小鼠(Mouse)肿瘤坏死因子β(TNF-β)-NEWA
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肿瘤坏死因子TNF家族及其受体基础概述肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)家族是一类重要的细胞因子,包含多种细胞因子及其对应的受体。
TNF家族在免疫应答、细胞凋亡、炎症反应等多个生理和病理过程中发挥重要作用。
本文将对TNF家族及其受体进行基础概述。
TNF家族是一类由细胞因子及其对应的受体组成的大家族,目前已鉴定出29个成员。
这些成员包括TNF-α、TNF-β、LT-α、LT-β、CD40L、FasL等细胞因子和TNFR1、TNFR2、LTβR、CD40、DR3、DR4、DR5等受体。
这些成员多为跨膜蛋白,其中有些成员具有多个结构域,如TNF-α和LT-α,有N-端内寡肽、C-端胞外结构域和一个胞内结构域。
TNF家族成员在不同细胞类型中表达,并且它们通常以多种形式表达,如细胞膜结合型、溶解型和可溶性形式。
这种多样性的表达方式进一步拓展了TNF家族成员的功能。
TNF家族成员通过与其对应的受体结合,触发一系列下游信号通路,从而调节多个生理和病理过程。
TNF受体家族包括两类受体:死亡受体(Death Receptors, DRs)和非死亡受体(Non-Death Receptors, NDRs)。
死亡受体包括TNFR1、DR3、DR4和DR5,它们的激活可通过配体结合介导的聚集形成受体复合物,进而激活下游信号通路,最终导致细胞凋亡。
非死亡受体包括TNFR2、CD40、LTβR等,它们在受体激活后会触发不同的信号通路,如NF-κB、MAPK和JNK等途径,从而参与调节免疫应答、炎症反应等。
TNF家族在免疫应答中发挥重要作用。
例如,TNF-α作为重要的炎症介质,可促进炎症反应的发生和维持,并激活吞噬细胞等免疫细胞;CD40L是活化T细胞表面的分子,与CD40结合后可激活B细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞,进而参与体液免疫和细胞免疫过程;LTα和LTβ在淋巴结器官的形成中起重要作用。
肿瘤坏死因子偏高的原因引言肿瘤坏死因子(TNF)是一种重要的细胞因子,它在炎症、免疫和肿瘤发生中起着重要作用。
然而,当肿瘤坏死因子的水平异常增高时,可能会引发一系列健康问题。
本文将探讨肿瘤坏死因子偏高的原因,并对其影响进行全面、详细、完整且深入地分析。
肿瘤坏死因子的作用肿瘤坏死因子是一种由多种细胞产生的细胞因子,包括巨噬细胞、T细胞和B细胞等。
它在炎症反应、免疫应答和肿瘤发生中发挥重要作用。
肿瘤坏死因子主要有两种形式:TNF-α和TNF-β。
它们通过结合细胞表面的受体,如TNFR1和TNFR2,来发挥作用。
TNF-α主要由巨噬细胞和T细胞产生,而TNF-β则主要由淋巴细胞产生。
肿瘤坏死因子在炎症反应中起着重要作用。
它能够引起血管内皮细胞的活化,导致炎症细胞的浸润。
此外,肿瘤坏死因子还能够诱导一系列炎症相关的细胞因子的产生,如白细胞介素1(IL-1)和白细胞介素6(IL-6),从而加剧炎症反应。
肿瘤坏死因子在免疫应答中也起着重要作用。
它能够促进巨噬细胞和其他免疫细胞的活化,增强它们对病原体的杀伤作用。
此外,肿瘤坏死因子还能够促进T细胞和B细胞的增殖和分化,从而增强免疫应答。
肿瘤坏死因子在肿瘤发生中也发挥重要作用。
它能够直接杀伤肿瘤细胞,并通过诱导细胞凋亡的方式抑制肿瘤生长。
此外,肿瘤坏死因子还能够诱导血管生成,从而促进肿瘤的生长和转移。
肿瘤坏死因子偏高的原因肿瘤坏死因子的水平异常增高可能是由多种原因引起的。
下面将对其中几个常见的原因进行详细探讨。
1. 炎症反应炎症反应是肿瘤坏死因子水平增高的常见原因之一。
当机体受到感染或损伤时,免疫系统会释放大量的肿瘤坏死因子来应对炎症刺激。
这种情况下,肿瘤坏死因子的产生增加,从而导致其水平升高。
2. 自身免疫性疾病自身免疫性疾病是指机体的免疫系统错误地攻击自身组织和器官。
在自身免疫性疾病中,免疫系统会释放过多的肿瘤坏死因子,导致其水平升高。
例如,类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等疾病都与肿瘤坏死因子的水平升高相关。
小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的:本试剂盒用于测小鼠血清,血浆及相关液体样本中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。
实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。
用纯化的小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α(TNF-α),再与HRP标记的肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度。
试剂盒组成:注意事项:1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。
3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4.请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。
5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物请避光保存。
7.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9.本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。
操作步骤1.标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品100μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
