GST_pull_down试验方法(自己总结)

GST-pull down 实验一、实验所需试剂及配制：1、LB培养基成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）Y east Extract1%（W/V）NaCl（1）称取下列试剂，置于1L烧杯中：Tryptone 10 g；Y east Extract 步骤：5 g；NaCl 10 g（2）加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解（3）滴加NaOH调节PH值至7.0-7.2（注：1L培养基约需5 MNaOH 1 ml）（4）加去离子水定容至1L（5）高温高压灭菌后，4 ℃保存。

2、LB/Amp 培养基配制成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）Y east Extract1%（W/V）NaCl0.1 mg/ml Amp（氨苄青霉素）步骤：（1）--（5）同上（6）高压后，温度降至60 ℃以下，加入1L Amp（100 mg/ml）后均匀混合，4 ℃保存。

（注：高压后直接加入，温度过高易使抗生素灭活）3、Amp （100 mg/ml）配制：步骤：（1）称量5 g Amp置于50 ml离心管中（2）加入40 ml 灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml（3）用0.22 um过滤膜过滤除菌（4）小分分装（1 ml/分）后，-20 ℃保存。

4、LB固体培养基配制：成分：1%（W/V）Tryptone5%（W/V）Y east Extract1%（W/V）NaCl15 g/L 琼脂糖粉步骤：（1）同LB培养基称取上述试剂充分混匀后并调PH值（2）高压灭菌后，等待培养基冷却至50-60 ℃，加入抗生素，摇匀（3）超净台中均匀铺板，待冷却凝固后，4 ℃密封保存（注：每个板子大约需要25 ml培养基）二、目的质粒转化大肠杆菌、菌种挑取及保存（一）转化1、-80 ℃冰箱中取感受态细菌（15 ul），冰上解冰。

2、加入质粒DNA溶液（5 ul），轻摇匀，冰上放置30 min。

3、42 ℃水浴中热击45s，促使细菌吸收质粒，热击后迅速置于冰浴冷却2 min。

gst-pull down 鉴定蛋白纯化结果
GST pull down（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。

其鉴定蛋白纯化结果的原理如下：
- 利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合；
- 融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合；
- 将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定时间；
- 洗去未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳。

通过观察电泳结果，可以分析出蛋白间的互作关系，从而鉴定蛋白纯化结果。

GSTPullDown（以Rac1活性检测为例）（原创）1、⽤GST-PAK-CRIB融合蛋⽩载体转化BL21感受态细菌，37℃培养过夜，12-16h之后出现菌
落；
2、挑取阳性单克隆，接种到含有抗⽣素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中剧烈振摇⾄菌
液OD600值在0.4-0.6之间时，加⼊IPTG 0.1mmol/L诱导，继续孵育3-4h，离⼼，收集菌体（可
以-70℃保存备⽤）；
3、加⼊2 ml细菌裂解液（含蛋⽩酶抑制剂），重新悬浮菌体，冰上振荡15 min；
4、12000 rpm离⼼10 min，取上清；
5、向上清中加⼊100 µl的含有⾕胱⽢肽的琼脂糖磁珠（⽤之前需⽤washing buffer洗涤3
次），4℃旋转混合⾄少30min，再⽤washing buffer洗3次；
6、从培养的细胞中提取全蛋⽩，取蛋⽩200µg，与上述琼脂糖磁珠混合，⽤washing buffer 补
⾜300 µl，4℃旋转孵育⾄少1 h，⽤于沉淀细胞中的⽬的蛋⽩，（注：此步反应的温度和孵育时
间均需根据不同的的蛋⽩进⾏优化，孵育的最后阶段进⾏略微的涡旋震荡能够去掉⾮特异性结
合的蛋⽩，降低背景）；
7、⼩⼼移去上清，⽤400 µl washing buffer 洗3-5次，第⼀次可室温孵育5 min，并在孵育过程
中偶尔进⾏混匀；
8、向琼脂糖磁珠中加⼊30 µl 2×SDS-PAGE加样缓冲液，沸⽔浴5 min，直接加样进⾏SDS-
PAGE蛋⽩电泳；
9、以下实验操作同westernblotting（见前天实验流程）。

