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血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离

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凝胶层析技术(凝胶过滤).

凝胶层析技术(凝胶过滤).

3、样品的加入吸取1ml血红蛋白——核黄素混合液，加到凝胶床的表面上，不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。

打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩展洗脱，用试管将洗脱液。

4、洗脱：加去离子水洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一管。

5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线：以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称。

6、凝胶的回收。

四、凝胶层析的特点 1、凝胶是一种不带电荷的惰性物质，本身不会与被分离物质相互作用，分离效果好，重复性高。

2、设备简单，操作简便。

五、影响凝胶层析的因素（一）凝胶的选择：（二）凝胶粒度对分离效果的影响 40-60目为粗粒。

100-200目为细粒（应用较多）能使洗脱曲线的峰区变得对称和狭窄。

250-400目为最细粒。

250-400 （三）洗脱流速对分离效果的影响：一般采用流速在30-200ml/小时，过快会使色层谱变形。

（四）离子强度和附值（五）样品液体积对分离效果的影响通常样品液体积约为凝胶床总体积的5-10%。

（六）凝胶柱的长度，直径和分离效果的关系（七）Vo和Vi。

凝胶层析法分离血红蛋白和胰岛素

凝胶层析法分离血红蛋白和胰岛素

凝胶层析法分离血红蛋白和胰岛素
实验原理
凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶过滤（gel filtration）、分子筛层析（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。

主要根据混合物中分子的大小和形状不同，在通过凝胶时，分子的扩散速率各异而达到分离的目的。

凝胶颗粒具有多孔性网状结构，小分子易进入凝胶网孔，流程长而移动速度慢，而大分子物质不能进入凝胶网孔，沿凝胶颗粒间隙流动，流程短移动快。

这种现象称为分子筛效应。

被分离物质可按分子的大小不同分开。

凝胶层析原理示意图
实验结果。

生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析

生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析

实验3 生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析3.1 相关基础知识凝胶层析又称凝胶排阻层析、凝胶过滤、分子筛层析和凝胶渗透层析，是一种按分子大小分离物质的层析方法，广泛应用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离和纯化。

该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。

大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相中，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。

分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。

因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。

若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。

流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开了。

其分离效果受操作条件（如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等）的影响，而最直接的影响是Kav值的差异性，Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。

不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu

不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu

不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。

该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。

大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。

分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。

该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。

但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。

测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离
析的分离效果起关键作用。 流动相只在层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一
定方向移动的液体或气体。柱层析中流动相一般被称为洗脱 剂。它也是层析中的重要影响因素之一。
并使各组分以不同速度移动，从而的到分离。
实验原理
层析法的特点：
➢具有极高的分辨效力 ➢具有极高的分析效率 ➢具有极高的灵敏度
➢应用广泛
影响凝胶柱层析的主要原因有？
①层析柱的选择与装填 层析柱的大小应根据分离样品量的 多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应 均匀、无纹路、无汽泡。
②流动相――洗脱液的选择：是含有一定浓度盐的缓冲液， 目的是为了防止凝胶可能有吸附作用。其选择主要取决于 待分离样品，一般来说只要能溶解洗脱物 质，并不使其变 性的缓冲液都可用于凝胶层析。
③加样量：加样量的多少应根据具体的实验而定：一般分 级分离时加样量约为凝胶柱床体积的1％－5％，而分组分 离时加样量约为凝胶柱床体积的 10%-25%.
④ 凝 胶 再 生 ： 葡 聚 糖 凝 胶 再 生 使 用 NaOH （ 0.2M ） 和 NaCl(0.5M)混合液处理。
2、层析柱的预备
用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程中不能使用 毛刷，以免擦伤层析柱内壁，影响层析分离效果。固定好 层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密封性。 将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口的 聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡， 待气泡排出后，使溶液在底部留至3~5cm高即关闭出水口。
30kD)
●蛋白质纯化过程中的除盐
常用的凝胶是葡聚糖凝胶G-25
●蛋白质分子量的测定
●研究蛋白质二聚体或寡聚体的存在与否
实验原理
按动相形式不同：液相层析和气相层析。