Mouse TNF-α ELISA Kit产品编号 产品名称包装 PT512Mouse TNF-α ELISA Kit96次产品简介:碧云天的Mouse TNF-α ELISA Kit (Mouse Tumor Necrosis Factor-α Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit),即小鼠肿瘤坏死因子-α酶联免疫吸附检测试剂盒,是一种用于特异性地高灵敏地定量检测小鼠血清、血浆、细胞或组织裂解液、或细胞培养上清液中的TNF-α的试剂盒。
本产品检测灵敏度高,特异性强,重复性好。
多次重复检测结果表明,最小检出量为30.8pg/ml ,与人TNF-α、sTNF RIs 、TNF RII 等均没有交叉反应,板内、板间变异系数均小于10%。
TNF-α,即TNF 、TNF α或TNFalpha ,也称cachectin 、cachexin 或TNFSF1A 。
TNF-α由巨噬细胞、上皮细胞等多种细胞在细菌感染、内毒素刺激、病毒或寄生虫感染时产生。
肿瘤坏死因子超家族(Tumor necrosis factor superfamily)共约19个成员,包含由巨噬细胞等产生的TNF-α和T 淋巴细胞产生的TNF-β(也称Lymphotoxin-alpha),以及FASL 、TRAIL 、CD40L 、CD27L 、CD30L 等。
TNF-α与TNF-β在结构上有一定的相似性,并且在氨基酸水平有28%的同源性,它们拥有共同的受体TNFR1和TNFR2。
由于TNF-α的生物学活性占TNF 总活性的70%~95%,因此目前常说的TNF 多指TNF-α。
TNF (Tumor Necrosis Factor)因为能诱导细胞死亡而得名,实际上其很多时候诱导的细胞死亡为细胞凋亡。
人TNF-α有两种形式,一种是由233个氨基酸组成的跨膜蛋白同源三聚体(homotrimers),另外一种是该跨膜蛋白在TNF-α转化酶TACE(TNF-α converting enzyme)的作用下切除信号肽,形成成熟的157个氨基酸的可溶性TNF-α单体(分子量为17KDa)的同源三聚体。
肿瘤坏死因⼦基本简介肿瘤坏死因⼦(TNF)是⼀种由巨噬细胞对细菌感染或其他免疫源反应⾃然产⽣的细胞因⼦。
是由巨噬细胞分泌的⼀种⼩分⼦蛋⽩。
是⼀类能直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因⼦。
肿瘤坏死因⼦与⼲扰素协同作⽤可杀死肿瘤细胞。
根据其来源和结构不同分为两种类型,即TNF-α和TNF-β。
前者主要由巨噬细胞产⽣,LPS是诱导其产⽣的较强刺激剂,T细胞和NK细胞在某些刺激因⼦(如PMA)作⽤下也可分泌TNF-α;后者主要由活化T细胞产⽣,T细胞在抗原、丝裂原等刺激下可产⽣⾼⽔平的TNF-β。
TNF-β原称淋巴毒素(1ymphotox-in,LT)。
肿瘤坏死因⼦TNF-α主要由单核-巨噬细胞分泌;TNF-β主要由活化的T淋巴细胞分泌,两者有相似致热性。
⼩剂量呈单峰热,⼤剂量呈双峰热;TNF在体内外均能刺激IL-1的产⽣。
不耐热,70℃30min失活。
1975年Carswell等发现接种BCG的⼩⿏注射LPS后,⾎清中含有⼀种能杀伤某些肿瘤细胞或使体内肿瘤组织发⽣⾎坏死的因⼦,称为肿瘤坏死因⼦。
1985年Shalaby把巨噬细胞产⽣的TNF 命名为TNF-α,把T淋巴细胞产⽣的淋巴毒素(lymphotoxin,LT)命名为TNF-β。
TNF-α⼜称恶质素。
基本信息药物类别:抗肿瘤药所属类别:⽣物反应调节剂药物名称:肿瘤坏死因⼦产⽣过程⼤量蛋⽩质本质的肿瘤坏死因⼦(1)TNF-α是⼀种单核因⼦,主要由单核细胞和巨噬细胞产⽣,LPS是较强的刺激剂。
IFN-γ、M-CSF、GM-CSF对单核细胞/巨噬细胞产⽣TNF-α有刺激作⽤,⽽PGE则有抑制作⽤。
前单核细胞系U937、前髓细胞系HL-60在PMA刺激下可产⽣较⾼⽔平的TNF-α。
T淋巴细胞、T细胞杂交瘤、T淋巴样细胞系以NK细胞等在PMA刺激下也可分泌TNF-α。
SAC、PMA、抗IgM可刺激正常B细胞产⽣TNF-α。
此外,中性粒细胞、LAK、星状细胞、内⽪细胞、平滑肌细胞亦可产⽣TNF-α。
肿瘤坏死因子正常参考范围全文共四篇示例,供读者参考第一篇示例:肿瘤坏死因子(TNF)是一种由免疫细胞产生的蛋白质,是机体的重要炎症介质之一。
TNF存在于体内的主要两个亚型为TNF-α和TNF-β,其中TNF-α是最为广泛研究的亚型。
TNF-α主要由巨噬细胞、淋巴细胞、树突细胞等免疫细胞分泌,以及一些非免疫细胞如肿瘤细胞、血管内皮细胞等也可产生TNF-α。
TNF-α的主要作用是发挥促炎效应,同时也具有调节免疫反应、调节细胞增殖凋亡等功能。
肿瘤坏死因子的异常水平与多种疾病的发生、发展密切相关。
TNF-α过高或过低的表达都可能导致机体的免疫应答紊乱,从而引起免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等多种疾病的发生。
监测肿瘤坏死因子的水平是临床诊断和治疗重要的一环。
肿瘤坏死因子正常参考范围则是指肿瘤坏死因子在健康人群中的典型范围。
由于不同的实验室、不同的测量方法可能有所不同,因此肿瘤坏死因子的正常参考范围会存在一定的差异。
一般来说,正常人群中肿瘤坏死因子的水平较低,在健康成年人血清中,TNF-α的正常水平一般在2-20pg/mL之间。
在特定疾病状态下,肿瘤坏死因子的水平可能出现异常。
在炎症性疾病如类风湿关节炎、炎症性肠病等中,TNF-α的水平常常明显升高;而在某些感染性疾病、免疫相关性疾病、恶性肿瘤等中,TNF-α的水平也可能发生变化。
对于某些疾病的诊断和疗效监测,监测肿瘤坏死因子的水平具有一定的临床意义。
肿瘤坏死因子在体内的浓度受到多种因素的影响。
除了疾病状态外,情绪、环境、生活方式、饮食等也可能对肿瘤坏死因子的水平产生影响。
在进行肿瘤坏死因子水平检测时,需要综合考虑患者的临床情况和全面评估。
肿瘤坏死因子正常参考范围是指在一般健康人群中,肿瘤坏死因子的典型水平范围。
监测肿瘤坏死因子的水平对于一些炎症性疾病、感染性疾病、免疫相关性疾病的诊断和治疗具有一定的帮助。
了解肿瘤坏死因子的正常参考范围,在临床实践中也能为医生提供参考,有助于更准确地评估患者的健康状况和疾病状态。
小鼠肿瘤组织中tnfa含量-回复小鼠肿瘤组织中的TNF-α含量是指小鼠体内的肿瘤块组织中是否存在或者表达着一种名为肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)的蛋白质。
