麻疹减毒活疫苗(人二倍体细胞)生产工艺的建立(一)

麻疹减毒活疫苗（人二倍体细胞）生产工艺的建立(一)【摘要】目的研制麻疹减毒活疫苗（人二倍体细胞）。

方法用麻疹病毒长-47株接种人二倍体细胞，经培养，收获病毒液并加适量稳定剂后冻干制成疫苗。

疫苗按2005年版《中国药典》三部进行检定。

结果麻疹减毒活疫苗（人二倍体细胞）各项技术指标均符合2005年版《中国药典》三部的要求。

结论人二倍体细胞为基质可以制备麻疹减毒活疫苗，疫苗质量稳定，收获率较高。

【关键词】麻疹减毒活疫苗；人二倍体细胞；收获率麻疹是由麻疹病毒引起的主要罹及婴幼儿急性传染病。

在我国麻疹减毒活疫苗应用已有近40年的历史，制备疫苗均以鸡胚细胞为基质，作为异源细胞，具有携带禽病毒的可能，而人二倍体细胞为人源细胞〔1〕，在国外早已用来生产麻疹减毒活疫苗。

人二倍体细胞（2BS 株）现已广泛应用于疫苗生产，如甲肝减毒活疫苗、水痘减毒活疫苗等，已证明其具有安全性。

我们用人二倍体细胞为基质制备出符合2005年版《中国药典》三部要求的麻疹减毒活疫苗，本文就此做如下报告。

1材料1.1细胞生产用细胞为人二倍体细胞2BS株，用于生产的细胞世代限定在43代以内。

1.2毒种鸡胚细胞为培养基质制备的麻疹减毒活疫苗毒种长47株27代适应于人二倍体细胞，33℃和35℃培养，收获制成，经检定后用于生产，并已有多个代次毒种制备疫苗，证明此毒种具有良好的传代稳定性。

1.3培养液及维持液MEM为基础液，加入适当比例的灭能小牛血清，碳酸氢钠调pH值。

1.4疫苗液199液，pH值为7.4～7.5。

2方法2.1单层法制备麻疹减毒活疫苗（人二倍体细胞）单层人二倍体细胞2BS株按1：2～1：4传代，接种2L克氏瓶，加入细胞培养液，180ml/瓶，置37℃培养。

当人二倍体细胞长成单层时，换成细胞维持液，200ml/瓶，再加入毒种，毒种的感染剂量（MOI）为1：100。

将感染病毒的细胞瓶置35℃培养，此方法称为单层法。

当细胞病变达50%以上时，用400mlEarle’s液冲洗细胞面，去除小牛血清，加入疫苗液，200～500ml/瓶，置35℃培养。

麻腮风联合减毒活疫苗Ma Sai Feng Lianhe Jiandu HuoyimiaoMeasles，Mumps and Rubella Combined Vaccine, Live本品系用麻疹病毒减毒株和腮腺炎病毒减毒株分别接种原代鸡胚细胞、风疹病毒减毒株接种人二倍体细胞,经培养、收获病毒液，按比例混合配制,加入适宜稳定剂冻干后制成。

用于预防麻疹、腮腺炎和风疹。

1 基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。

2 制造2.1单价原液制备2.1.1 麻疹病毒原液制备应符合“麻疹减毒活疫苗”中2.1-2.3项的规定。

2.1.2 腮腺炎病毒原液制备应符合“腮腺炎减毒活疫苗”中2.1-2.3项的规定。

2.1.3 风疹病毒原液制备应符合“风疹减毒活疫苗（人二倍体细胞）”中2.1-2.3项的规定。

2.2 单价原液检定2.2.1麻疹病毒原液检定除按“麻疹减毒活疫苗”中3.2项进行外，还应按本标准3.1.1项进行检定。

2.2.2腮腺炎病毒原液检定除按“腮腺炎减毒活疫苗”中3.2项进行外，还应按本标准3.1.2项进行检定。

2.2.3 风疹病毒原液检定除按“风疹减毒活疫苗”中3.2项进行外，还应按本标准3.1.3项进行检定。

2.4 半成品2.4.1配制将检定合格的麻疹、腮腺炎和风疹单价原液根据病毒滴度按一定比例进行配制，其中麻疹和风疹病毒滴度比例应为1：1，腮腺炎病毒滴度至少是麻疹或风疹病毒滴度的5倍。