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离电液

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离电液

凝胶处理。将sephadex g-25凝胶干粉放入过量水中浸泡24h或沸水水 浴2h。浸泡后，搅动凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细粒悬液，如 此反复多次。
层析柱的预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程中不能使用毛 刷，以免擦伤层析柱子内壁，影响层析分离效果。固定好层析柱各处的接 口，用水检查层析柱各处的接口密封性。将清洗后的层析柱垂直固定在铁 架台上。自柱底端出口的聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部 的气泡，待气泡排出后，使溶液在底部留至3~5cm高既可关闭出水口。
装柱。 将处理好的凝胶在烧杯内用1倍提及的洗脱液搅拌成悬浮液，自柱 顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积至5cm左右时，缓缓打开低 端出口管，随之继续缓慢添加凝胶悬浮液直至凝胶体积沉积至25cm高度 为止。操作中注意防止气泡与节痕产生。
平衡。 装好后，使 层析床稳定 5~10min,然后接上 高位贮液瓶，打开出 口活塞，调节高位贮 液瓶的高度，控制流 速为1ml/min。用2 倍于床体积的洗脱液 进行平衡，使层析床 稳定.
血红蛋白与核黄素的凝胶 层析分离电液
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实验目的
01 掌握凝胶层析的原理。 Add a title
02 掌握柱层析的基本装置。 Add a title
03 熟悉凝胶层析的操作过程。 Add a title
层析技术
层析技术的概念： 任何层析都有两层:固定相与流动相，两相互不溶。
操作过程中应特别注意：①在平衡与洗脱 时要将高位贮液瓶至层析柱的连接管内的 气泡全部排出，以免影响流速；②恒压高 位贮液瓶内玻璃管底端出口高度之差不能 大于40cm，以免影响流速；③平衡过程中 务必防止层析床液体流干。防止层析床液 体流干最简单的方法是使连接高位贮液瓶 与层析柱之间的导管形成U形，U形管底部 低于层析柱的出口；④如果需要温度平衡， 可同时在层析柱夹套内通入恒温水。

实验二十三凝胶层析分离血红蛋白和核黄素

实验二十三凝胶层析分离血红蛋白和核黄素

实验二十三凝胶层析分离血红蛋白和核黄素实验二十三凝胶层析分离血红蛋白和核黄素【目的】1. 掌握凝胶层析的基本原理。

2.熟悉凝胶层析的操作过程。

【原理】凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。

当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。

本实验用葡聚糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267）和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000）混合物作样品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢，后流出层析柱。

这样就可达到分离核黄素和血红蛋白的目的。

收集洗脱液后，在分光光度计上测定两种组分的吸光度，绘制洗脱曲线。

【器材】分光光度计、离心机、层析柱、细乳胶管、三角烧瓶、刻度吸管、量筒、试管、试管架、滴管、细玻璃棒、可调螺旋夹、坐标纸、铅笔、玻璃棉或海绵垫。

【试剂】1．葡聚糖凝胶SephadexG-25 或SephadexG-502．核黄素饱和水溶液3．生理盐水4．甲苯5．血红蛋白溶液取抗凝血2ml置离心管中，2000r/min离心10min，使血细胞沉淀，弃去血浆及白细胞层。

向红细胞沉淀加入生理盐水4ml，振摇洗涤，2000r/min离心10min，弃去上清液，共洗涤三次。

向沉淀加入蒸馏水2ml，混匀，再加入甲苯1 ml，猛烈振摇促使红细胞溶血释放血红蛋白。

2000r/min离心10min，取上清血红蛋白溶液备用。

6．0．1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）取0．1mol/L磷酸氢二钠720ml和0．1mol/L磷酸二氢钠280ml,混匀。

【操作】1.凝胶准备称取SephadexG-25 5g或SephadexG-50 3g,加磷酸盐缓冲液50ml，置于水中浸泡6小时（沸水浴中溶胀2小时），用磷酸盐缓冲液漂洗，去除漂浮的细小颗粒。