TNF-α是一种重要的炎症介质,参与了许多炎症反应和免疫调节过程。
研究小鼠肿瘤组织中的TNF-α含量可以帮助我们了解其在肿瘤生长和免疫反应中的作用机制。
第一步:什么是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)肿瘤坏死因子-α是一种由免疫细胞(如白细胞和巨噬细胞)合成并释放的蛋白质,可以分泌到体内循环系统中或局部组织中。
TNF-α对细胞具有多种作用,例如促进免疫细胞的活化、诱导炎症反应、调节细胞生长和凋亡等。
在炎症反应中,TNF-α可以招募免疫细胞到达炎症部位,促进炎症反应的发生和发展。
除了免疫调节作用外,TNF-α还被发现在肿瘤发生、生长和转移过程中发挥了重要作用。
第二步:研究小鼠肿瘤组织中TNF-α含量的意义研究小鼠肿瘤组织中的TNF-α含量可以帮助我们了解其在肿瘤生长和免疫反应中的作用机制。
首先,肿瘤细胞可以释放TNF-α来引起炎症反应,进而招募免疫细胞到达肿瘤组织中,形成细胞浸润。
这些免疫细胞可以通过吞噬肿瘤细胞或者释放细胞毒素的方式来抑制肿瘤的生长。
因此,肿瘤组织中TNF-α的含量可能与肿瘤的体积、生长速度以及预后等有关。
其次,肿瘤组织中的TNF-α还可以直接作用于肿瘤细胞,影响其增殖、凋亡和迁移等生物学过程。
一些研究发现,TNF-α可以通过激活其受体信号通路,诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤的生长。
然而,TNF-α过度的表达也可能导致肿瘤细胞产生更多的炎症因子,形成更多的血管和免疫逃逸机制,促进肿瘤的生长和转移。
第三步:如何研究小鼠肿瘤组织中TNF-α含量研究小鼠肿瘤组织中TNF-α含量一般可以通过以下实验方法来进行:1.酶联免疫吸附实验(ELISA):ELISA是一种常用的实验方法,可以定量测定细胞培养上清液或动物体内液体中的目标蛋白质。
肿瘤坏死因子正常参考范围-概述说明以及解释1.引言1.1 概述肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF) 是一种由人体细胞产生的细胞因子,它在免疫系统中发挥着重要的调节作用。
TNF 是一种既能够促进炎症反应,又能够调节细胞生命周期和信号转导途径的多功能蛋白质。
近年来,研究表明TNF在许多重要疾病的发展中起着关键作用,如癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病等。
TNF的产生受到多种因素的调控,包括免疫细胞的激活、细胞凋亡和炎症反应等。
在正常情况下,TNF的水平是细致平衡的,对机体的正常生理过程起到重要作用。
然而,在某些疾病状态下,TNF的水平可出现异常升高或降低,从而导致疾病的发生和发展。
因此,对于肿瘤坏死因子正常参考范围的研究具有重要意义。
了解TNF 的正常水平范围,可以为临床医生提供参考依据,帮助他们准确判断患者是否存在TNF的异常水平,进一步评估疾病的严重程度,制定个体化的治疗方案。
未来的研究方向可以进一步深入探究TNF与其他细胞因子之间的相互作用关系,进一步探索TNF在不同疾病中的作用机制。
此外,我们还可以开展更多的临床研究,探索TNF在特定疾病中的临床应用潜力,以便为患者提供更好的治疗方案。
综上所述,肿瘤坏死因子正常参考范围的研究对于深入了解TNF的生理作用和相关疾病的发展具有重要意义。
通过进一步的研究和探索,我们有望为临床医生提供更准确、更有效的诊断和治疗策略,从而提高患者的生存质量和生活水平。
文章结构部分的内容可以写成以下形式:1.2 文章结构本文将分为三个主要部分进行描述,具体如下:第一部分为引言部分,主要包括概述、文章结构和目的等内容。
在概述中,将对肿瘤坏死因子进行简要介绍,引发读者的兴趣。
接着,详细阐述文章的结构,说明各部分的内容和组织安排。
最后,明确本文的目的,即探讨肿瘤坏死因子正常参考范围的意义以及未来的研究方向。
第二部分是正文部分,主要包括肿瘤坏死因子的定义和功能、以及肿瘤坏死因子的生理作用。
本试剂盒只能用于科学研究,不得用于医学诊断小鼠(Mouse)肿瘤坏死因子β(TNF-β)ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。
往预先包被肿瘤坏死因子β(TNF-β)抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子β(TNF-β)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪(450nm)2.高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃,使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶,这属于正常现象,水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中,密封(低温干燥)保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白;按照说明书操作时样本已经稀释5倍,最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注:标准品(S0-S5)浓度依次为:0、15、30、60、120、240pg/mL试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法1.手工洗板:甩尽孔内液体,每孔加满洗涤液,静置1min后甩尽孔内液体,在吸水纸上拍干,如此洗板5次。
2.自动洗板机:每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
操作步骤1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;3.样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。
4.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断绘制标准曲线:在Excel工作表中,以标准品浓度作横坐标,对应OD值作纵坐标,绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算各样本浓度值。
