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正交实验确定Alcalase水解大豆蛋白的最佳实验条件孙显慧【摘要】采用枯草杆菌碱性蛋白酶Alcalase(标注酶活力2.4Au/g)作为水解酶对大豆蛋白进行水解,得到大豆多肽溶液.以大豆蛋白的水解度(DH)来表征大豆蛋白水解反应进行的程度.选择水解反应温度、pH值、酶浓度作为三个影响因素分别取三个水平,以水解度为指标进行三因素三水平正交实验.实验结果得到的最佳实验条件为底物浓度为8％,酶浓度(E/S)为3.6Au/100g底物,温度T60℃以及pH为8.0.【期刊名称】《潍坊学院学报》【年(卷),期】2015(015)006【总页数】3页(P21-23)【关键词】大豆蛋白;碱性蛋白酶Alcalase;正交实验;最佳水解条件【作者】孙显慧【作者单位】潍坊职业学院,山东潍坊261041【正文语种】中文【中图分类】TQ936.2大豆蛋白质的水解方法可分为酸水解、碱水解和酶水解法等多种方法，由于酸碱水解方法存在许多不足之处，如营养成分损失，水解无特异性，副反应多，水解产物感官性能差，反应条件不易控制等，所以在这方面的研究不是太多。
相比而言酶解反应条件温和，反应易于控制，反应过程中营养物质的破坏较小，因此，从1970年代起，日本和美国的研究学者就开始致力于酶水解生产大豆蛋白水解产物的研究。
在我国，从1980年代起也有一些科研人员开始研究大豆多肽的酶解法生产。
目前为止，酶法水解大豆蛋白质生产大豆多肽成了研究的一个重要方向，用于研究大豆蛋白水解的酶主要有胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶及微生物蛋白酶等；由于各种不同的酶对蛋白质作用的位点不同，得到的产物也就不同，不同的酶也可能给产品带来不同的风味，甚至带来难以除去的苦味。
近几年来，有人用微生物发酵技术制备大豆肽［1］，这种方法将酶的生产和应用合二为一，省去了中间步骤，不需要添加额外的酶就可以生产出大豆肽，大大降低了成本，这种制备技术成了大豆多肽研究的一个新的方向。
碱性蛋白酶水解大豆蛋白过程的拟合及水解产物性质的研究孔祥珍;叶挺;孙灵湘;丁秀臻;华欲飞【摘要】采用Alcalase碱性蛋白酶在50、60℃下以不同酶底比(1∶100、2∶100和3∶100)分别制备水解度(DH)为5％、10％和15％的大豆蛋白水解产物.考察水解反应动力学以及水解产物的DPPH自由基清除率和三氯乙酸可溶性氮含量,并且采用HPLC表征水解产物相对分子质量变化.结果表明:碱性蛋白酶在所考察的条件下水解大豆蛋白,符合指数形式动力学方程;水解产物水解度从5％增加到15％,DPPH自由基清除率和三氯乙酸可溶性氮含量分别由17.07％、16.28％增加到31.84％、64.85％;大豆蛋白经碱性蛋白酶水解至相同水解度时,在同一温度下,随着酶底比的增加,水解产物的DPPH自由基清除率和三氯乙酸可溶性氮含量增加,水解产物中相对分子质量大于10 kD的肽段比例逐渐减小,小于0.5 kD的肽段比例逐渐增大.同一种酶水解同一种蛋白质,虽然水解反应动力学均符合指数形式动力学方程,但是当大豆蛋白被水解至相同水解度时,不同条件下制备的水解产物的性质与结构均有显著性差异.【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2015(040)012【总页数】5页(P26-30)【关键词】碱性蛋白酶;水解;拟合方程;水解度;相对分子质量分布【作者】孔祥珍;叶挺;孙灵湘;丁秀臻;华欲飞【作者单位】江南大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122;江南大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122;江南大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122;江南大学食品学院,食品安全与营养协同创新中心,江苏无锡214122;江南大学食品学院,食品安全与营养协同创新中心,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】TS229;TQ936蛋白酶水解蛋白质的过程实际上是使蛋白质中的肽键断裂，生成胨、肽等低相对分子质量产物的生化反应过程。
利用大豆蛋白制备大豆蛋白基表面活性剂的研究由于传统的表面活性剂长期使用对环境造成了一定的危害,因此本论文希望制备一种可以替代传统表面活性剂的性能良好的,绿色的,可再生的,对环境友好的蛋白质基表面活性剂。
