板，将所需抗原或抗体稀释至适当浓度，加入每个孔中。

每个样品需设置多个平行孔，以进行可靠的实验结果分析。

(2) 封闭非特异性结合位点：将孔板封闭，并将其置于37C恒温箱中孵育1至2小时。

3. 底物-标记物结合：(1) 倾倒每个孔的液态，并在每个孔中分别加入酶标记的抗体。

通过抗体与抗原或抗体结合，在孔中形成免疫复合物。

(2) 将孔板置于恒温箱中，在室温下孵育1至2小时，促使免疫反应的发生。

4. 孔洗涤：(1) 将液体倾倒，然后用洗涤缓冲液充分洗涤每个孔，以去除未结合的抗体。

(2) 每孔洗涤的次数及洗涤时间依实验需求而定，通常为3至5次，每次洗涤持续约30秒。

5. 底物反应：(1) 将稀释好的底物加入每个孔中，底物与酶标记结合物质反应，形成可见的颜色变化。

(2) 在室温下进行底物反应，反应时间依抗体的检测结果而定，通常为15分钟至1小时。

.elisa酶联免疫吸附实验报告一．实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）,生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。

借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。

待测抗体（抗原）的定量与有色产生成正比。

二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。

常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。

由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化1 / 11.作用使颜色加深，无法准确地定量。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin）区作辅基。

酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。

氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。

高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。

用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。

ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）染色及临床意义人体有多种细胞内含有一种叫做碱性磷酸酶的物质。

血细胞内也含有这种物质，但多数不表现出活性，即处于“沉睡”状态，只有中性粒细胞的成熟阶段表现出碱性磷酸酶活性，我们称之为中性粒细胞碱性磷酸酶(简称N—ALP)。

中性粒细胞碱性磷酸酶存在于成熟中性粒细胞的胞浆内，可以通过钙—钴方法使之着色来显示。

然后计算出反应的阳性率和积分，即可表示中性粒细胞碱性磷酸酶活性的高低。

计算方法：显微镜下观察100个成熟中性粒细胞，有阳性反应的细胞数即阳性率；再按下列标准评分，将每个细胞的积分相加，即得出积分：0分——阴性反应。

1分——胞浆1／2以下的区域出现灰黑色到棕黑色沉淀。

2分——胞浆1／2～3／4的区域出现灰黑色至棕黑色沉淀。

3分——胞浆全部区域出现棕黑色或棕黑色沉淀(颗粒状或片块状)，但密度较低，约占3／4的区域。

4分——胞浆全部皆被深黑色团块状沉淀所充满，密度甚高，甚至遮盖胞核。

正常人的中性粒细胞碱性磷酸酶活性为：阳性率平均为20～40％，积分平均为20～60分。

当患有慢性粒细胞白血病时，其活性显着减低，积分常为“0”，缓解后也无明显增高；但慢粒急变后，N—ALP可增高。

因此，中性粒细胞碱性磷酸酶活性的检查，对诊断慢性粒细胞白血病是极为有用的。

但其它一些情况下，也可能出现中性粒细胞碱性磷酸酶活性减低，如急性粒细胞白血病时就可减低，但缓解后增高；病毒感染时可减低，但不如慢粒明显；恶性组织细胞增生症和淋巴瘤||时也会减低，但均不如慢粒那么显着。

至于中性粒细胞碱性磷酸酶活性增高的情况则比较多见，如常见的细菌感染、类白血病反应、甲亢、贫血、特发性血小板减少性紫癜、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症、急性淋巴细胞白血病、阵发性睡眠性血红蛋白尿等。

中性粒细胞碱性磷酸酶的显示方法有偶氮偶联法和钙-钴法两种。

前者的染色原理是血细胞内碱性磷酸酶在pH为9.4～9.6的条件下，将基质液中的α-磷酸萘酚钠水解，产生α-萘酚与重氮盐偶联形成灰黑色沉淀，定位于细胞质内酶活性所在之处。

中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP)简介：碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ，简称ALP 或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。

此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌之细胞膜。

Leagene 中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP)不是采用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，其原理是在pH9.2～9.8的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使AB-BI 磷酸盐水解，释放出磷酸与萘酚，后者与偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中。