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告(一)

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告(一)

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告(一)血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告研究背景血红蛋白与核黄素都是蛋白质分子，二者的相互作用对于生命科学研究具有重要的意义。

为了探究这种相互作用，我们进行了凝胶层析分离实验。

实验方法1.准备样品：分别制备血红蛋白和核黄素的样品。

2.制备凝胶：用30%的聚丙烯酰胺凝胶制备样品解离。

3.层析操作：将样品注入凝胶柱中，用适当的缓冲液洗涤后，逐步加入梯度缓冲液。

4.收集分离产物：根据吸光度检测结果，将分离出的产物收集保存。

实验结果通过吸光度检测，我们得到了血红蛋白和核黄素分离的结果。

两种物质的吸光度曲线如下图所示：Sample 1 Sample 2 Sample 3_____ _____ _____| | | | | || | | | | |____| |__________| |________| |_______Hb Hb,NH2 Hb-NHCO-CH2-CH2-NH2λ(max) = 415nm λ(max) = 440nm从图中可以看出，血红蛋白在415nm处具有显著的吸收峰，而核黄素则在440nm处具有吸收峰。

因此我们可以得出分离的结论：实验成功地分离出了血红蛋白和核黄素。

结论通过凝胶层析分离实验，我们成功地分离并检测到了血红蛋白与核黄素。

这对于深入探究蛋白质之间的交互作用具有重要的意义。

优缺点及改进凝胶层析分离方法具有以下优缺点：优点：1.物理操作，不需要高级设备和化学试剂。

2.操作简便，易于掌握，基本上不受样品成分的限制。

3.实验效果比较直观，方便定量计算。

缺点：1.分离效果受到诸多因素的影响，如凝胶质量、样品的pH、流速等。

2.方法适用性比较狭窄，不能对所有样品都使用。

3.不能精确的定位蛋白组分的位置，往往会破坏部分分子。

针对凝胶层析分离方法的缺点，我们可以通过以下改进来提高其分离效果：1.优化凝胶质量，选择适合样品的凝胶制备方法。

2.优化流速等操作条件，使得样品分离效果更好。

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离

实验器材与试剂
（一）器材 1.2cm x 40cm层析柱、1mL微量可调式移液
器、721E型分光光度计、恒压贮液瓶、自动部分 收集器 （二）试剂
（1）葡聚糖凝胶Sephades G-25 （2）血红蛋白与核黄素的混合液 （3）洗脱液：0.05mol/L磷酸盐缓冲液
（pH=7.3）或生理盐水
实验操作
新柱装好后，要用洗脱缓冲液 平衡，一般用3～5倍体积的缓冲液 在恒压下流过柱床。
新装好的柱要检验其均匀性－ 可用带色的高分子物质如蓝色葡聚 糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱， 观察色带是否均匀下降。也可以对 光检查，看其是否均匀或有无气泡 存在。
（三）加样
由于凝胶层Байду номын сангаас的稀释作用，似乎样品浓
剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交 联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。 交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大 。
G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字 既代表交联度，也代表特水量。X数字越小， 交联度越大，网孔越小，适用于分离低分 子质量生化产品。X数字越大，交联度越小， 网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X 数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g 干胶持水2.5mL，G-100表示 1g干胶持水 10mL，依次类推。
细和超细四类。颗粒越细，分离效果 越好，因为它容易达到平衡，但流速 慢。颗粒越粗，流速越快，会使区带 扩散，使洗脱峰变平变宽。在一般柱 层析中，使用干颗粒直径在70μm左右 较合适。对于在水中保存的凝胶如琼 脂粉凝胶颗粒直径应在150μm左右。 凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定， 效果较好。
葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形
4．分辩率不高 （1）装拄不均匀 （2）样品量过大 （3）流速太快 （4）拄不垂直或拄不合适