为此,本论文研究了alcalase碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白,并在此基础上利用葡萄糖与葡聚糖进一步修饰,以改变大豆分离蛋白的结构并提升大豆分离蛋白的表面活性。
本论文采用起泡性、起泡稳定性、乳化性、乳化稳定性表示表面活性性能,通过圆二色谱分析蛋白质分子的二级结构,通过荧光光谱分析疏水性基团在分子中的分布,通过粒径分布及Zeta电位分析溶液的稳定性,通过测定表面张力确定临界胶束浓度(CMC值)。
本实验的创新点在于将表面疏水性与表面活性进行相关性分析,希望将表面疏水性作为一个预测表面活性的关键指标。
研究结果如下:(1)实验确立了alcalase碱性蛋白酶的水解条件:在底物浓度4%,温度55℃,pH 8.0,酶添加量0.2%的条件下,大豆分离蛋白的水解效率最高。
经过不同程度的酶解处理后,可溶蛋白含量均有显著提升,最高值相比天然大豆分离蛋白提升4.23倍;当水解度为6.05%时,起泡性与起泡稳定性分别提升85.85%与116.18%;乳化性与乳化稳定性分别提升105.10%与45.74%;表面疏水性提升136.16%。
酶处理后游离氨基含量随水解度升高而升高。
由表面张力与CMC值结果可知,当水解度小于等于6.05%时,表面张力随着水解度的增加而降低,当水解度为6.05%时,对应的CMC值降到最低,为0.25 g/L。
内源荧光光谱与圆二色谱结果表明,蛋白质分子被打开,结构由紧密转变为疏松,疏水性基团暴露于分子表面。
粒径分布与Zeta电位结果表明,蛋白质溶液系统稳定性增强。
由实验结果可知,alcalase碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白可以显著提升表面活性,但是提升程度有限。
(2)本论文在alcalase碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的基础上,制备糖接枝产物,研究了糖接枝产物的表面活性与结构变化。
Alcalase水解大豆蛋白的研究摘要：为了解决许多大豆蛋白酶解工艺中，需加碱维持体系的pH值以得到高的水解度，最终会生成大量的盐，而脱盐又是一个高能耗的步骤，对酶解进行研究，提出了用碱性蛋白酶Alcalase和黑曲霉酸性蛋白酶协同水解大豆蛋白的方法。
关键词：大豆蛋白Alcalase酶解一、实验原理水解蛋白质的反应式。
大豆蛋白原料组成：蛋白质含量为91%；水分含量的测定采用常压直接干燥法，测得水分含量为7.35％。
二、Alcalase水解大豆蛋白1.酶解反应步骤如下：(1)将大豆蛋白在105℃下干燥至恒重，称取一定量上述原料加入反应釜，按照设计的底物浓度向反应釜中补充适量水。
(2)连接反应釜和超级恒温水浴，然后启动磁力搅拌器和超级恒温水浴，使温度为控制温度下。
(3)在反应釜上安装pH计电极，在搅拌下以一定方式加入蛋白酶进行水解。
(4)在反应过程中不断进行搅拌，并滴加2mol/LNaOH维持pH值不变。
(5)水解结束后，水解液经过高温灭活(95℃下加热5min)，在4000r/min的条件下离心10min，取适量上清液供分析用。
酶解效果评价：采用大豆蛋白的水解度指标评价酶水解效果，大豆蛋白水解度（HD）的测定是描述蛋白质水解程度的一个非常重要的量。
测得的蛋白质相应含量就可以计算出1克水解大豆蛋白样相应的HD值：HD=[0.01×V/（3×0.1）-0.33]/7.82.pH值定测利用仪器校正后测量，将每组测取三个数据取平均值。
三、结果与讨论1.大豆蛋白的酶解酶解蛋白质通常是在维持体系pH值不变条件下进行的。
蛋白质在酶解的过程中pH值一般呈明显的下降趋势，其根本原因是肽键打开后羧基的酸性造成的，可通过向水解液中加NaOH溶液维持pH值不变。
2.单因素水解条件的考察2.1pH值对水解度的影响水解条件：酶与底物比45；底物浓度60g/L；水解时间2h；温度60℃。
实验结果如图3-1所示。
酶改性大豆蛋白巯基含量及其功能性研究摘要本文利用Alcalase水解大豆蛋白制备大豆多肽，通过试验测定了大豆蛋白及其产物大豆多肽的巯基含量和功能特性的差异。
结果表明：大豆蛋白的总巯基显著高于大豆蛋白20μmol/g左右，同时大豆蛋白的游离巯基的含量也显著高于大豆多肽，约为12μmol/g；大豆蛋白的持水性显著高于大豆多肽，并且大豆蛋白的持水性是大豆多肽的40倍左右，同时两者持油性也具有显著差别，大豆蛋白的持油性是大豆多肽的1.63倍左右；大豆多肽的溶解性显著高于大豆蛋白的6%左右；大豆蛋白的起泡性显著低于大豆多肽，但是其起泡稳定性高于大豆多肽；大豆多肽和大豆蛋白的乳化性与乳化稳定性变化不显著。