加入适宜的稳定剂后即为半成品。

2.4.2 半成品检定按3.2项进行。

2.5 成品2.5.1 分批应符合“生物制品分批规程”规定。

2.5.2 分装及冻干应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。

分装过程中的半成品疫苗应于2-8℃放置。

2.5.3 规格复溶后每瓶0.5ml。

每1次人用剂量为0.5ml，含麻疹和风疹活病毒均应不低于3.0Lg CCID50，含腮腺炎活病毒应不低于3.7Lg CCID50。

麻疹风疹联合减毒活疫苗生产过程中的无菌操作与无菌灌装摘要】目的:探讨麻疹风疹联合减毒活疫苗生产过程中的无菌操作与无菌灌装。

方法:选取2016年2月-2017年9月制作的300支麻疹风疹疫苗，按照制作疫苗的过程分为两组，对照组采用无菌操作、灌装进行麻疹风疹疫苗的制作，研究组采用麻疹风疹联合减毒活疫苗进行制作。

对两组疫苗成功率进行统计。

结果: 研究组疫苗的成功率显著高于对照组（P<0.05）。

结论: 对麻疹风疹联合减毒活疫苗，在生产过程中保证无菌操作与无菌灌装操作，成功率较高，值得在临床中推广，疫苗的制作关系到人的生命安危与健康，应当保证产品的使用安全。

【关键词】麻疹风疹；减毒活疫苗；结肠癌；无菌操作；无菌灌装【中图分类号】R186 【文献标识码】A 【文章编号】1439-3768-（2019）-1 随着医疗技术的迅速发展，我国医学不断进行改革，发展成功具有一定成效，无菌操作技术的发展属于医疗发展的独立的领域[1]。

随着经济迅速发展，人们逐渐追求更高的生活质量，对医疗药物制剂的标准更高，生产中保证无菌制剂更为重要。

在目前医学研究中，利用无菌操作技术为人们制作医疗制剂，更为安全、可靠、高效[2]。

应当加强无菌制剂的研究，提高药物的品质，提高药物的安全性。

我院选取制作的300支麻疹风疹疫苗，随机分组后对采用不同的制作方法，探究麻疹风疹联合减毒活疫苗生产过程中的无菌操作与无菌灌装过程，现报道如下。

1.资料与方法1.1一般资料我院选取2016年2月-2017年9月制作的300支麻疹风疹疫苗，两组疫苗的一般资料有可比性（P>0.05）。

本研究通过医院伦理委员会批准。

1.2方法1.2.1 进行麻疹病毒原液制备，应符合麻疹减毒活疫苗中的相关规定。

进行风疹病毒原液制备，应符合风疹减毒活疫苗(人二倍体细胞)中的规定。

进行单价原液检定，麻疹病毒原液检定。

1.2.2 进行半成品配制，将通过检定且合格的麻疹风疹病毒单价原液按同一病毒滴度进行适当稀释后，进行比例混合，加入适宜的稳定剂配制，即为半成品。

麻疹减毒活疫苗Mazhen Jiandu HuoyimiaoMeasles Vaccine, Live本品系用麻疹病毒减毒株接种原代鸡胚细胞，经培养、收获病毒液，加入适宜稳定剂后冻干制成,用于预防麻疹。

1 基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水、动物等应符合“凡例”有关规定。

2 制造2.1 生产用细胞毒种制备及疫苗生产用细胞为原代鸡胚细胞。

2.1.1 细胞管理及检定应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。

2.1.2 细胞制备选用9-11日龄鸡胚，经胰蛋白酶消化、分散细胞，用适宜的培养液进行培养。

来源于同一批鸡胚、于同一容器内消化制备的鸡胚细胞为1个细胞消化批。

源自同一批鸡胚、于同一天制备的多个细胞消化批为1个细胞批2.2 毒种2.2.1 名称及来源生产用毒种为麻疹病毒沪-191株、长-47株或经批准的其他麻疹病毒减毒株。

2.2.2 种子批的建立应符合“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”规定。

沪-191主种子批应不超过第28代，工作种子批应不超过第32代；长-47主种子批应不超过第34代，工作种子批应不超过第40代。

采用沪-191生产的疫苗代次应不超过第33代，采用长-47生产的疫苗代次应不超过第41代。

2.2.3 种子批检定主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1-2.2.3.4项检定。

2.2.3.1 鉴别试验将稀释至500-2000 CCID50/ml的病毒液与适当稀释的抗麻疹病毒免疫血清等量混合后，置37℃水浴60分钟，接种FL细胞或Vero细胞，在适宜的温度下培养7-8天判定结果。