GST Pulldown（研究GST-CDC-48与Rpn11相互作用）1、取两只1.5mL EP管，标记为实验组和对照组，并向每支管中分别加入25μL GST-beeds 20%乙醇充分混合液。

2、加入Wash buffer 1 洗涤两次，每次500μL，5000rpm，4℃离心30s去除上清液。

Wash buffer 配比如下：Tris-HCL 50 mMNaCL 100mMTriton X 100 0.1%DTT 1mMpH 7.5注意：操作轻柔，避免beeds的损失；超纯水清洗注射器避免交叉污染。

3、分别在对照组和实验组中加入等物质量的GST（25kD）蛋白和GST-cdc48（130kD）蛋白,其中GST蛋白为20μg，GST-cdc48蛋白为20*（130/25）=104μg。

4、使用Buffer 1 调整上述反应体积为300μL，4℃慢摇孵育1h。

5、5000rpm，4℃离心30s去除上清液。

6、对照组和实验组分别加入5倍摩尔数的Rpn11蛋白，Rpn11蛋白的量为20*（51/25）*5=200μg。

7、使用Buffer 1 调整上述反应体积为300μL，4℃慢摇孵育1h。

8、5000rpm，4℃离心30s去除上清液。

9、使用Wash buffer 1 洗涤三次，每次500μL，操作如前。

换用500μL Wash buffer 2再洗涤一次，彻底吸除buffer。

Wash buffer 2 配比如下：Tris-HCL 50 mMNaCL 100mMDTT 1mMpH 7.510、再往对照组和实验组分别加入30μL 2×SDS PAGE loading buffer，混匀，沸水煮5min。

12000rpm离心三分钟，取10μL点样跑小孔聚丙烯酰胺凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶泳道图如下。

11、其中Input上样量为GST-pulldown 的1/5.。

GST-pull down 技术一大量制备GST蛋白1 活化冻存菌种GST和GST-X：按1：50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋），37℃，140~150rpm培养过夜2 将过夜培养物按1：100比例接入200mlＬＢ（Ａｍｐ＋），220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.63 以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白。

（IPTG 0.5mM，20℃,150rpm 培养10~16小时）4 诱导适当时间后，4℃，5000g离心10min后弃上清。

（如需要该步沉淀能保存在-80℃）5 重悬沉淀：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬6 冰上超声沉淀重悬液：2S 间隔1S 至悬液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声６～９min可透明）7 10,000g*10min离心上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L二谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理1 轻轻颠倒树脂盛装容器，混成匀浆2 取适量匀浆放入离心管中，4℃，500g离心5min后弃上清（每10ml 细菌培养物可以用50ul匀浆）3 每1.33mL 初始匀浆加入10 mL 4℃预冷的PBS，颠倒混匀后，4℃，500g离心5min后弃上清（50ul初始匀浆用400ulPBS洗）4 每1.33mL 初始匀浆加入1 mL 冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒混匀置冰上放置待用。

（50ul初始匀浆加入40ulPBS）三结合GST蛋白1 上清与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，4℃轻摇30min（可过夜让其充分结合）。

2 4℃，500g离心5min后弃上清3 沉淀加入10倍床柱体积PBS（1床柱体积=0.5*50%匀浆体积）(50ul初始匀浆用400ulPBS 洗），颠倒混匀以洗去未与树脂结合的杂蛋白（每次可在混旋仪上混匀５min)4 4℃，５00g离心5min后弃上清5 重复步骤3和4两次，共三次四预清除细胞裂解液1 将细胞裂解液与50ul的和GST结合的50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂悬液在4℃翻转混合孵育2h。

pull-down⽅法步骤汇总GST-Pull down:1) 利⽤纯化好的蛋⽩进⾏GST-Pull down 实验操作。

2) 实验设置2 个组合，第⼀个是实验组(90 µl BP-His +90 µl BRM(689-952aa)-GST)，第⼆个是负对照组(90 µl BP-His + 10 µl GST)，分别在1.5 ml 的离⼼管中混合均匀。