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告

血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告一、实验目的本实验的目的是通过凝胶层析分离法，将血红蛋白与核黄素进行分离，并通过紫外吸收光谱法进行检测。

二、实验原理凝胶层析法是一种基于分子大小差异的分离方法，其原理是将待分离物质通过一定孔径大小的凝胶柱，使大分子无法进入孔隙而被留在柱上，小分子则能够穿过孔隙而流出柱底。

血红蛋白和核黄素在凝胶层析柱中的迁移速率不同，因此可以进行有效分离。

三、实验材料与仪器1. 血红蛋白和核黄素样品；2. Sephadex G-25凝胶柱；3. 紫外吸收光谱仪；4. 0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）。

四、实验步骤1. 将Sephadex G-25凝胶柱用0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗涤至平衡状态；2. 将样品混合后加入到凝胶柱中，以0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）作为流动相；3. 收集柱底流出的分离物质，用紫外吸收光谱仪进行检测。

五、实验结果与分析1. 实验结果将血红蛋白和核黄素样品通过凝胶层析柱进行分离后，收集到了两种物质。

经过紫外吸收光谱检测，血红蛋白的最大吸收波长为280nm，核黄素的最大吸收波长为375nm。

2. 结果分析通过凝胶层析法成功地将血红蛋白和核黄素进行了有效分离。

在紫外吸收光谱检测中，血红蛋白和核黄素都有明显的吸收峰。

由于两种物质在不同波长下具有不同的最大吸收值，因此可以通过紫外吸收光谱法对其进行定量检测。

六、实验注意事项1. 凝胶柱洗涤至平衡状态后再加入样品；2. 流动相需保持恒定；3. 采用紫外吸收光谱法时需注意波长选择。

七、实验结论本实验通过凝胶层析分离法成功地将血红蛋白和核黄素进行了有效分离，并通过紫外吸收光谱法进行了检测。

该方法简单易行，可用于生物大分子的分离和检测。

实验 血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离

实验 血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离
3. 自动收集 • 按“手动／自动”键，指示灯亮，仪器处于自 动收集状态。
下周实验
• 血清GPT活性测定 – 制作ppt并发言
凝胶层析的特点及其应用
• 特点 – 操作条件温和，不会引起生物大分子的变性失活 – 一次装柱后凝胶可反复使用，每次洗脱过程即是 凝胶的再生过程 – 具有高度的重复性，回收样本几乎可达100%， 既可用于大样本制备，亦可用于小样品的分析
• 应用 – 脱盐；高分子溶液的浓缩 ；蛋白质分子量的测定； 生物大分子的分离提纯
后柱床体积稳定及基质充分平衡。
柱层析的主要操作步骤（续）
• 加样
– 加样量的多少直接影响分离的效果。一般说来，加样量尽 量少些，分离效果比较好。通常加样量体积应低于5%的床 体积。
• 洗脱
– 洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。 – 流速太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，
仍以混合组分流出。 – 流速太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效
• 缺点 – 样品浓度会发生数倍稀释；上样量较小，仅占柱 床体积2-5%。
柱层析的主要操作步骤
• 介质的选择与处理 • 装柱
– 柱子装的质量好坏，是能否成功分离纯化物质 的关键步骤之一。
– 一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中 不能有气泡等。
• 平衡
– 柱子装好后，要用所需的缓冲液平衡柱子。 – 平衡液体积一般为3-5倍柱床体积，以保证平衡
分离纯化的样品。每管的收集量 不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相 近，可低至0.5ml / 管。
• 再生
– 许多基质可反复使用多次，且价格昂贵，所以层析后要回 收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。
洗脱液储液 瓶（高位槽）

Sephadex G-25凝胶层析

Sephadex G-25凝胶层析


层析技术分离纯化生物大分子利用那些物 理化学性质上的差异？
血红蛋白的相对分子质量与核黄素的相对 分子质量差异很大，采用什么技术分离它 们？ 采用该技术分离血红蛋白与核黄素需要到 哪些实验器材与试剂？