麻疹病毒应被完全中和（无细胞病变）；同时设血清和细胞对照，均应为阴性；病毒对照的滴度应不低于500 CCID50/ml。

2.2.3.2 病毒滴定毒种作10倍系列稀释，每稀释度病毒液接种FL细胞或Vero细胞，置适宜温度下培养7-8天判定结果。

病毒滴度应不低于4.5 LgCCID50/ml。

疫苗生产工艺及其工艺要点疫苗是预防疾病或增强人体免疫力的一种生物制品。

疫苗的生产工艺是指将病原体或疫苗候选材料经过一系列的处理和加工过程，制成安全、有效的疫苗产品的过程。

下面将详细介绍疫苗生产工艺及其要点。

疫苗的生产工艺主要包括以下几个步骤：1. 病原体培养：疫苗的生产通常需要从源头获取病原体。

病原体可以是病毒、细菌、真菌等微生物。

病原体在合适的培养基中进行培养，迅速扩增，以达到大规模生产的要求。

2. 病原体净化：经过培养的病原体需要经过严格的净化过程，以去除杂质，如细胞碎片、蛋白质等。

通常采用离心、超滤、柱层析等技术进行病原体的净化。

3. 抗原制备：抗原是疫苗的关键成分，可以产生免疫反应。

抗原制备的方法多种多样，可以通过化学合成、基因工程等技术获得。

在这一步骤中，抗原需要经过纯化和活化等处理，以获得高纯度和活性的抗原。

4. 疫苗制备：将净化后的病原体和抗原进行混合，加入适当的稳定剂和辅助剂，制成疫苗。

在这一步骤中，需要对疫苗进行调配和加工，以确保疫苗的有效性和稳定性。

5. 疫苗灌装：将制备好的疫苗进行灌装，通常采用无菌填充技术，以确保疫苗在灌装过程中不受到污染。

以上是疫苗生产的主要工艺步骤，下面将介绍一些疫苗生产过程中的要点：1. 严格的质量控制：疫苗生产需要高度重视质量控制，确保疫苗的安全性、有效性和稳定性。

对原材料、中间产物和最终产品都需要进行严格的监测和检验。

2. 无菌操作：疫苗生产需要在无菌条件下进行，以防止疫苗产品被细菌或其他污染物污染。

所有设备和容器必须进行灭菌处理，并采取适当的无菌操作措施。

3. 装备和设施的要求：疫苗生产需要使用符合GMP（Good Manufacturing Practice）的装备和设施，确保生产环境卫生和生产工艺的可控性。

4. 稳定剂和辅助剂的选择：稳定剂和辅助剂在疫苗生产中起到重要的作用，可以提高疫苗的稳定性和免疫原性。

选择合适的稳定剂和辅助剂对于生产高质量的疫苗至关重要。

麻腮风联合减毒活疫苗Measles，Mumps and Rubella Combined Vaccine, Live本品系用麻疹病毒减毒株和腮腺炎病毒减毒株分别接种鸡胚细胞、风疹病毒减毒株接种人二倍体细胞,经培养、收获病毒液，按比例混合配制,加适宜稳定剂冻干后制成。

用于预防麻疹、腮腺炎和风疹。

1 基本要求生产、检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”规定。

2 制造2.1 生产用细胞2.1.1 麻疹疫苗生产用细胞生产用细胞为原代鸡胚细胞，并应符合“麻疹减毒活疫苗”中2.1项的规定。

2.1.2 腮腺炎疫苗生产用细胞生产用细胞为原代鸡胚细胞，并应符合“腮腺炎减毒活疫苗”中2.1项的规定。

2.1.3 风疹疫苗生产用细胞生产用细胞为人二倍体细胞2BS株、MRC-5株或经批准的其他人二倍体细胞株，并应符合“风疹减毒活疫苗（人二倍体细胞）”中2.1项的规定。