关键词大豆蛋白；大豆多肽；巯基；功能性1 材料与方法1.1 材料与试剂大豆蛋白；Alcalase酶；十二烷基硫酸钠；大豆油1.2 仪器与设备电子天平（上海越平仪器有限公司）；pH计（上海精密科学仪器有限公司）；离心分离机（北京京立离心机有限公司）；磁力搅拌器（上海精密科学仪器有限公司）；紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（天津市欧诺仪器仪表有限公司）；实验型喷雾干燥机（上海比朗有限公司）1.3 方法（1）大豆多肽的制备根据雷鸣[3]等人研究Alcalase水解大豆蛋白制备大豆多肽的方法稍作修改。
取7%大豆蛋白溶于水，在90℃水浴10min，冷却，调pH值为7，加酶比底物为4%，放到水浴锅中60℃4h并维持pH值，离心（4000r）10min，取上清液，喷雾干燥。
（2）功能特性测定方法①巯基测定参考Ellman的方法[4]。
②热稳定性测定参考杨继涛[5]等人的方法。
③持油与持水性测定参考邓芝串[6]等人的方法。
④起泡性与起泡稳定性测定参考Bera等人的方法。
2 结果与分析2.1 巯基含量结果分析通过实验发现游离巯基含量和总巯基含量都是大豆蛋白显著高于大豆多肽（P＜0.05），其数值差分别为20mol、12mol左右.巯基含量的增减是由于大豆蛋白分子的肽链断裂，比较紧密的结构松散开来或瓦解，使原来分子内部的巯基暴露出来从而导致其含量的增减，由于大豆多肽本身肽链较大豆蛋白而言肽链较短，结构松散，从而巯基含量下降。
酶法制取大豆油脂过程中的蛋白酶解动力学张辉1，齐宝坤2，李杨2，隋晓楠2，王中江2，江连洲3收稿日期：2015－02－25作者简介：张辉（1981—），男，副研究员，博士，研究方向为科技管理和食品战略，E-mail ：zhanghui @ 通讯作者：江连洲原文出处：《食品科学》，2016Vol.37No.01（1.科技部中国农村技术开发中心，北京100045； 2.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030）摘要：通过数学方法推导和对Alcalase 碱性蛋白酶酶解大豆中蛋白实验的系统研究，得到Alcalase 碱性蛋白酶酶解大豆中蛋白的动力学模型为：Ｒ=（18.2940E 0+0.2734ρ0）exp （－0.2562DH ），式中：E 0为初始蛋白酶质量浓度，ρ0为初始底物质量浓度，DH 为水解度。
通过数学推导和对大豆蛋白酶解反应过程中Alcalase 碱性蛋白酶失活的系统研究，得到膨化大豆蛋白的酶解反应过程中Alcalase 碱性蛋白酶失活的动力学常数K =4.9204min －1。
通过拟合实验证明，建立的动力学模型与实验结果具有较好的拟合效果，证明所建立的动力学模型具有较高的实际应用价值。
关键词：大豆；酶法制油；蛋白酶解；酶解动力学中图分类号：TS221文献标志码：A 文章编号：1002－6630（2016）01－0145－05doi ：10.7506/spk ˑ1002－6630－201601026Kinetics of protein hydrolysis during aqueous enzymatic extraction of soybean oilZhang Hui 1，Qi Baokun 2，Li Yang 2，Sui Xiaonan 2，Wang Zhongjiang 2，Jiang Lianzhou 2（1.China Ｒural Technology Development Center ，Ministry of Science and Technology of China ，Beijing 100045，China ；2.Food Science College of Northeast Agricultural University ，Harbin 150030，China ）Abstract ：The hydrolysis of extruded full-fat soybean flakes by alkaline protease provides a promising method toextract soybean oil ，protein and polypeptide simultaneously．