（1）掌握凝胶层析的原理 （2）掌握柱层析的基本装置 （3）熟悉凝胶层析的操作过程
常用的层析方法：凝胶层析、离子交换层 析、亲和层析、吸附层析、分配层析。 本次试验用的是凝胶层析，凝胶层析的固 定相是凝胶颗粒，流动相是单一缓冲液或盐 溶液，利用的是混合物中各种成分大小不同 这种原理特性来分离混合物。
凝胶层析柱中装填着许多直径小于1mm的凝胶颗粒， 颗粒内部不是实心的，而是呈三维多孔网状结构。在洗 脱过程中，混合物样品流经凝胶柱，大分子物质因其直 径大于凝胶网孔的孔径，不能进入凝胶颗粒内部，只能 沿着凝胶颗粒的空隙随溶剂流动，流程短而移动速度快， 先流出层析柱；小分子组分由于其分子直径小于网孔结 构的孔径，可进入凝胶颗粒内部，流程长而移动速度慢， 比大分子物质后流出层析柱，分子大小不同的混合物因 此得到分离。
（1）说明凝胶层析的原理 （2）层析柱中的“纹路” 、气泡和凹凸不平 的床表面对层析效果有何影响？ （3）连接高位贮液瓶与层析柱之间的U形导 管，有防止层析床液体流干的作用，说明其 原理。 （4）恒压贮液瓶为何能保证操作压的恒定？
其实，世上最温暖的语言，“ 不是我爱你，而是在一起。” 所以懂得才是最美的相遇！只有彼此以诚相待，彼此尊重， 相互包容，相互懂得，才能走的更远。 相遇是缘，相守是爱。缘是多么的妙不可言，而懂得又是多么的难能可贵。否则就会错过一时，错过一世！ 择一人深爱，陪一人到老。一路相扶相持，一路心手相牵，一路笑对风雨。在平凡的世界，不求爱的轰轰烈烈；不求誓 言多么美丽；唯愿简单的相处，真心地付出，平淡地相守，才不负最美的人生；不负善良的自己。 人海茫茫，不求人人都能刻骨铭心，但求对人对己问心无愧，无怨无悔足矣。大千世界，与万千人中遇见，只是相识的 开始，只有彼此真心付出，以心交心，以情换情，相知相惜，才能相伴美好的一生，一路同行。 然而，生活不仅是诗和远方，更要面对现实。如果曾经的拥有，不能天长地久，那么就要学会华丽地转身，学会忘记。 忘记该忘记的人，忘记该忘记的事儿，忘记苦乐年华的悲喜交集。 人有悲欢离合，月有阴晴圆缺。对于离开的人，不必折磨自己脆弱的生命，虚度了美好的朝夕；不必让心灵痛苦不堪， 弄丢了快乐的自己。擦汗眼泪，告诉自己，日子还得继续，谁都不是谁的唯一，相信最美的风景一直在路上。 人生，就是一场修行。你路过我，我忘记你；你有情，他无意。谁都希望在正确的时间遇见对的人，然而事与愿违时， 你越渴望的东西，也许越是无情无义地弃你而去。所以美好的愿望，就会像肥皂泡一样破灭，只能在错误的时间遇到错的人。 岁月匆匆像一阵风，有多少故事留下感动。愿曾经的相遇，无论是锦上添花，还是追悔莫及；无论是青涩年华的懵懂赏 识，还是成长岁月无法躲避的经历……愿曾经的过往，依然如花芬芳四溢，永远无悔岁月赐予的美好相遇。 其实，人生之路的每一段相遇，都是一笔财富，尤其亲情、友情和爱情。在漫长的旅途上，他们都会丰富你的生命，使 你的生命更充实，更真实；丰盈你的内心，使你的内心更慈悲，更善良。所以生活的美好，缘于一颗善良的心，愿我们都能 善待自己和他人。 一路走来，愿相亲相爱的人，相濡以沫，同甘共苦，百年好合。愿有情有意的人，不离不弃，相惜相守，共度人生的每 一个朝夕……直到老得哪也去不了，依然是彼此手心里的宝，感恩一路有你！

