抑菌试验方法总结课件

抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。

通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。

主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。

1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。

原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。

在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。

质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。

影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。

操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。

将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。

用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。

平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。

记录抑菌圈的直径，实验。

重复10次。

主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。

（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。

抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。

通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。

主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。

1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。

原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。

在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。

质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。

影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。

操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。

将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。

用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。

平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。

记录抑菌圈的直径，实验。

重复10次。

主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。

（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。

抑菌实验原理
抑菌实验原理
抑菌实验是一种常用的实验方法，用于评估化合物或制剂对细菌生长的影响。

其原理基于抗菌剂与细菌的相互作用，通过评估化合物对细菌的生长抑制能力来确定其是否具有抗菌作用。

实验步骤：
1.选取需要评估的细菌株并培养：在实验开始前需要选择优良的细菌株并进行培养。

培养条件需要与实验条件一致并注意菌群的纯化。

2.稀释细菌悬液：选择的细菌株需要用生理盐水等稀释至指定的浓度，以便更好的观察和比较细菌生长的情况。

3.加入待测化合物：将待测的化合物加入到试验瓶或板中，使其充分均匀地分布。

4.接种细菌悬液：将稀释好的细菌悬液分别分装进试验瓶或板中，在培养条件下进行生长。

5.生长评估：观察并记录细菌的生长情况。

在实验中，对于不同的细菌株和化合物，其作用机制和实验设置可能不尽相同。

但是无论是哪种情况，都需要关注细菌与化合物之间的交互关系，在实验过程中充分考虑到实验因素的影响。

此外，在实验过程中也应注意安全和环境保护问题。

实验室要做到整洁和齐全，使用化学品和试剂时避免摆放在易碎和易燃物品附近。

实验后的废弃物要做好分类处理，以免对环境造成污染。

总的来说，抑菌实验是一种简单而有效的方法，用于评估化合物的抗菌能力。

在实验过程中需要注意安全和环保问题，并在实验设计和数据处理中严谨科学，以做到准确评估化合物的抑菌能力。

1.O/129抑菌试验（1）原理：0／129（二氨基喋啶）对弧菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌属细菌无抑制作用。

（2）培养基：碱性琼脂平板。

（3）方法：将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取0／129纸片（含药40μg）贴于平板上，35℃培养l8～24h 观察结果。

（4）结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药。

（5）应用：用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属对0／129敏感，而气单胞菌属耐药。

2.杆菌肽试验（1）原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其他群链球菌绝大多数对其耐药。

（2）培养基：血琼脂平板。

（3）方法：将待检菌纯培养物（肉汤）均匀涂布于血液琼脂平板上，稍于后贴上0.04U／片的杆菌肽纸片，35℃培养l8～24h观察结果。

（4）结果：抑菌环直径>lOmm为敏感，抑菌环直径<lOmm为耐药。

（5）应用：用于A群链球菌与非A群链球菌的鉴别。

3.奥普托欣（Optochin）试验（1）原理：几乎所有肺炎链球菌对奥普托欣试验敏感，而奥普托欣试验对其他链球菌则无抑制作用。

（2）培养基：血琼脂平板。

（3）方法：将待检菌菌落或肉汤培养液均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴上含5μg/片的Optochin纸片，35℃培养l8～24h观察结果。

（4）结果：抑菌环直径：>14mm为敏感，若抑菌环直径≤14mm，对此菌株应再做胆汁溶菌试验，以证实是否为肺炎链球菌。

（5）应用：主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。

抑菌试验：用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。

通过抑菌实验,可以测定一个药物的最低抑菌浓度,用以评价该药物的抑菌性能,这是抗菌药物的最基本的药效学数据。

主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。

1.常量肉汤稀释法抗菌药物贮存液制备1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。

溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。

抗菌药物直接购自厂商或相关机构。

所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。

例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。

用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。

根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg 抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。

制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。

配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。

药敏试验用抗菌药物浓度范围1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。

培养基1.1.3. 培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。

需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。

在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。

嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。

接种物的制备1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。

抑菌圈测量是微生物分析的经典方法。

它是利用抑菌物质在涂布特定试验菌的琼脂培养基内成球形立体状扩散，抑制试验菌的繁殖，在抑菌物质的周围形成透明圈，即抑菌圈。

管碟法测定生物效价：利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。

制药企业，药检所常常进行抗生素的效价测定，最普遍的方式就是管碟法测定生物效价。

管碟法测定生物效价实验中存在大量抑菌圈测量工作，常规都是用游标卡尺手工测量抑菌圈的直径，如今可以用仪器自动进行分析，提高检测精度，减少测量误差。

迅数-自动抑菌圈测量系统是通过CCD 采集数字图像后，进行自适应差分滤波预处理，采用改进的四叉树交叉熵分割算法进行准确快速的分析，精确检测出抑菌圈直径数据，最后对数据建模统计，自动得到分析结果。