3) 加⼊1 ml binding buffer，充分混合均匀，冰箱内30 rpm 旋转⾄少2h。

4) 加⼊30 µl GST-Bind TM Resin，冰箱内30 rpm 旋转⾄少2 h。

，100 g 离⼼ 2 min，弃去上清。

6) 加⼊1 ml binding buffer，冰箱内30 rpm 旋转5 min 进⾏洗涤，然后，100 g 离⼼ 2 min，弃去上清。

重复 5 次。

7) 加⼊40 µl 5×SDS-PAGE loading buffer，煮沸5 min，12000 g，离⼼30 sec，吸取上清点样进⾏SDS-PAGE 电泳。

8) 12 %的SDS-PAGE 胶，120 V 电泳90 min。

9) 转膜，使⽤PVDF 膜，使⽤前⽤甲醇浸泡10 min，350 mA 电流转膜2h。

10) ⽤5 %的脱脂⽜奶封闭膜，60 rpm，1 h。

11) 加⼊⼀抗(20 ml 5 %的脱脂⽜奶+5 µl anti-His)，60 rpm，1 h。

12) 倒掉⼀抗，加⼊10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。

13) 加⼊⼆抗(20 ml 5 %的脱脂⽜奶+5 µl Goat anti- mouse IgG(H+L) HRP conjugate)，60 rpm，1 h。

14) 倒掉⼆抗，加⼊10 ml western blotting wash buffer，60 rpm，10 min，重复3 次。

实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。

用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST (Glutathione S transferase)融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH( Glutathione )亲和结合。

因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离试齐U： NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Trit on-100 , IPTG(Merck 分装)，PMSF( Amersco)，Cocktaier ( Merck 539134 ), Immobilized Glutathione ( PIERCE 15160 )实验操作程序：材料及试剂探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS 及PBS+1%Triton-100PBS (1L)NaCl : 8gKCl : 0.2gNa2HPO4: 1.44gKH2PO4 : 0.24g加入800ml蒸馏水，用HCI调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！ 4 C保存备用！PMSF(苯甲基磺酰氟)MW:174.19工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM , 将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20 C或者4C(以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用)1:原核融合蛋白A的获得1.1 :将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37C培养过夜1.3:将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37C, 225rpm培养至OD60B 1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间(诱导条件需要根据不同的蛋白做调整).6000g, 10分钟，4C离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20 C 放置O/N1.4 :室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液 (PBS+1%Triton-100+PMSF ),吹打混匀1.5:冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。

gstpull down实验原理GSTP（Global Software Test Platform）是一种基于客户端-服务器架构的软件测试平台，它可以实现分布式测试、自动化测试以及测试工具的集成。