该染液专门用于血液或骨髓细胞涂片的中性粒细胞的碱性磷酸酶染色, 碱性磷酸酶活性部位呈蓝色，位于胞桨，结果较金属盐沉淀法可靠。

组成：自备材料：1、 载玻片2、 4%多聚甲醛3、 显微镜操作步骤(仅供参考)：(一)、涂片1、制备新鲜血液或骨髓细胞涂片，NAP 固定液固定，充分水洗。

2、滴加配制好的NAP 孵育液，孵育，水洗。

3、滴加核固红染色液或甲基绿染色液复染。

水洗、晾干、镜检。

编号 名称DE0003 4×2ml DE0003 4×10ml Storage 试剂(A): NAP 固定液 2ml 10ml RT 避光 试剂(B): NAP 孵育液B1: AS-BI 染色液 1ml 5ml -20℃ 避光 B2: FBB 染色液1ml5ml4℃ 避光临用前，B1:B2混合，即为NAP 孵育液，即配即用。

试剂(C): 核固红染色液 2ml 10ml RT 避光 试剂(D): 甲基绿染色液 2ml10ml RT 避光使用说明书1份(二) 贴壁培养细胞1、取6孔板或其他容器培养的细胞，弃液，PBS清洗干净。

碱性磷酸酶‎E L ISA‎方法实验原理：1. 在ELISA‎测定中，碱性磷酸酶‎的色原底物‎是对硝基苯‎磷酸盐(p-nitro‎p heny‎-phosa‎t e，pNPP)。

pNPP在‎碱性磷酸酶‎的作用下生‎成对硝基酚‎(pNP)，其在入＝405 nm处有最‎大吸收。

2. 由于较高浓‎度的无机磷‎可竞争性地‎抑制碱性磷‎酸酶的活性‎，所以用TB‎S体系，不能用含磷‎酸根丰富的‎P BS体系‎，否则会造成‎本底偏高。

3. 由于碱性条‎件下pNP‎的光吸收增‎强，并可使碱性‎磷酸酶失活‎，因而可使用‎氢氧化钠作‎为终止剂。

试剂：ELISA‎溶液体系：1XTBS‎1L体系H2O 定容至10‎00mlTris-HCl 6.06g 50mM 盐酸调PH 7.5 NaCl8.76g 150mM‎包被液：(pH9.6)。

过滤除菌，4℃贮存。

0.1M NaHCO‎3显色液：1. 0.1M glyci‎n e pH 10.4 + 1mM MgCl2‎+ 1mM ZnCl2‎配方：7.51g glyci‎n e + 203 mg MgCl2‎+ 136 mg ZnCl2‎+ 980 ml H2O，用浓NaO‎H溶液调至‎p H10.4，补水定容到‎1L。

2. 1 M dieth‎a nola‎m ine（二乙醇胺）pH 9.8+ 0.5mM MgCl2‎配方：97 ml of dieth‎a nola‎m ine +100 mg MgCl2‎+ 800 ml H2O，用浓HCl‎溶液调至p‎H9.8，补水定容到‎1L。

显色液中p‎N PP终浓‎度为1mg‎/ml。

终止液：配方：3M NaOH。

实验步骤：1. 包被：用包被液稀‎释靶分子，4℃过夜或者3‎7℃1h。

TBS洗3‎次。

2. 封闭：2%M-TBS 37℃1h。

TBS洗3‎次。

3. 结合：将表达菌用‎T B S重悬‎，超声后加入‎到孔中，37℃1h。

0.5%TBST洗‎3次。

简述酶联免疫吸附试验的原理及基本步骤酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析样本中的特定抗原或抗体。

ELISA的原理是利用抗原与抗体的特异性结合来检测和测量样本中的目标物质。

ELISA通常分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等几种类型，但它们的基本原理相似。

一般来说，ELISA的基本步骤包括以下几个方面：1. 涂层：将特异性抗体固定在试验板的表面上，通常是通过将抗体溶液加入试验板孔中，然后在适当条件下进行孵育。

固定在试验板上的抗体将被用于捕获待检测的抗原或抗体。

2. 绑定：将待检测的样本加入试验板中，样本中的抗原或抗体与固定在试验板上的抗体发生特异性结合。

样本中的目标物质与固定在试验板上的抗体形成抗原-抗体复合物。

3. 洗涤：洗涤试验板以去除未结合的样品成分。

这一步骤的目的是去除非特异性结合的物质，以减少背景干扰。

4. 检测：加入辅助抗体(常为酶标记的抗体)，该抗体能够与已结合在试验板上的抗原-抗体复合物发生特异性结合。

这些酶标记的抗体可以是与抗体结合的酶，如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)。

然后，添加适当的底物使酶产生可检测的信号。

5. 信号检测：通过所使用酶催化的底物的反应产生的颜色或荧光等信号，可以对样品中目标物质的含量进行定量测量。

这一步骤可以使用吸光度计或荧光分析仪进行信号的测量和记录。

ELISA具有高灵敏度和特异性，广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域，用于检测病原体、抗体、激素、药物等物质的存在和浓度。