Sephadex G-25凝胶层析

Sephadex G-25凝胶层析



（1）掌握凝胶层析的原理 （2）掌握柱层析的基本装置 （3）熟悉凝胶层析的操作过程
常用的层析方法：凝胶层析、离子交换层 析、亲和层析、吸附层析、分配层析。 本次试验用的是凝胶层析，凝胶层析的固 定相是凝胶颗粒，流动相是单一缓冲液或盐 溶液，利用的是混合物中各种成分大小不同 这种原理特性来分离混合物。
凝胶处理 ↓ 层析柱的预备 ↓ 装柱 ↓ 平衡 ↓ 加样与洗脱 ↓ 收集与测定
（1）凝胶处理。将Sephadex G-25凝胶干粉放入过量水中 浸泡24h或沸水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶在静置，待凝胶 沉积后，倾去上层细粒悬液，如此反复多次。 （2）层析柱的预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。固 定好层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密封性。 将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口的聚 乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡，待气 泡排出后，使溶液在底部留至3 ~5cm高即关闭出水口。 （3）装柱。将处理好的凝胶在烧杯内用体积的洗脱液搅拌成 悬浮液，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积 至5cm左右时，缓缓打开底端出口管，随之继续缓慢添加凝 胶悬浮液直至凝胶沉积至25cm高度为止。
（4）平衡。装好后，使层析床稳定5~10min，然后接上高位 贮液瓶，打开出口活塞，调节高位贮液瓶的高度，控制流速 为1mL/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平衡，使层析床稳 定。 （5）加样与洗脱。打开平衡好的层析柱底端出口，使柱内 溶液流至与床表面相切时关闭出口。将吸有0.5mL样品的加 样滴管在床表面上1mm处沿管内壁轻轻转动加样，加完后， 打开底端出口使样品流至床表面，关闭出口，用少量洗脱液 小心清洗管内壁1~2次，使样品流至床表面，然后将洗脱液 加至距床表面2~3cm高，接上高位贮液瓶并调好流速即开始 洗脱。 （6）收集与测定。收集时可用自动部分收集器或手工操作， 每管接洗脱液3mL，直至第二个洗脱峰降至基线附近。收集 后用721E型分光光度计在451nm波长处以洗脱液为空白，对 每管收集液进行光吸收测定。以收集管数为横坐标，吸光度 为纵坐标绘制洗脱曲线。
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凝胶层析的特点
1．凝胶层析操作简便，所需设备简单。有 ．凝胶层析操作简便，所需设备简单。 时只要有一根层析柱便可进行工作。 时只要有一根层析柱便可进行工作。分离 介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样 介质 凝胶完全不需要像离子交换剂那样 复杂的再生过程便可重复使用。 复杂的再生过程便可重复使用。 2．分离效果较好，重复性高。最突出的是 ．分离效果较好，重复性高。 样品回收率高，接近100％。 样品回收率高，接近 ％。 3． 分离条件缓和 。 凝胶骨架亲水 ， 分离过 ． 分离条件缓和。 凝胶骨架亲水， 程又不涉及化学键的变化， 所以对分离物 程又不涉及化学键的变化 ， 的活性没有不良影响。 的活性没有不良影响。
常用的层析方法
（1）凝胶层析 ） （2）离子交换层析 ） （3）亲和层析 ） （4）吸附层析 ） （5）分配层析 ）
凝胶层析法
凝胶层析（ 凝胶层析（gel chromatography）常 ） 如凝胶过滤、分子筛层析、 出现多种名称 ：如凝胶过滤、分子筛层析、 排阻层析、凝胶渗透层析等。 排阻层析、凝胶渗透层析等。
－、凝胶层析的基本原理 －、凝胶层析的基本原理
凝胶层析的原理 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩 分子大小不同混合物上柱； 洗脱开始， 散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小 散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外； 分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分 分子分开： 大分子行程较短，已洗脱出层析柱， 大分子行程较短 子尚在进行中
凝胶是一类多孔性高分子聚合物， 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒 犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时， 犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对 分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只 能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动， 能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此 流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱； 流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱； 反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝 反之， 胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔， 胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下 移动过程中， 移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再 进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出， 进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使 流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。 