GSTP的核心技术之一就是GSTPull Down实验原理。

GSTPull Down实验原理是GSTP中的一种测试方法，用于模拟客户端请求与服务器响应的交互过程。

通过这种方法，可以对服务器的性能、稳定性和负载能力进行评估和验证。

在GSTP中，GSTPull Down实验原理的主要步骤包括：构建测试用例、模拟客户端请求、发送请求到服务器、接收服务器响应、分析响应结果。

下面将对这些步骤进行详细描述。

构建测试用例是GSTPull Down实验原理的第一步。

测试用例是为了模拟真实的客户端请求，通常包括请求的类型、参数、路径等信息。

测试用例的设计要尽可能地贴近真实的使用场景，以保证测试结果的准确性。

接下来，通过模拟客户端请求，将测试用例发送到服务器。

在GSTP中，可以使用自定义的脚本或工具来实现请求的发送。

这些工具可以模拟不同的网络环境、请求频率和负载情况，从而对服务器的性能和稳定性进行全面测试。

服务器接收到客户端的请求后，会进行相应的处理，并生成相应的响应结果。

GSTP会将服务器的响应结果返回给测试者，以方便对响应结果进行分析和评估。

在分析响应结果时，可以根据预先设定的评估指标对服务器的性能进行评估。

评估指标可以包括响应时间、并发数、吞吐量等。

通过分析这些指标，可以了解服务器在不同负载下的性能表现，并找出潜在的性能瓶颈。

通过GSTPull Down实验原理，测试者可以对服务器的性能和稳定性进行全面的评估。

它可以帮助测试者发现服务器的性能瓶颈，优化服务器的配置和性能，提高服务器的负载能力。

GSTPull Down实验原理是GSTP中的一种测试方法，通过模拟客户端请求和服务器响应的交互过程，对服务器的性能和稳定性进行评估和验证。

gstpulldown实验技术汇报人：2023-12-25•实验简介•材料准备•实验操作目录•结果分析•实验结论01实验简介验证已知的蛋白质相互作用gstpulldown实验可以用于验证已知的蛋白质相互作用，例如验证某个蛋白质是否与特定的结合蛋白相互作用。

发现新的蛋白质相互作用通过gstpulldown实验可以发现新的蛋白质相互作用，从而为研究新的生物学过程和疾病机制提供线索。

确定蛋白质之间的相互作用通过gstpulldown实验可以检测到与特定蛋白质结合的其他蛋白质，从而确定蛋白质之间的相互作用。

蛋白质相互作用gstpulldown实验利用GST（谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白作为诱饵，与细胞或组织提取物中的目标蛋白质进行结合，从而检测到与诱饵蛋白结合的目标蛋白。

分离和纯化通过将GST融合蛋白与谷胱甘肽结合的琼脂糖珠结合，可以分离和纯化与目标蛋白结合的复合物。

检测目标蛋白通过Western blot等技术对分离和纯化的复合物进行检测，从而确定与诱饵蛋白结合的目标蛋白。

实验步骤准备GST融合蛋白和谷胱甘肽结合的琼脂糖珠将GST融合蛋白与琼脂糖珠结合，形成用于捕获目标蛋白的诱饵。

细胞或组织提取从感兴趣的细胞或组织中提取蛋白质混合物。

孵育将细胞或组织提取物与GST融合蛋白结合的琼脂糖珠孵育，使目标蛋白与诱饵蛋白结合。

洗脱和检测洗脱与诱饵蛋白结合的目标蛋白，并利用Western blot等技术进行检测和分析。

02材料准备GST琼脂糖珠磷酸化激酶洗涤液抗体01020304用于绑定目的蛋白，是实验的关键试剂。

用于磷酸化目的蛋白，确保实验的准确性。

用于清洗实验中使用的各种仪器和试剂。

用于检测目的蛋白的表达和磷酸化状态。

离心机用于分离和纯化目的蛋白。

摇床用于孵育实验中的各种反应。

超声波破碎仪用于破碎细胞，释放细胞内的目的蛋白。

凝胶电泳仪和电泳槽用于检测目的蛋白的表达和磷酸化状态。

所需样本细胞或组织样本实验所需的生物样本，需确保其质量和活性。

12.GST蛋白的表达和纯化12.1 GST蛋白的表达（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。

（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。

（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。

（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。

（5) 加入50μl 100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。

（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。

（7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。

（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。

转移至5ml离心管。

（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。

破壁参数：Frequency:100～200w 60s， pause 20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。

加100μl 20% TritonX－100，冰上放置30min。

（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。

（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。

离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。

12.2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry（1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。