所有分析过程只要一秒就可以完成。

手动测量存在的问题有：1. 重现性差，准确性不够：同一培养皿，不同的人测量结果有差异；2. 当抑菌圈呈卵原形、边缘模糊或出现双层圈时，边界确定的人为误差大；3. 一个培养皿内有大量抑菌圈时，如做菌种筛选时，无法人工测量；自动抑菌圈测量的好处在于：快速、精度高、重现性好、操作简单。

示意;将试样剪成直径为2-3公分的园片,紧紧平贴在已接种试验菌种的FDA琼脂培养基表面上,经37℃24小时培养,培养基表面上长出密密麻麻的菌落,•而试样周围有一个不长菌落的"晕圈".测量晕圈环的宽度,用毫米表示.(如果没有晕圈•,应揭开试样,检查样品复盖若无菌落可视为样品具有非溶出性抗菌作用.应进一步用摇晃烧瓶•--菌落数测定法评价效将细菌植入或嫁接入营养琼脂培养基的表面，通过在营养琼脂培养基上形成的抑制圈来评估其抗菌效果。

目前普遍采用该方法来观测抗菌素的抗菌效果。

图1描述了抑菌圈测试方法。

图1: 涂层后基于抑菌圈的抗菌测试日本工业标准(JIS)Z2801:20009和ASTME2180-0110是目前使用最广泛的测试评估方法。

真菌抑菌试验
固体稀释法：1.9mlPDA培养基+1ml药液，无菌水做空白对照，多菌灵做阳性对照2.用6mm打孔器打菌饼3.接种培养，26℃恒温光照培养，一天后把平皿倒置，开始观察，空白对照菌丝长满平板后开始测量4.用十字交叉法测量。

具体操作步骤：
（1）90mm平皿的灭菌准备。

每种药液做四个重复。

（2）培养基的制备。

PDA培养基：20%马铃薯，2%葡萄糖，2%琼脂。

（3）药液的配置。

首先用二甲基亚砜溶解（二甲基亚砜浓度4%），然后用蒸馏水配置成药液。

（4）把准备好的平皿、培养基、药液、病原菌、打孔器、移液枪及枪头放入超净工作台，紫外照射15min、吹风15min。

（5）接种操作。

制备平板，使用移液枪取9mlPDA培养基和1ml药液或对照，振荡混匀，倒入培养皿，静置平放，使其凝固，贴上标签。

使用打孔器把病原菌制成6mm的菌饼。

把病原菌的菌饼接入到凝固的平板上，菌丝面向下。

封口，放入26℃恒温培养箱。

培养12-24h后倒置培养。

（6）抑菌效果检查。

培养5-7d后，取出平板。

用直尺十字交叉法测量菌丝生长直径。

（7）抑制率的计算。

抑制率=（空白对照菌丝-6）-（药剂菌丝-6）/空白对照菌丝-6
注：菌丝直径单位为mm，6为接入的菌饼直径。

抗（抑）菌试验抗（抑）菌试验2.1.8.1 目的测定抗（抑）菌产品对细菌和真菌的抗（抑）菌作用。

常使用的方法有抑菌环试验、最小抑制浓度测定试验、滞留抑菌效果测定试验、洗衣粉抗菌效果测定试验、振荡烧瓶试验、浸渍试验与奎因试验，可视情况选用。

2.1.8.2 抑菌环试验2.1.8.2.1 原理利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。

试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。

本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。

2.1.8.2.2 试验器材(1)金黄色葡萄球菌 (ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌 (ATCC 10231) 菌悬液(见2.1.1.2)及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液。

(2)抑菌剂载体 (5 mm 直径园形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后，置 120℃烤干2h，保存备用)。

(3)活菌培养计数所需器材(见2.1.1.3)。

(4)微量移液器(5μl～50μl，可调式)。

(5)游标卡尺。

(6)营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基2.1.8.2.3 操作程序(1)抑菌片的制备:对液体抑菌剂，取无菌并干燥的滤纸片。