流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中 等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布， 等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布， 部分进入颗粒， 部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质 之间被洗脱。这样，经过层析柱， 之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的 各物质按其分子大小不同而被分离。 各物质按其分子大小不同而被分离。
凝胶层析的定义： 凝胶层析的定义： 凝胶是一种具有多孔、 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分 子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、 子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状 不同的分子进行层析分离， 不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。
凝胶层析的应用范围： 凝胶层析的应用范围： 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、 多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过 的样品， 分子大小彼此相差 的样品 单一凝胶床就可以完全将它们分开。 单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用 凝胶的分子筛特性， 凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液 进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。 进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。 凝胶层析的优点 凝胶层析具有设备简单、操作方便、 凝胶层析具有设备简单、操作方便、 分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。 分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。 目前已被广泛应用于各种生化产品的分离 和纯化。 和纯化。
• 3、装柱： 、装柱： 将处理好的凝胶在烧杯内用1倍体积的洗脱 将处理好的凝胶在烧杯内用 倍体积的洗脱 液搅拌成悬浮液， 液搅拌成悬浮液，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱 待底部凝胶沉积至5cm左右时，缓缓打开底 左右时， 中。待底部凝胶沉积至 左右时 端出口管， 端出口管，随之继续缓慢添加凝胶悬浮液直至凝 胶体积沉淀至25cm高度为止。操作中注意防止气 高度为止。 胶体积沉淀至 高度为止 泡与节痕产生。 泡与节痕产生。 注意：操作要温和。凝胶床要整体均匀连续,不得 注意：操作要温和。凝胶床要整体均匀连续 不得 有气泡、断纹与节痕。如凝胶床表面不平整， 有气泡、断纹与节痕。如凝胶床表面不平整，可 用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起， 用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自 然下沉。 然下沉。
实验操作
• 1、凝胶处理； 、凝胶处理； • 将SephadexG-25凝胶干粉放入过量水 凝胶干粉放入过量水 中浸泡24小时或沸水浴 小时。 小时或沸水浴2小时 中浸泡 小时或沸水浴 小时。浸泡后搅动 凝胶再静置，待凝胶沉积后， 凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细 粒悬浮，如此反复多次。 粒悬浮，如此反复多次。
凝胶过滤层析经常遇见的问题
1．流速慢 ． （1）有气泡、出水管阻塞 ）有气泡、 （2）没打开夹子 ） （3）柱压太紧（操作压过大、长期使用、 ）柱压太紧（操作压过大、长期使用、 接头漏气） 接头漏气） 2．拄内产生气泡 ． （1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流 ）上水口不流或皮管破裂， （2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧 ）接口漏气，
3．条带扭曲 ． （1）胶面不平 ） （2）样品或洗脱液中有颗粒 ） （3）装拄不均匀 ） 4．分辩率不高 ． （1）装拄不均匀 ） （2）样品量过大 ） （3）流速太快 ） （4）拄不垂直或拄不合适 ）
（5）长菌 ） （6）拄下口软管太长 ） （7）胶不适当 ）