（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。

（3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。

反复5次。

（4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。

12.3 GST融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。

GSTPulldown实验流程一、实验准备阶段1.确定实验目的（1）确定进行GSTPulldown实验的目的和研究问题（2）定义所需的实验指标和结果参数2.准备实验材料（1）准备所需的细胞或组织样本（2）提取或购买GST标记的蛋白二、样品处理与制备1.细胞处理（1）处理细胞以获得所需的细胞提取物（2）对细胞提取物进行蛋白浓缩或纯化2.样品制备（1）将GST标记的蛋白与细胞提取物混合（2）进行样品预处理如加入缓冲液等三、GSTPulldown实验1.准备GSH亲和树脂（1）将GSH亲和树脂进行预处理和平衡（2）加入样品到GSH亲和树脂上2.亲和纯化（1）将混合样品与GSH亲和树脂一起孵育（2）清洗亲和树脂以去除非特异性结合物3.Elution（1）使用Elution缓冲液洗脱目标蛋白（2）收集洗脱的蛋白样品并保存四、蛋白分析与检测1.SDSPAGE分析（1）将洗脱的蛋白样品进行SDSPAGE电泳分析（2）观察蛋白条带的大小和清晰度2.Westernblot检测（1）将SDSPAGE分离的蛋白转移至膜上（2）使用特异性抗体进行GST标记蛋白的检测五、数据分析与结果解释1.带图像分析（1）分析SDSPAGE和Westernblot的图像（2）计算目标蛋白的相对含量和表达水平2.结果解释（1）根据实验结果解释GSTPulldown实验的结论（2）分析实验结果与预期结果的一致性和差异六、结果验证与文献探索1.实验验证（1）重复实验以验证结果的可重复性和稳定性（2）进行相关实验以进一步验证结论2.文献探索（1）检索相关文献并对实验结果进行比对和验证（2）吸收和借鉴相关研究的成果，完善研究结论。

GST pull-down1)制备组织裂解液（20000g 离心30min，去除裂解液中的颗粒物），根据定量蛋白浓度及实验设计决定需要预清洗的组织裂解液。

2)清洗GSH-agarose beads：200μl beads 加入2ml裂解液（5mg/ml），4℃500g 离心5min,去上清。

3)预清洗组织裂解液：将清洗后的beads 、20μl GST beads和组织裂解液4℃翻转孵育1h。

4)4℃500g 离心5min，沉淀beads。

5)用新的EP管收集预清洗后的组织裂解液上清。

6)重复预清洗组织裂解液2次，尽量去除组织内源性GST和非特异结合蛋白。

7)20μl GST beads和裂解液孵育2h观察背景深度；背景较深时重复一遍。

8)4℃18000g 离心30min 去除痕量残留的beads。

9)取两份等量preclear后的组织裂解液（约800μl）。

10)加入10μg GST及GST-GSK3βbeads slurry (20μl) 4℃翻转孵育过夜。

11)4℃500g 离心5min，沉淀beads，小心去除大多数上清。

12)将beads和残留的少量裂解液转移到预冷的microspin，4℃1000g离心10 sec。

13)弃收集管中液体，0.5ml wash buffer 2清洗结合管，并将液体转移到microspin。

14)4℃1000g离心10 sec，弃收集管中液体。

15)加预冷的wash buffer 2 0.5ml至microspin，4℃1000g离心10 sec，弃收集管中的液体，重复清洗6次。

16)预冷的wash buffer 3 0.5ml 重复清洗3次。

17)最后一次离心，4℃10000g离心30 sec。

18)加入适量合适分析的1×leammli buffer，煮沸5min洗脱蛋白。

19)18×16cm SDS-PAGE分析，质谱鉴定蛋白。

Wash buffer 220 mM Tris•Cl, pH 7.4 150 mM NaCl0.2% (v/v) Triton X-100Wash buffer 320 mM Tris•Cl, pH 7.4。