2.2 毒种2.2.1 麻疹疫苗毒种生产用毒种为麻疹病毒沪-191株或经批准的其他麻疹病毒减毒株。

应符合“麻疹减毒活疫苗”中2.2项的规定。

2.2.2 腮腺炎疫苗毒种株或经批准的其他腮腺炎病毒减毒株。

应符合“腮腺生产用毒种为腮腺炎病毒S79炎减毒活疫苗”中2.2项的规定。

2.2.3 风疹疫苗毒种生产用毒种为风疹病毒BRD II减毒株或经批准的其他适应人二倍体细胞的风疹病毒减毒株。

应符合“风疹减毒活疫苗（人二倍体细胞）”中2.2项的规定。

2.3 单价原液2.3.1 麻疹病毒原液制备按“麻疹减毒活疫苗”中2.3项进行。

2.3.2麻疹病毒原液检定按3.1.1项进行。

2.3.3腮腺炎病毒原液制备按“腮腺炎减毒活疫苗”中2.3项进行。

2.3.4腮腺炎病毒原液检定按3.1.2项进行。

2.3.5 风疹病毒原液制备按“风疹减毒活疫苗（人二倍体细胞）”中2.3项的规定。

2.3.6 风疹病毒原液检定按3.1.3项进行。

2.4 半成品 2.4.1配制各项检定合格的麻疹、腮腺炎和风疹单价原液根据病毒滴度按一定比例进行配制， 其中麻疹和风疹病毒滴度比例应为按1：1， 腮腺炎病毒滴度至少是麻疹或风疹病毒滴度的5倍。

(10)申请公布号 CN 102406933 A(43)申请公布日 2012.04.11C N 102406933 A*CN102406933A*(21)申请号 201110382900.3(22)申请日 2011.11.25A61K 39/165(2006.01)A61P 31/14(2006.01)(71)申请人成都康华生物制品有限公司地址610100 四川省成都市国家经济技术开发区北京路182号(72)发明人赵志鹏 侯文礼(74)专利代理机构四川省成都市天策商标专利事务所 51213代理人刘兴亮(54)发明名称一种麻疹减毒活疫苗的制备方法(57)摘要本发明涉及疫苗领域，尤其是一种麻疹减毒活疫苗的制备方法，包括以下步骤：微载体生物反应器培养；维持液培养；收获和纯化；配苗，冻干。

本发明借助生物反应器的高密度培养手段首先保证了病毒滴度比常规工艺高的前提下，进而采取分子筛层析方法或中空纤维过滤方法纯化，去除了绝大多数的杂质成分，因而更加有效的避免了疫苗接种的副反应的发生；此外，本发明借助生物反应器培养病毒，培养条件稳定，易于实现大规模化生产，也提高了疫苗单批次产量，保证了产品的质量均一和稳定。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 3 页1.一种麻疹减毒活疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：微载体生物反应器培养：将鸡胚细胞和麻疹病毒毒株混合后接种至微载体生物反应器中，在温度为33℃，pH为7.2～7.6条件下培养混合物，每天更换细胞生长液，培养至细胞浓度达到106个/ml以上；步骤二：维持液培养：每天观察细胞，当鸡胚细胞开始出现特异性病变时，多次洗涤培养物，并更换无血清的MEM维持液培养病毒；步骤三：收获和纯化：每天收获病毒培养物，直至细胞脱落比例达到50％以下，合并收获物，并进行纯化和添加糖蛋白保护剂；步骤四：配苗，冻干。

专利名称：麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗及制备工艺
专利类型：发明专利
发明人：郑晓丽,王玮,姜威,禇东琳,闫磊,王拥军,邹勇,沈宏杰,张宇,张勇,双慧
申请号：CN201110322559.2
申请日：20111021
公开号：CN102343087A
公开日：
20120208
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开麻疹长-47株制备二倍体细胞减毒活疫苗及制备工艺，用二倍体细胞株制备麻疹减毒活疫苗，病毒培养容器为细胞工厂，可连续三次收获病毒液，并以浓缩液形式保存。

并通过了猴体神经毒力试验及安全性试验。

此技术属于对麻疹减毒活疫苗生产的重大改革，对麻疹减毒活疫苗的生产质量有着质的飞跃。

解决用鸡胚（CEC）生产存在外源因子污染和一小部分人存在过敏反应的可能及解决了生产效率和质量不高的问题。

申请人：长春祈健生物制品有限公司
地址：130012 吉林省长春市火炬路1号
国籍：CN
代理机构：吉林长春新纪元专利代理有限责任公司
代理人：陈宏伟
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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710585496.7(22)申请日 2017.07.18(71)申请人 北京北生研生物制品有限公司地址 100176 北京市北京经济技术开发区西环南路18号C座一层101室(72)发明人 付永其　宋艳梅　杨云凯　高静　张颖欣　刘辉　孙雅　申亚楠　律苗　(74)专利代理机构 北京三友知识产权代理有限公司 11127代理人 韩蕾　姚亮(51)Int.Cl.C12N 7/00(2006.01)C12N 7/02(2006.01)A61K 39/165(2006.01)A61K 39/20(2006.01)A61K 39/295(2006.01)A61P 31/14(2006.01)(54)发明名称细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂(57)摘要本发明提供一种细胞工厂制备麻疹病毒原液及麻疹系列减毒活疫苗制剂。