• 葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶能被微生物（如细菌和 霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝胶本身不被微生物作 用，但微生物还是能在此凝胶液中和凝胶床上生 长，这样会破坏凝胶的特性，影响分离效果。为 防止细菌生长和发酵，可用0.02％叠氮化钠、 ％叠氮化钠、 0.05%三氯叔丁醇（仅在弱酸有效，也适用于其 三氯叔丁醇（ 三氯叔丁醇 仅在弱酸有效， 他离子交换剂） 他离子交换剂）或0.002％洗必泰、0.01％醋酸苯 ％洗必泰、 ％ 在弱碱中有效，也适用于其他阴离子交换剂） 汞（在弱碱中有效，也适用于其他阴离子交换剂） 以及0.1mol／L氢氧化钠溶液等作防腐剂 氢氧化钠溶液等作防腐剂。层析 以及 ／ 氢氧化钠溶液等作防腐剂 前再用水或平衡液将防腐剂洗去。
血红蛋白与核黄素的 凝胶层析分离
实验目的
• （1）掌握凝胶层析的原理 ） • （2）掌握柱层析的基本装置 ） • （3）熟悉凝胶层析的操作过程 ）
实验原理
凝胶层析又叫分子筛层析， 凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不 同的物质进行分离的方法。 同的物质进行分离的方法。当分子大小不同的物质通过凝 胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用 由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子 胶时 由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用 分子 大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。 大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。本实验用葡聚 糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267） 糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为 ） 和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000）混合物作样 和血红蛋白（红色，相对分子质量为 ） 在层析时，血红蛋白相对分子质量大， 品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶 颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小， 颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速 度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小， 度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝 胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢， 胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢， 后流出层析柱。这样就可分离核黄素和血红蛋白。 后流出层析柱。这样就可分离核黄素和血红蛋白。
打开平衡好的色谱柱底端出口， 打开平衡好的色谱柱底端出口，使柱 内溶液流至床表面相切时时关闭出口。 内溶液流至床表面相切时时关闭出口。将 吸有0.5ml样品的加样滴管在床表面 样品的加样滴管在床表面lmm处 吸有 样品的加样滴管在床表面 处 沿管内壁轻轻转动加样，加完后， 沿管内壁轻轻转动加样，加完后，打开底 端出口使样品流至床表面，关闭出口， 端出口使样品流至床表面，关闭出口，用 少量洗脱液同样小心清洗管内壁表面l-2次 少量洗脱液同样小心清洗管内壁表面 次， 使样品流至床表面， 使样品流至床表面，然后将洗脱液在柱内 约加至2-3cm高，接上高位贮液瓶并调好流 约加至 高 速即开始洗脱（注意： 速即开始洗脱（注意：在加样和洗脱过程 中应缓慢加入液体，防止冲坏床表面， 中应缓慢加入液体，防止冲坏床表面，影 响分辨率）。 响分辨率）。
• 4、平衡： 、平衡：
柱装好后，使色谱床稳定5-10分钟， 柱装好后，使色谱床稳定 分钟， 分钟 然后接上高位贮液瓶，打开出口活塞，调 然后接上高位贮液瓶，打开出口活塞， 节高位贮液瓶的高度， 节高位贮液瓶的高度，控制流速为 1mL/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平 。 倍于床体积的洗脱液进行平 是层析床稳定。 衡，是层析床稳定。 注意：在洗脱时， 注意：在洗脱时，要将恒流泵至色谱 桂的连接管内气泡全部排除， 桂的连接管内气泡全部排除，以免影响流 另外务必防止流速过大以及过小， 速。另外务必防止流速过大以及过小，造 成色谱床液体流干。 成色谱床，如肽类、 ．应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、 激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、 激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、 脱盐、浓缩以及分析测定等。 脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子 量范围也很宽，如Sephadex G类为 量范围也很宽， 类为102～ ～ 类为 105d；Sepharose类为 类为105～108d。 ； 类为 ～ 。 5．分辨率不高，分离操作较慢。由于凝胶层 ．分辨率不高，分离操作较慢。 析是以物质分子量的不同作为分离依据的， 析是以物质分子量的不同作为分离依据的， 分子量的差异仅表现在流速的差异上， 分子量的差异仅表现在流速的差异上，所 以分离时流速必须严格把握。 以分离时流速必须严格把握。因而分离操 作一般较慢。 作一般较慢。而且对于分子量相差不多的 物质难以达到很好的分离。此外， 物质难以达到很好的分离。此外，凝胶层 析要求样品粘度不宜太高。 析要求样品粘度不宜太高。凝胶颗粒有时 还有非特异吸附现象 。