一、实验步骤1. 重组蛋白表达与纯化1）将将编码蛋白A的GST标签重组质粒转化到BL21或者Rosetta DE3感受态细胞中。

2）向高压灭菌的锥形瓶中倒入150 ml LB培养基，按照1:1000加入氨苄青霉素储液（工作浓度为50 μg/ml）。

用高压灭菌过的10 μl枪头挑取平板上的单克隆菌落，37℃条件下以200 rpm转速振荡培养约6 h，使OD600为0.6-0.8。

3）每管加入按照1:200-1:500加入IPTG（工作浓度为0.2-0.5 mmol/L），20-25℃条件下200 rpm继续振荡培养过夜。

4）4℃条件下4,000 rpm离心15 min，收集细菌沉淀。

a)尽量倒净上清，每管加入10 ml PBS缓冲液重悬细菌，置于冰上超声。

5）4℃，12,000 rpm离心30 min，留取上清并分装后（混匀）于-80℃保存，即为纯化的原核融合蛋白A。

2. GST-pull down实验1）将编码B蛋白的重组质粒转染入HEK293细胞中，48 h后提取细胞总蛋白。

2）留取50 µl蛋白加入2×蛋白样品缓冲液，混匀后100℃金属浴加热10 min使蛋白变性，室温12,000 rpm离心15 s，-20℃保存，作为Input。

3）用预冷PBS缓冲液洗涤Glutathione Sepharose 4B珠子，然后然后按照1:1的比例向Glutathione Sepharose 4B珠子中加入PBS缓冲液并混合均匀。

吸取珠子时应减掉枪尖部分，避免破坏珠子。

4）取适量纯化的原核融合蛋白A（SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色调整各个融合蛋白的蛋白量，如果有验证多个蛋白，比如截短蛋白，保证加到另一个蛋白里的蛋白量一样），加入30-40 µl预处理过的Glutathione Sepharose 4B珠子，4℃颠倒混匀4-6 h。

5）于4℃条件下12,000 rpm离心15 s，弃上清。

GST-Pull Down周一早上：带有GST标签的ML-6P-1、GFP-6P-1保存菌划板（AMP+）晚上：挑斑，3-5ml摇菌过夜。

周二早上：带有His标签的s9-28a、S8-28a保存菌划板（kana+）晚上：挑斑，3-5ml摇菌过夜。

早上：1.吸1ml过夜菌（ML、GFP）加入100ml培养基中，37℃，220rpm摇至OD=0.8左右，加入IPTG 100 ul，25℃，170rpm诱导5小时。

2.菌液倒进50ml离心管中，4℃4000r 15min，倒掉上清，用1×PBS 30ml洗一次，再4℃4000r 15min离心，去上清。

再加入 3.5ml的1×PBS，重悬浮。

用超声波破碎20min（破碎3s，停6s）。

3.将蛋白破碎液分装到4个1.5ml RNA EP管中，约3管。

4.4℃，12000rpm，15min离心，置冰上。

此时可进行步骤85.RNA枪头吸取上清分装于 1.5ml RNA EP管中，分装成4管（不可吸到沉淀），置冰上。

6.于通风橱中加入1ul/管DTT（剧毒，还原剂，保持蛋白活性），置冰上7.额外吸取100ul上清保存，留作对照。

沉淀也保存。

8.将瓶中GST珠子（4℃保存）弹匀，RNA枪头吸出160ul于RNA EP管中，500rcf，5min，RNA枪头吸取上清9.加入预冷的1×PBS，混匀，500rcf，5min，吸取上清，重复两次。

10.取6中分装好的蛋白样品（ML、GFP）一半样品于珠子中，混匀。

4℃，摇床过夜（未使用的一半样品同置于摇床过夜）周三早上：按同一方法，处理过夜（S9-28a、S8-28a）菌液。

早上：将有珠子的离心管500rcf，5min离心，吸出上清，加入保留的另一半蛋白上清（ML、GFP，加前稍离心），接着4℃摇。

傍晚：1.将有珠子的离心管500rcf，5min离心去掉上清，2.用1×PBS 800ul，混匀，室温摇床10min，500rcf，5min离心去掉上清3.重复清洗一次，去上清。