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生物化学实验示范报告:实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化实验目的:1．掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法；2．掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理；3．掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法；4．巩固并熟练掌握Folin法测定牛血清蛋白和3、5 -二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法，并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。
实验原理：蔗糖酶分离提纯原理：酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破碎细胞壁、再用乙醇分级和DEAE—纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。
酶分离提纯的原理与蛋白质的相同。
但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活；随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。
有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（32％的乙醇饱和度沉淀分离杂蛋白，47.5％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白）。
操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓；分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶），确保酶的活性；pH多选在酶蛋白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。
蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理：本实验采用DEAE-纤维素（DEAE-C11）微粒状的、弱碱性的阴离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。
它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。
蔗糖酶活力与比活的测定：在蔗糖酶的纯化过程中，通过3、5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离 DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
. . . . 实验报告课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：实验名称： 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 同组学生： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理；2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术；3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。
二、实验容和原理（1）实验原理 1、离子交换层析：以离子交换剂为固定相，液体为流动相进行。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
这些过程都是可逆的。
在某一pH 值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。
当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。
离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。
基质 电荷基团 反离子 电荷基团反离子电荷基团反离子基质基质—＋—＋＋可逆交换可逆交换＋＋溶液中的离子（交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖)— ——阳离子交阴离子交换剂专业： 农业资源与环境姓名： 李佳怡学号： 3130100246 日期： 2015.5.19地点： 生物实验中心310装订线由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的目的。
2、酶活力检测(定性检测）蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），能催化非还原性双糖（蔗糖）裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。
实验报告一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 七、实验讨论和心得二、实验内容和原理 四、实验方法和步骤 六、实验结果和分析一、实验目的和要求1、学习离子交换层析的基本原理2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法二、实验内容和原理1、离子交换层析由于蔗糖酶的pI 偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中，粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷，因此我们用阴离子交换剂可以先与蔗糖酶样品可逆交换吸附，然后通过用盐离子强度逐渐提高的洗脱液，使蔗糖酶和其他杂蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，把不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，从而达到分离蔗糖酶的目的。
2、酶活力检测蔗糖酶是一种水解酶，它能蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。
（50℃水解） 3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。
（100℃显色）三、实验材料和主要仪器1、实验材料蔗糖酶粗分离纯化（溶解即为样品Ⅲ） 2、实验试剂⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液⑶ 20mmol/L Tris-HCl （1mol/L NaCl ）pH7.3缓冲液 ⑷ 0.2mol/L 乙酸缓冲液，pH4.5 ⑸ 5%蔗糖溶液⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 3、实验仪器（1）高速冷冻离心机（2）层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）（3）ÄKTA TM start（1套/组）（4）部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组）（5）－20℃冰箱（保存样品用）（6）微量移液枪 200ul、1000ul（7）1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）（8）7ml离心管（留样品Ⅳ用）（9）恒温水浴（50℃、100℃）（10）试管、移液管、试管架等四、实验方法和步骤1、仪器连接（1）接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置A，B两个溶液瓶中。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解反应的酶，广泛存在于生命体内，具有重要的应用价值。
本文主要介绍了蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测方法。
一、蔗糖酶的提取1、选择合适的菌株：蔗糖酶广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体中，但不同菌株对蔗糖酶的产生能力存在差异，因此需要根据实际需求选择产酶能力较高的菌株。
2、液态培养：选用适宜的培养基和培养条件，促进菌株生长和蔗糖酶的合成。
一般情况下，最佳培养条件为温度在35℃左右，pH值为7.0左右，培养时间为24-48小时。
3、离心沉淀：将菌液离心，取上清液即为蔗糖酶提取液。
1、离子交换层析：通过调节液相pH值，利用离子交换材料对蔗糖酶进行吸附、洗脱和分离。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶材料对蔗糖酶进行筛分，分离出不同分子量的蔗糖酶。
3、亲和层析：在固相材料上引入亲和基团，用于特异性地吸附蔗糖酶，洗脱和分离目标蛋白。
1、透析：通过半透膜对蔗糖酶真空透析，去除杂质。
2、浓缩：利用超滤膜对蔗糖酶进行浓缩。
3、电泳：运用电泳等方法对混合蛋白进行分离和分析，以实现蔗糖酶的纯化。
蔗糖酶的活性检测方法多种多样，以下介绍其中几种常见的方法。
1、邻苯二甲酸法：通过对邻苯二甲酸恒量反应条件下，测量比色产物的吸光度来检测蔗糖酶的活性。
2、甲酚磺酸法：测量甲酚磺酸转化为带电离子的速率，来判断蔗糖酶活性的多少。
3、蔗糖酶显色法：在蔗糖酶的作用下，蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，再利用淀粉-碘酒作为指示剂，显色程度来反映蔗糖酶的活性。
总结：蔗糖酶是一种重要的酶类，在生命科学和工业生产等领域具有广泛应用。
其提取、分离、纯化及活性检测方法多种多样，需要根据不同的实验条件和需求来选择合适的方法。