它不仅可以用于疾病的诊断和监测，还可以用于药物筛选、生物分子的定量分析和研究等。

酶联免疫吸附测定法（ELISA）标准操作规程一、适用范围适用于实验室从事ELISA实验的实验技术人员和研究生。

二、操作规程1、标准品的配制：使用前在标准品中加入适量的去离子水，配成10ng/ml的母液，设标准品八管，第一管加入标本稀释液900ul，第二管至第八管加入标本稀释液500ul，在第一管中加入10ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。

如此反复作对比稀释，从第七管中吸出500ul,弃出，第八管为空白对照。

2、检测程序：1）加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应物充分混匀后置37℃120分钟。

2）洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。

3）每孔中加入第一抗工作液100ul，将反应板充分混匀后置37℃60分钟。

4）洗板，同前。

5）每孔加酶标抗体工作液100ul。

将反应板置37℃30分钟。

6）洗板，同前。

7）每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。

8）每孔加入100ul终止液混匀。

9）30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

3、结构计算与判断：1）所有OD值都应扣除空白后在进行计算。

2）以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3）根据样品OD值在该曲线上查出相应的样品含量。

4、注意事项：1) 以上标准孔及样品空均建议做复孔，每次测定时均应做标准曲线。

2) 洗涤过程很关键，洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误升高。

3) 板条开封后剩余板条要密封好，保持剩余板条的干燥。

4) 本试剂盒应在4℃保存，仅用于科研，不用于临床。

5) 以上标准曲线的制作和加样流程仅供参考，具体检测时请按试剂盒说明书进行。

中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色实验1. 实验原理细胞内的碱性磷酸酶在碱性环境中，可水解β-甘油磷酸钠，释放的磷酸根离子与钙离子作用而生成磷酸钙沉淀，与硝酸钴作用后生成磷酸钻，最后与硫化铵作用生成黑色稳定的硫化钴颗粒，定位于胞浆中。

2. 标本采集2.1 病人准备：了解病人是否对局麻药有过敏史，凝血因子严重缺陷引起的出血性疾病，穿刺部位有炎症或有畸形，晚期妊娠的妇女作骨穿时要慎重。

2.2 标本种类：新鲜抽取的骨髓穿刺液。

2.3 标本采集要求：2.3.1 高压消毒的穿刺针，一次性无菌手套和抽取骨髓液的无菌注射器。

2.3.2 临床上首选穿刺部位为髂后上棘，翻身困难，需多部位穿刺患者可选择髂前上棘为穿刺部位。

小于3岁的小儿还可选择胫骨头内侧为穿刺部位。

3. 标本储存：滴加95％乙醇盖满血膜10分钟，水洗待干，室温避光保存。

4. 标本运输：室温运输。

5. 标本拒收的标准：溶血，稀释标本不能作测定。

6. 试剂：6.1孵育液；由10%巴比妥钠4ml，25g/LMgSO4 4ml，3.2%β-甘油磷酸钠4ml，20g／LCaCl26ml，再加蒸馏水22ml配成。

Mg2+起酶激活作用，巴比妥钠提供碱性环境，调PH为9.4。

6.2 20g/L硝酸钴，可重复使用或长期保存。

6.3硫化铵溶液，由硫化铵1—2ml加水到100ml配成。

6.4 1%甲绿作复染用，使红细胞和粒细胞核显绿色，有利于结果观察。

7. 操作步骤：7.1新鲜、干燥涂片用95％甲醇固定10分钟。

7.2水洗后，将涂片浸于孵育液中，37℃水浴2小时。

7.3 20g/L硝酸钴溶液作用5分钟。

7.4流水充分洗净多余的硝酸钴后，加入硫化铵溶液2分钟。

7.5流水洗去硫化铵，1%甲绿溶液复染20分钟。

7.6流水冲洗，待干燥，油镜观察。

8. 结果判断：(一)：胞浆无灰黑色成分。

(十)：胞浆呈浅灰色或部分胞浆有灰色沉淀。

(++)：胞浆呈均匀棕色或棕黑色沉淀，但着色较淡。

酶联免疫吸附(ELISA)实验具体步骤及详细说明酶联免疫吸附(ELISA )可以:(1)免疫酶染色各种细胞内成份的定位o(2)研究抗酶抗体的合成。

(3 )显现微量的免疫沉淀反应。

(4 )定量检测体液中抗原或抗体成份。

本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体Z经洗涤后加入含有抗原之待测样品,如待检样品中有相应抗原存在,即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合Z经保温孵育洗涤后,即可加入酶标记特异性抗体,再经孵育洗涤后,加底物显色进行测定Z底物降解的量即为欲测抗原的量。