本发明的麻疹病毒原液制备方法为：选用SPF鸡胚细胞，加入细胞培养液制备成细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入到细胞工厂中；将麻疹病毒的工作种子与细胞悬浮液按照(0.005-0.05)：1的比例接种于细胞工厂中，于33±1℃的温度下静置培养3-4天，倾去原细胞培养液，换以新鲜的细胞生长液继续培养；当细胞病变时，逐步收获单次麻疹病毒液。

本发明技术方案实现在同等生产规模下，减少细胞消化批数，并获得高滴度的麻疹病毒液，有效提高麻疹系列疫苗产品质量的均一性，扩大制品的产能。

权利要求书2页 说明书6页 附图1页CN 107418936 A 2017.12.01C N 107418936A1.一种利用细胞工厂制备麻疹病毒原液的方法，其包括以下步骤：选用SPF鸡胚细胞，加入细胞培养液制备成细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入到细胞工厂中；将麻疹病毒的工作种子与细胞悬浮液按照(0.005-0.05)：1的比例接种于细胞工厂中，于33±1℃的温度下静置培养3-4天，倾去原细胞培养液，换以新鲜的细胞培养液继续培养；当细胞出现5％-10％的病变时，倾去细胞培养液，用不少于原细胞培养液量的洗液洗涤细胞表面，并换以病毒维持液继续培养；当细胞出现50％-75％的病变时，收获单次麻疹病毒液。

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减毒活疫苗原液生产厂房的工艺设计张伟【摘要】以某公司减毒活疫苗原液生产厂房为例,从生产工艺、工艺布置和工艺设计特点等方面进行了工艺设计分析.【期刊名称】《机电信息》【年(卷),期】2014(000)017【总页数】5页(P39-43)【关键词】减毒活疫苗;原液;工艺设计【作者】张伟【作者单位】中国航空规划建设发展有限公司,北京100120【正文语种】中文0 引言麻疹是严重危害儿童生命健康的病毒性传染病，临床主要表现为发热、呼吸道卡他及皮疹，其发病率及病死率均居儿童传染病首位。

流行性腮腺炎是一种以侵犯儿童为主也常感染青年的急性全身性传染病，以发热、腮腺的非化脓性肿胀、疼痛并累及其他腺体及脏器为特征。

风疹是一种急性呼吸道传染病，人人易感，常见于儿童，其症状与轻型麻疹、猩红热相似。

水痘是由水痘带状疱疹病毒引起的急性传染病，其典型特征为瘙痒性水疱疹，并伴有轻微发热。

20世纪60年代麻疹减毒活疫苗研制成功，随后腮腺炎、风疹及水痘减毒活疫苗也相继研制成功。

疫苗的使用使这几种疾病的发病率大幅度下降，疾病的流行得到控制。

在此基础上，又很快成功开发了麻腮风三联疫苗。

现在，麻腮风水痘四联疫苗也已研制成功。

随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们对高质量联合疫苗要求的呼声越来越高，可以“一针见效”的联合疫苗将成为今后疾病预防的主导产品。

医药洁净厂房是疫苗生产的硬件基础，在GMP认证检查中至关重要。

只有设计出科学合理的厂房，才能保证药品的质量。

工艺专业是厂房设计的主导专业，在整个厂房设计中尤为重要。

本文以某公司麻疹、腮腺炎、风疹及水痘疫苗原液生产厂房为例，对减毒活疫苗原液生产厂房的工艺设计进行分析。

1 生产工艺医药洁净厂房设计是否合理，决定于其工艺布局是否合理。

为了更科学合理地进行工艺布局，首先应该熟知麻疹、腮腺炎、风疹及水痘疫苗原液的生产工艺流程。

1.1 麻疹疫苗原液的生产工艺流程选用适龄SPF鸡胚，经胰蛋白酶消化，分散细胞制备成细胞悬液。