每片滴加实际使用浓度抑菌剂溶液20μl，然后将滤纸片平放于清洁的无菌平皿内，开盖置温箱(37℃) 中烤干，或置室温下自然干燥后备用。

溶出性抗（抑）菌产品，可直接制成直径为 5mm，厚不超过 4mm圆片(块)，每 4 片(块) 一组。

(2)阴性对照样片的制备:取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水 20μl，干燥后备用。

溶出性抗（抑）菌产品的阴性对照样本，应取同种材质不含抑菌成份的样品，制成与试验组大小相同的样片(块)。

(3)试验菌的接种:用无菌棉拭子蘸取浓度为 5×105cfu/ml～5×106cfu/ml试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。

每涂抹1次，平板应转动 60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。

四、抑菌试验1．Optochin敏感试验(1)原理：Optochin(奥普托欣)是盐酸乙基氢化羟基奎宁的商品名。

对肺炎链球菌有特异抑制作用，其作用机制可能是干扰叶酸生物合成作用，而对其它链球菌则无此作用。

(2)方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培养物均匀涂布于血琼脂平板上，贴上一张含5μg奥普托欣纸片，置烛缸或二氧化碳孵箱，35℃孵育18~24h，观察结果。

(3)结果：抑菌圈直径大于14mm为敏感，小于或等于14mm为阴性。

(4)应用：主要用于肺炎链球菌（敏感）与其它链球菌（耐药）的鉴别。

2．杆菌肽敏感试验(1)原理：A群链球菌对杆菌肽几乎是100%敏感，而其它群链球菌对杆菌肽通常耐药。

故此试验可对链球菌进行鉴别。

(2)方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培养物均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴一张含0.04U 的杆菌肽纸片，置35℃孵育18~24h，观察结果。

(3) 结果：抑菌圈直径大于10mm为敏感，小于10mm为耐药。

(4)应用：主要用于A群与非A群链球菌的鉴别。

从临床分离的菌株中有5%~15%非A群链球菌也对杆菌肽敏感，如6%的B群链球菌、7.5%的C群链球菌和G群链球菌等。

3．O/129试验(1)原理：O/129（2，4二氨基-6，7-二异丙基喋啶）能抑制弧菌属、发光杆菌属和邻单胞菌属细菌生长，而气单胞菌属和假单胞菌属细菌则耐药。

(2)方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于碱性琼脂平板上，将10μg/片及150μg/片的O/129诊断纸片贴于平板上，置35℃孵育18~24h，观察结果。

(3)结果：出现抑菌圈者表示敏感，无抑菌圈者为耐药。

(4)应用：主要用于弧菌属、邻单胞菌属与气单胞菌属的鉴别，弧菌属和邻单胞菌属菌为敏感，气单胞菌属菌为耐药。

其它菌属有发光杆菌属为敏感，假单胞菌属为耐药。

细菌药敏试验2010-12-09 15:40:52| 分类：专业文章 | 标签：高校公共卫生 |字号订阅各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床，对控制细菌性传染病的流行至关重要。