In order to control the enzyme-assisted aqueous extraction of oil from full-fat soybean flakes ，it is necessary to model the kinetics of the protein hydrolysis ofextruded full-fat soybean flakes and establish the relevant kinetic parameters．In this research ，we developeda kinetic mathematical model for the alcalase hydrolysis of full-fat soybean flakes as follows ：Ｒ=（18.2940E 0+0.2734ρ0）exp （－0.2562DH ），where E 0is the initial concentration of alcalase ，ρ0is initial substrate concentration ，and DH is degree of hydrolysis．The kinetic constant （K ）of the inactivation of alcalase during the hydrolysis process was determined to be 4.9204min －1．Our experimental data were well fitted to the proposed kinetic model ，proving that the mode has a high practical value．Key words ：soybean ；enzyme-assisted aqueous extraction of soybean oil ；protein hydrolysis ；enzymatichydrolysis kinetics酶法提油是在机械破碎的基础上，采用蛋白酶作用于油料，使油脂易于从油料固体中释出，利用非油成分（蛋白质和碳水化合物）对油和水的亲和力差异，同时利用油水比重不同而将油和非油成分分离，主要分为预处理、酶解蛋白、离心分离几个步骤，其中蛋白质的酶解程度对油脂释放有显著影响［1－2］。
碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白制备大豆多肽的工艺条件优化李丽娟;孟鹏【摘要】以大豆分离蛋白为原料，地衣芽胞杆菌产碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白，分别从酶浓度、pH 值、反应温度和水解时间等因素来研究水解效果，在50℃，pH 10，酶浓度100 U/ mL，水解2 h 时水解效果最好，水解度达到31.45%。
%Alkaline protease from Bacillus licheniformis was used to hydrolyze separated soybean protein as raw mate-rial,and the hydrolyses effects were studied respectively with enzyme concentration,pH,reaction temperature,hy-drolysis time,and other factors;under pH 10,50 ℃,reacted with 100 U/ mL enzyme concentration,hydrolyzing for 2 h the effect wasthe best with the degree of hydrolysis at 31. 45% .【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】5页(P62-66)【关键词】大豆分离蛋白;碱性蛋白酶;水解度;大豆多肽【作者】李丽娟;孟鹏【作者单位】乌兰察布医学高等专科学校，内蒙古乌兰察布 012000;邹城市食品药品监督管理局，山东邹城 273500【正文语种】中文【中图分类】Q93大豆分离蛋白营养价值高，含有丰富的优质蛋白质，但因溶解性、胀气因子及不良气味等因素，影响了其作为食物的可接受性，而其水解产物大豆多肽，可作为一种营养食品添加剂，以其柔和丰满的口味广泛被应用[1-2]。
大豆多肽的制备包括酶法和化学法，酶法制备由于优势明显，逐渐代替化学法成为主流[3]。
