第4讲核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术(DNA/DNAorDNA/RNA)
核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链探针(序列已知，单链)
待测核苷酸序列(单链)
主要内容第一节分子杂交技术的理论基础第二节核酸分子杂交的方法
第三节核酸杂交的探针
第一节分子杂交技术的理论基础
核酸分子杂交技术：1968年华盛顿卡内基学院(CarnegieIntituteofWahington)的RoyBritten及其同事发明的
关键步骤：变性—杂交(复性)--检测信号—结论
变性
复性
DNA-DNA杂交双链分子
信号的采集与处理
结论
一、DNA变性与复性(一)DNA变性1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的
氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性 2、变性的方法：1)热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。2)酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。3)化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂
3、核酸溶液变性后的理化性质变化：
粘度降低密度增加紫外吸收值增加(利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程)
4、DNA变性曲线AT区先解链，GC区后解链，阶梯式曲线，当达到一定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开的
变性DNA/总DNA
Tm值：50%DNA分子发生变性的温度(即熔解曲线中点对应的温度),这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度(meltingtemperature,Tm)Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度
5、GC含量与Tm值(meltingtemperature)之间的关系(G+C)%=(Tm-69.3)某2.44
Tm=(G+C)%某0.41+69.3Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：pH值、离子强度和DNA的碱基比例DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在1mol/lNaCl溶液中较稳定
文件编号：TS/ZY –07–04
营口天盛重工有限责任公司
作业文件
版本号：A/0
棒材生产线岗位技术操作规程
编制
审核
批准
2012-4-1 发布
2012-5-1实施
营口天盛重工装备有限公司轧钢厂 TS/ZY―07―04 A/0
8 1 前 言
本规程编写格式符合GB/T1.1-2000《标准化工作导则 第1部分：标准的结构与编写规则》、GB/T1.2-2002《标准化工作导则 第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法》的规定。
本规程规定了营口天盛重工装备有限公司棒材生产线各岗位责任与权限、主要工艺参数和控制要点、主要设备性能和操作程序、事故处理、安全要点及有关注意事项等内容。
本规程由营口天盛重工装备有限公司轧钢厂提出。
本规程起草单位：营口天盛重工装备有限公司轧钢项目部。
本规程适用于营口天盛重工装备有限公司棒材生产线各岗位。
规程制订：张振华
规程审核：赵平仓
规程批准：高洪川
本规程首次发布日期：2012年4月1日。
TS/ZY―07―04 A/0
8 2 目 录
前言·„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„.2
目录·„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„.3
1总论 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„. 6
2加热炉岗位技术操作规程„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 7
各分部（分项）工程、各工种及其它
安全技术交底记录
GT-P-12-02
单位工程
名 称 分部（分项）
工程及工种名称
交底时间 交底人 交底单编号
安 全 技 术 交 底 内 容
木工安全操作技术基本要求
1、模板支撑按专项施工方案搭设。不得使用腐朽、锈蚀、扭裂、劈裂、弯曲变形的材料，禁止使用毛竹。顶撑要垂直，底端要平整、坚实，并加垫木；支撑杆件应用横顺拉杆和剪刀撑拉牢。
2、支模应按工序进行，模板没有固定前，不得进行下道工序；禁止利用拉杆、支撑攀登上下。
3、支设独立梁模应设临时操作台，不得站在柱模上操作和在梁底模上行走。
4、支设4米以上的立柱模板，四周必须顶牢，操作时要搭设工作台。
5、采用桁架支模应严格检查，发现严重变形、螺栓松动等应及时修复。
6、拆除模板应履行申请审批手续，同意后方可操作。操作时应按顺序分段进行，严禁猛撬、硬砸或大面积撬落、拉倒；不得留下松动和悬挂的模板；拆下的模板和杆件应及时运到指定地点集中有序堆放，防止钉子扎脚。
7、拆除薄腹梁、吊车梁、桁架等预制构件模板，应随拆随加顶撑支牢，防止构件倾倒。
8、在坡屋面上操作，应有防滑梯、护身栏杆等防护措施。禁止在石棉瓦上行走。
9、安装2层楼以上外墙窗扇，如外面无脚手架或安全网，应挂好安全带。
10、不准直接在板条天棚或隔音板上通行及堆放材料；必须通
行时，应在大楞上铺设脚手板。
11、木工机械均不得使用倒顺开关控制。
12、操作平刨机有以下基本要求：
（1） 平刨机必须有安全防护装置。刨料时应保持身体稳定，
双手操作，禁止手在料后推送。刨削量每次一般不得超过1.5毫米，进料速度要保持均匀，经过刨口时用力要轻，禁止在刨刀上面回料。
（2） 刨厚度大于1.5厘米、长度小于30厘米的木料，必须用压板或推棍，禁止用手
推进。
（3） 过节疤时，戗槎要减慢推料速度，禁止用手按节疤上推料；刨旧料时，必须将
铁钉、泥砂等清除干净；换刀片时，应拉闸断电。
第一章 基因工程概述
一、名词解释
基因、基因操作、基因工程、重组DNA技术
二、思考题
1、简述基因工程操作的基本步骤。
2、简述基因工程操作的理论依据。
3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。
第二章 基因工程的工具酶
一、名词解释
限制性内切酶、同裂酶、同尾酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶
二、思考题
1、简述限制性内切酶命名的基本原则。
2、影响限制性内切酶活性的因素主要有哪些？
3、影响连接反应效率的因素主要有哪些？
4、大肠杆菌DNA聚合酶有哪些活性？分别简要说明其主要用途。
5、简述切口平移法标记DNA的原理。
答：首先，在Mg2+存在下利用低限量的DNase I处理双链DNA，随机产生少量切口；
然后，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性在切口处向3'端平移去除核苷酸，同时，其5'→3'聚合酶活性则将切口作为引物沿5'→3'方向催化DNA合成；
随着反应的进行，5'端核苷酸不断去除，3'端核苷酸不断掺入，导致切口沿着DNA合成方向移动，即切口平移。
如果在反应体系中加入标记dNTP，则这些标记dNTP将取代原有的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子。
6、简述交换（置换）法标记DNA的原理。
答：反应体系中只有一种标记的dNTP存在时，可利用大肠杆菌DNA聚合酶I或T4/T7 DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性从3’端降解DNA，
当露出与该标记dNTP互补的碱基时，上述酶的5'→3'聚合酶活性则催化该位置发生合成反应，用标记的dNTP置换原来的核苷酸残基，产生3’端标记的DNA。
第三章 基因工程的载体
一、名词解释
载体、质粒、噬菌体、噬菌体溶菌周期、噬菌体溶原周期、克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体、表达标签
二、思考题
1、简述克隆载体具备的基本条件。
2、以大肠杆菌为例，解释利用α互补筛选重组质粒的原理。
答：在IPTG的诱导作用下，lacZ基因编码产生β-半乳糖苷酶，可以分解Xgal产生蓝色的产物。