试剂盒性能1.准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值,大于等于0.9900。
2.灵敏度:最低检测浓度小于1.0pg/mL。
3.特异性:不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性:板内、板间变异系数均小于15%。
5.贮藏:2-8℃,避光防潮保存。
6.有效期:6个月免责声明1.试剂盒仅供研究使用,不得用于临床实验或人体实验,否则所产生的一切后果,由实验者承担,本公司概不负责。
2.严格按照说明书操作,实验者违反说明书操作,后果由实验者承担。
FOR RESEARCH USE ONLY.NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.Mouse Tumor necrosis factorβ(TNF-β)ELISA KitinstructionIntended useThis TNF-βELISA kit is intended Laboratory for Research use only and is not for use in diagnostic or therapeutic procedures.The Stop Solution changes the color from blue to yellow and the intensity of the color is measured at450nm using a spectrophotometer.In order to measure the concentration of TNF-βin the sample, this TNF-βELISA Kit includes a set of calibration standards.The calibration standards are assayed at the same time as the samples and allow the operator to produce a standard curve of Optical Density versus TNF-βconcentration.The concentration of TNF-βin the samples is then determined by comparing the O.D.of the samples to the standard curve.Sample collection and storagesSerum-Use a serum separator tube and allow samples to clot for30minutes before centrifugation for10minutes at approximately3000×g.Remove serum and assay immediately or aliquot and store samples at-20℃or-80℃.Avoid repeated freeze-thaw cyclesPlasma-Collect plasma using EDTA or heparin as an anticoagulant.Centrifuge samples for30minutes at3000×g at2-8℃within30minutes of collection.Store samples at-20℃or-80℃.Avoid repeated freeze-thaw cycles.Cell culture supernates and other biological fluids-Remove particulates by centrifugation and assay immediately or aliquot and store samples at-20℃or -80℃.Avoid repeated freeze-thaw cycles.Note:The samples shoule be centrifugated dequately and no hemolysis or granule was allowed.Materials required but not supplied1.Standard microplate reader(450nm)2.Precision pipettes and Disposable pipette tips.3.37℃incubatorPrecautions1.Do not substitute reagents from one kit to another.Standard,conjugate and microplates are matched for optimal e only the reagents supplied by manufacturer.2.Do not remove microplate from the storage bag until needed.Unused strips should be stored at2-8°C in their pouch with the desiccant provided.3.Mix all reagents before using.Remove all kit reagents from refrigerator and allow them to reach room temperature (20-25°C)Materials suppliedName 96determinations48determinations Microelisa stripplate12*8strips12*4stripsStandard0.3ml*6tubes0.3ml*6tubesSample Diluent 6.0ml 3.0mlHRP-Conjugate reagent10.0ml 5.0ml20X Wash solution25ml15mlChromogen Solution A 6.0ml 3.0mlChromogen Solution B 6.0ml 