这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位,因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用Z而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。

因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。

我们用在霍乱肠毒素的测定。

HbSAg及HbS 的测定。

具体步骤—、包被抗体：用包被缓冲液稀释特异性抗体球蛋白至最适浓度(1 ~ 10 ug /ml),每凹孔加0.3 ml , 4°C过夜Z或37。

C水浴3小时,贮存冰箱。

二、洗涤：移去包被液Z凹孔用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20 )洗3次，每次5分钟。

三、每凹孑I J加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的含抗原的被检标本，37°C作用1~ 2小时。

四、洗涤：移去包被液Z凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20 ）洗3次，每次5分钟。

五、加入0.2 ml用稀释缓冲液稀释的酶标记特异性抗体溶液,37。

C作用1 ~ 2 小时或由预试实验确定作用时间。

六、洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液（含0.05%吐温-20 ）洗3次，每次5分钟。

七、加入0.2ml底物溶液于每个凹孔（OPD或OT）,室温作用30分钟（另作一空白对照，0.4 ml底物加0.1 ml终止剂）O八、加终止剂：每凹孔加2M H2SO4或2 M柠檬酸0.05 ml o九观察记录结果：目测或用酶标比色计测定（OPD用492nm ）OD值。

人中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)水平。

用纯化的人中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)，再与HRP标记的中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)浓度。

试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

酶联免疫试验原理酶联免疫试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种常用的实验室技术，用于检测和测量蛋白质、抗体、肽或小分子化合物。

它是一种特异性高、敏感度好的定量或定性检测方法，具有应用广泛、结果准确可靠的优势。

酶联免疫试验的原理基于抗原与特异性抗体的特异性结合作用。

通常，免疫试验中常用的抗原是被测物，抗体则是与抗原特异结合的免疫球蛋白。

ELISA分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等不同类型，其原理略有差异。

一般而言，ELISA的关键步骤包括以下几部分：1.固相吸附：将抗原或抗体固定在实验室常用的微孔板上，如96孔板，通过物理吸附或化学偶联的方法，使其与微孔板上的表面结合。

2.试样处理：待测物质需要进行预处理，如适当的稀释、纯化或者反应梯度等。

这一步骤通常是为了提高试验的灵敏度和准确性。

3.特异性结合：将预处理好的试样加入孔中，与固相吸附的抗原结合，同时加入特异性结合的抗体，形成抗原-抗体复合物。

这个抗原-抗体复合物具有高度的特异性，可以仅与特定的抗原结合，并与其他非特异性物质的结合有所区别。

4.清洗：为了去除非特异性结合的物质，需要进行反应后的洗涤步骤。

一般采用盐溶液、缓冲液或洗涤缓冲液进行洗涤，以去除没有结合的物质，保留住特异性抗原-抗体复合物。

5.信号产生：加入检测物质，以产生与特异性抗原-抗体复合物结合的信号。

一般常用的方法是将辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）结合在第二抗体上，使其与特异性抗原-抗体复合物结合。

这样，酶作用于底物时将可产生荧光、发光或颜色的变化。

6.信号测量：通过测量底物转化产物的光学性质，如吸光度或荧光强度，可以得到与原始抗原或抗体浓度相关的信号。

根据吸光度或荧光强度，可以使用分光光度计或光学显微镜等仪器设备进行检测。

总结来说，酶联免疫试验的原理是通过抗原与特异性抗体结合，形成特异性抗原-抗体复合物，通过特定的酶作用，产生可测量的信号，从而检测和测量所需的物质或分子。

人中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中NAP含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中NAP水平。

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入NAP抗原、生物素化的抗人NAP抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。

TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的NAP呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

试剂盒组成及试剂配制1.酶联板：一块（96孔）2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为2,000pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释1,000 pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml，15.6pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0pg/ml，临用前15分钟内配制。

如配制1,000pg/ml标准品：取0.5ml2,000pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3.样品稀释液：1×20ml/瓶。

4.检测稀释液A：1×10ml/瓶。

5.检测稀释液B：1×10ml/瓶。

6.检测溶液A：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。

如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7.检测溶液B：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1:100稀释。