实验11-抗生素的抑菌试验实验目的：本实验的目的在于了解抗生素的抑菌作用并学习抗生素敏感性试验的方法。

实验原理：抗生素是广泛用于医生领域以及日常生活中的一种药物。

抗生素可以抑制或杀死致病菌，从而治疗疾病。

不同类型的抗生素作用机制不同，但抗生素大部分作用于细菌的生长和繁殖过程中的关键步骤，如细菌细胞壁的合成或DNA复制等。

不同种类的细菌对抗生素的敏感性也不相同，有些细菌对某些抗生素产生了耐药性，因此了解细菌对抗生素的敏感性是非常重要的。

抗生素敏感性试验是一种常见的实验方法，旨在寻找一种特定的抗生素是否能够杀死或抑制正在生长的细菌。

该实验方法可以采用不同的技术，例如扩散法、筛选法、稀释法等。

在该实验中，我们将采用扩散法来测定细菌对抗生素的敏感性。

扩散法试验包括以下几个步骤：1. 准备培养基：将适量的琼脂糖肉汤（TSA）加入试管中，加热至完全融化，然后立即冷却至50℃左右，以避免其蒸发。

2. 种植细菌：将待测试的细菌菌液转移到琼脂糖肉汤中，并搅拌均匀。

然后，将菌液倒入含有琼脂糖的平板培养基中。

让其在室温下凝固，然后将其在温度适当的培养箱中孵育24小时。

3. 准备抗生素滤纸：将抗生素滤纸切成适当大小，并在其中加入一定量的抗生素药物。

4. 将滤纸放在琼脂糖肉汤的表面上，让其均匀地铺在平板表面上。

然后，将詹森器或其他适当的装置用于压缩滤纸，使其与培养基接触。

5. 将培养板放置于适当的环境中孵育，一般是37℃下的恒温箱。

然后，在24小时后，评估抗生素在细菌生长上的作用。

根据细菌在平板上的生长和抗生素滤纸周围的清晰区域，可以得出抗生素对细菌的敏感性结果。

实验材料：1. 感兴趣的抗生素药物2. 琼脂糖肉汤（TSA）3. 需要测试的细菌菌液实验步骤：1. 准备琼脂糖肉汤培养基。

2. 在试管中接种需要测试的细菌，搅拌均匀。

将其倒入含有琼脂糖肉汤的平板培养基中。

在放置室温下使其平板凝固，然后将其置于适当温度的培养箱中孵育24小时。

药物抑菌浓度试验方法我折腾了好久药物抑菌浓度试验方法，总算找到点门道。

说实话，一开始我也是瞎摸索，走了不少弯路呢。

我试过肉汤稀释法，这个方法看着简单，但实际做起来可不容易。

我得先准备好培养基，就像准备一锅煮饭的米一样，培养基得合适，不然这基础就打不好。

我之前就错选过不太好的培养基，导致后来实验结果乱七八糟的。

然后把药物按照一定的梯度稀释，这就好比把一杯浓糖水慢慢加水变淡，要特别精细准确。

我就犯过不小心手抖把药物加过量的错误，整个浓度梯度就乱套了。

纸片扩散法我也做过。

要先把培养基均匀地铺在平板上，就像给土地松土一样，得平平的。

然后把含有药物的纸片轻轻放在上面。

说起来简单，但我第一次做的时候，纸片放得歪歪扭扭的，有些地方重叠了，这肯定影响结果呀。

之后就明白手下得轻得小心。

这个方法主要是看抑菌圈的大小，来判断抑菌浓度。

不过这个抑菌圈的判断有时候不是那么明确，感觉有个模糊地带，就是看起来不太好确定到底是多大的圈对应多少抑菌浓度。

还有琼脂稀释法。

我感觉像是盖房子打地基一样，要把药物和琼脂混合，一块一块的，不同的药物浓度对应不同的琼脂块。

把细菌接种在上面就像种子种在地里一样。

这里接种的量可得控制好，我就试错过接种量太多或者太少，结果要么细菌到处都是，好像杂草丛生，要么一块板子上没几个细菌，根本看不出什么抑菌效果。

我觉得不管用哪种方法，实验环境要保持干净稳定也很重要。

就像人生活在干净整洁的房间里一样，细菌也需要一个相对稳定的外界条件。

还有，对于药物的溶解性也得搞清楚，如果药物都溶不好，浓度肯定不对。

新买回来的药物我都会好好研究研究溶解性这块。

我还会多做几个平行样，避免一次实验结果的偶然性。

这样综合起来看，得到的药物抑菌浓度结果才能更靠谱点，不过这中间确实还有很多不确定，只能多摸索摸索了。

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纸片法、牛津杯法等，但原理都是一样的，纸片法做起来比较简单，不用特殊的材料，可能比较适合你：
1.把实验室用的普通滤纸用打孔器打成0.5cm直径的圆片，装在试管中密封灭菌（121度，20分钟）。

2.将已经培养好的菌制成一定浓度的悬浮液，取1ml该菌悬液至灭过菌的（121度，20分钟）培养皿中，倒入适量（约4毫米厚吧）已灭菌的培养基（温度约45度，用手摸瓶壁不感觉烫手即可），轻轻转动培养皿，使培养基与菌液混匀，静置凝成平板。

3.将用于试验的农药配制成几个所需的浓度，用无菌镊子夹起一片滤纸放入药液中浸透，夹出时在容器边缘停靠片刻，滤掉多余的药液，把滤纸片放在平板中凝好的培养基的中心，用镊子稍用力按一下，使之与培养基充分紧贴。

4.按上述方法，每个浓度做3个重复，以灭菌水浸湿的滤纸片做空白对照。

5.在适当温度下培养一定时间后观察，用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的大小，计算抑菌率就OK了！
希望能对你有帮助，有什么问题可以短消息我：）
2。