3.0mlStop Solution 6.0ml 3.0mlClosure plate membrane22User manual11Sealed bags11Note:Standard(S0→S5)concentration was followed by:0,15,30,60,120,240 pg/ml.Reagent preparation20×wash solution:Dilute with Distilled or deionized water1:20.Assay procedure1.Prepare all re a g e n t s before starting assay procedure.It is recommended that all Standards and Samples be added in duplicate to the Microelisa Stripplate.2.Add standard:Set Standard wells,testing sample wells.Add standard50μl to standard well.3.Add Sample:Add testing sample10μl then add Sample Diluent40μl to testing sample well;Blank well doesn’t add anyting.4.Add100μl of HRP-conjugate reagent to each well,c over with an adhesive strip and incubate for60minutes at37°C.5.Aspirate each well and wash,repeating the process four times for a total of five washes.Wash by filling each well with Wash Solution(400μl)using a squirt bottle, manifold dispenser or plete removal of liquid at each step is essential to good performance.After the last wash,remove any remaining Wash Solution by aspirating or decanting.Invert the plate and blot it against clean paper towels.6.Add chromogen solution A50μl and chromogen solution B50μl to each well. Gently mix and incubate for15minutes at37°C.Protect from light.7.Add50μl Stop Solution to each well.The color in the wells should change from blue to yellow.If the color in the wells is green or the color change does not appear uniform,gently tap the plate to ensure thorough mixing.8.Read the Optical Density(O.D.)at450nm using a microtiter plate reader within15minutes.Calculation of results1.This standard curve is used to determine the amount in an unknown sample.The standard curve is generated by plotting the average O.D.(450nm) obtained for each of the six standard concentrations on the vertical(Y)axis versus the corresponding concentration on the horizontal(X)axis.2.First,calculate the mean O.D.value for each standard and sample.All O.D.values,are subtracted by the mean value of the zero standard before result interpretation.Construct the standard curve using graph paper or statistical software.3.To determine the amount in each sample,first locate the O.D.value on theY-axis and extend a horizontal line to the standard curve.At the point of intersection,draw a vertical line to the X-axis and read the corresponding concentration.4.Any variation in operator,pipetting and washing technique,incubation time ortemperature,and kit age can cause variation in result.Each user should obtain their own standard curve.5.The sensitivity by this assay is1.0pg/ml6.Standard curveStorage:2-8℃.validity:six months.FOR RESEARCH USE ONLY;NOT FOR THERAPEUTIC OR DIAGNOSTIC APPLICATIONS!PLEASE READ THROUGH ENTIRE PROCEDURE BEFORE BEGINNING!。