酶联免疫吸附测定法elisa酶联免疫吸附测定法（ELISA）的原理酶联免疫吸附测定法（ELISA）是一种广泛用于生物医学研究和诊断的免疫分析技术。

ELISA 的原理基于抗原抗体特异性结合的原理，通过标记酶的抗体来检测目标抗原或抗体。

ELISA 的种类根据检测方法的不同，ELISA 可分为以下几种类型：直接 ELISA：将待测样品直接加入固定在微孔板上的抗原或抗体上，然后用标记酶的抗体检测。

夹心 ELISA：微孔板固定一层捕获抗体，待测样品通过捕获抗体与检测抗体结合，然后用标记酶的抗体检测。

竞争性 ELISA：待测样品与标记抗原竞争结合固定在微孔板上的抗体，标记抗原和待测样品结合量成反比。

ELISA 的步骤ELISA 的主要步骤包括：抗原或抗体固定：将待测抗原或抗体固定在微孔板上。

样品孵育：将待测样品加入微孔板，进行孵育。

洗涤：去除未结合的样品。

添加标记抗体：加入标记酶的抗体，再次孵育。

洗涤：去除未结合的标记抗体。

底物反应：加入底物，酶促反应产生有色产物。

终止反应：加入终止液，停止酶促反应。

测量吸光度：测量有色产物的吸光度，吸光度与样品中抗原或抗体浓度成正比。

应用ELISA 具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点，广泛应用于以下领域：诊断：检测传染性疾病（如艾滋病毒、乙肝）、自身免疫疾病（如类风湿性关节炎）、癌症标志物等。

研究：研究抗原抗体相互作用、免疫应答、药物开发等。

食品安全：检测食品中的残留农药、抗生素等。

环境检测：检测水体或土壤中的污染物。

注意事项进行 ELISA 时需要注意以下事项：抗体的特异性和亲和力：使用的抗体必须具有高特异性和亲和力，以确保准确的检测结果。

样品准备：样品应经过适当的处理，去除干扰物质，以获得准确的结果。

优化条件：ELISA 反应条件（如孵育时间、温度）应经过优化，以获得最佳检测灵敏度和特异性。

背景信号：应使用阴性对照进行检测，以去除背景信号的影响。

质量控制：应使用已知浓度的标准品进行质量控制，以确保检测结果的准确性和可重复性。

中性粒细胞碱性磷酸酶中性粒细胞碱性磷酸酶（Neutrophil alkaline phosphatase，NAP）是一种酶，存在于中性粒细胞的细胞膜和细胞浆中。

它是一种重要的生物标志物，具有许多生理和病理过程中的关键作用。

本文将介绍中性粒细胞碱性磷酸酶的生物学功能、检测方法以及其在疾病诊断和预后评估中的临床应用。

中性粒细胞碱性磷酸酶是一种磷酸酶，具有催化磷酸酯水解的活性。

它由碱性磷酸酶家族的成员之一组成，与骨骼生长和骨重建等过程有关。

这种酶在中性粒细胞中的活性与细胞的发育状态和功能密切相关。

中性粒细胞碱性磷酸酶水平的变化可以反映细胞功能的改变，对于疾病的诊断和预后评估具有重要意义。

中性粒细胞碱性磷酸酶的检测主要通过染色法进行。

染色法将中性粒细胞与碱性磷酸酶底物结合，在底物的作用下产生有色产物。

根据产生的有色产物的数量，可以定量测定中性粒细胞碱性磷酸酶的活性。

目前，常用的染色方法有道格拉斯-多布因染色法和Kervran 染色法。

这些方法具有灵敏度高、重复性好的优点，已成为临床上常用的中性粒细胞碱性磷酸酶测定方法。

中性粒细胞碱性磷酸酶在疾病的诊断和预后评估中具有重要作用。

研究表明，中性粒细胞碱性磷酸酶水平的改变与多种疾病的发生和发展密切相关。

例如，在急性白血病和某些骨髓增生异常综合征中，中性粒细胞碱性磷酸酶活性明显降低；而在慢性髓样白血病等疾病中，中性粒细胞碱性磷酸酶活性明显升高。

因此，通过检测中性粒细胞碱性磷酸酶水平的变化，可以对疾病进行早期诊断和预后评估。

此外，中性粒细胞碱性磷酸酶还在炎症和感染过程中发挥重要作用。

炎症和感染会导致中性粒细胞复制增加和激活，从而增加中性粒细胞碱性磷酸酶的合成和释放。

因此，通过监测中性粒细胞碱性磷酸酶水平，可以评估炎症和感染的活动程度，指导临床治疗。

综上所述，中性粒细胞碱性磷酸酶是中性粒细胞中的一种重要酶类，对细胞功能的调节具有关键作用。

通过检测中性粒细胞碱性磷酸酶水平的改变，可以实现疾病的早期诊断和预后评估。