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牛津杯法抑菌试验步骤
一、准备试剂和器材
试剂：待测试的抑菌剂、无菌水、培养基（如LB、麦芽糖等）。
器材：移液管、无菌棉签、牛津杯、试管、培养箱、天平等。
二、制备菌液
从保存的菌种中取适量菌种，接种于无菌培养基中。
将培养基放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养至菌种生长至对数期。
将培养好的菌液用无菌棉签轻轻涂布于无菌平板上，观察菌落的形态和大小。
用移液管取适量的菌液，制备成一定浓度的菌悬液。
三、准备牛津杯
取一块无菌滤纸片，将其放入牛津杯中，使其贴紧杯壁。
用移液管将适量的抑菌剂加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录抑菌剂的种类和浓度。
四、加样
取适量的测试样品放入无菌试管中。
用移液管将样品溶液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录样品溶液的种类和浓度。
五、加菌液
用移液管将制备好的菌悬液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
轻轻摇晃牛津杯，使菌悬液和样品溶液充分混合。
六、培养
将牛津杯放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察培养结果，记录细菌的生长情况。
七、结果观察
取出生长至对数期的细菌，用无菌棉签涂布于无菌平板上。
将无菌平板放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察细菌的生长情况，记录细菌的数目和形态。
抑菌实验方案抑菌实验方案一、菌种大肠杆菌ATCC25922 金黄色葡萄球菌ATCC6538二、培养基LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15~20g，用10mol/LNaOH调pH，范围7.0~7.4倒平板（平板培养基）1.将培养皿洗净、干燥，使各培养皿盖方向一致，用牛皮纸包好，或放入特制铁罐内，注明皿盖的方向。
高压灭菌或干燥灭菌后备用。
2.取刚灭菌后尚未凝固的培养基置于无菌箱或超净工作台内，先左手持三角瓶,右手反转手掌用中指和无名指拨出棉塞或硅胶赛(或不翻转手掌用小指和手掌拨出棉塞) ,同时将三角瓶转换至右手，而后左手拿平皿,以大拇指和中指将皿盖打开一缝，至瓶口刚好伸入。
三角瓶口经火焰烧灼后，倾入灭菌或溶化、冷却至55~60°C的培养基约15mL(勿使瓶口靠在平皿壁上，以免沾染皿壁)，迅速盖好皿盖，置于桌上轻轻旋转平皿,使培养基均匀分布于整个平皿底部,冷凝后即为平板培养基。
有时凝固后的培养基表面有冷凝水，可将平皿盖打开倒置于37℃温箱，除去冷凝水，否则将影响平板分离培养效果。
为防止冷凝水过多，也可将培养基冷却至45 ~ 50°C再倒平板。
培养基在30℃下放置一天，无污染的即可使用。
一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用三、器械培养皿（90mm）、滤纸、三角耙、接种环、试管四、实验步骤（一）、抑菌圈的测定(滤纸片法)1、菌种接种将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌反复转种2次，使菌种新鲜，置30℃恒温培养箱培养1d，备用。
2、菌悬液制备在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水(约5mL)，接种环轻刮菌落，摇晃混匀。
3、涂布在超净台里用枪取0.1ml菌悬液注入平板，放置5min左右后用三角耙涂布均匀，每种菌设置两个重复平板4、贴片在超净台里将平板平均分为6个区，对角设置平行组，同时用无菌水做对照组,硫酸链霉素(10U)作阳性对照。
每两张滤纸片(直径1.1cm或0.6cm)为一贴，用镊子夹着滤纸片在样品中轻轻蘸一下后，取出贴在平板的指定位置，轻摁一下使滤纸片牢固，置(正放)4℃冰箱中放24h。
杀菌和抑菌试验操作规范一、总则适用范围：本方法适用于医疗、卫生、食品等行业的杀菌和抑菌试验。
引用标准：消毒技术规范2002二、术语消毒 disinfection杀灭或清除传播媒介上病原微生物,使其达到无害化的处理。
灭菌 sterilization杀灭或清除传播媒介上一切微生物的处理。
消毒剂 disinfectant用于杀灭传播媒介上的微生物使其达消毒或灭菌要求的制剂。
灭菌剂 sterilant可杀灭一切微生物(包括细菌芽孢)使其达到灭菌要求的制剂。
杀灭时间 killing time, KT用于生物指示物抗力鉴定时, 指受试指示物样本，经杀菌因子作用不同时间后, 培养后的全部样本均无菌生长的最短作用时间 (min)杀灭率 killing rate, KR在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值，以其表达杀灭效果。
灭对数值 killing log value微生物数量以对数表示时，消毒后与消毒前比较, 以其减少的对数值来表达杀灭效果。
三、菌悬液与菌片的制备(一) 试验前应选择合适的细菌，在下述规定中表中‘+’为必做试验的微生物，根据消毒剂特定用途或试验特殊需要，还可增选其他菌株。
(二) 试验器械A. 无菌蒸馏水B. 细菌培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）和营养肉汤培养基等C. 刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛细吸管。
D. 数字可调移液器（10μl~200μl）及配套用一次性塑料吸头。
E. 浊度计F. 游标卡尺(三) 细菌繁殖体悬液的制备1 取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。
取含 5.0 ml～10.0ml 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置 37 ℃培养18h～24h。
用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于 37℃培养 18h～24h。
挑取上述第2 代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于 37℃培养 18h～24h，即为第3 代培养物。
实验方法（抑菌实验研究）配制细菌培养基100ml（牛肉膏蛋白胨培养基）成分：牛肉膏0.5g 蛋白胨1g 氯化钠0.5g 琼脂2g蒸馏水100ml 1mol/LNaOH 1mol/LHCl器材：三角烧瓶小烧杯量筒玻璃棒天平药匙高压蒸汽灭菌锅PH试纸棉花牛皮纸记号笔麻绳纱布刀片超净工作台操作步骤：1.按照培养基配方比例准确称取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠放入烧杯中。
用玻璃棒挑取牛肉膏到称量纸上，称量后直接放入水中。
加热后牛肉膏便与称量纸分离。
蛋白胨容易吸潮，称取时动作要快。
2.在上述烧杯中加入比需要量少的的水，用玻璃棒搅拌均匀，然后再石棉网上加热使其溶解，完全溶解后将称好的琼脂加入已经融化的药品中，边加热边搅拌，最后量筒定容用蒸馏水补足总体积。
3.用精密PH试纸测PH，如果偏酸，则逐滴加入1mol/L的NaOH，边加边搅拌，并随时用PH试纸测其PH，直至PH达到7.6。
反之则用1mol/L的HCL调节。
加塞在三角瓶口加上棉塞包扎在加塞后的三角瓶口外包一层牛皮纸，其外用麻绳绑好灭菌将上述三角瓶高压灭菌配制菌悬液将培养在试管斜面的菌种，划在平皿上，37摄氏度培养16小时，然后去适量无菌水冲洗平皿上的菌落，即可制成菌悬疑。
操作步骤事先将平皿若干用高压蒸汽灭菌锅灭菌，然后在超净工作台中无菌操作，倒平皿，冷却即成。
将平皿编号。
将倒好的平皿烘干。
1.向每个平皿中倒入约200l细菌悬液，用涂布棒涂匀。
2.待干燥后，用灭菌后的刀片将平皿分成大小相等的六部分。
3.将高压灭菌过的滤纸小片浸在待测药品中，后用灭菌的小镊子家夹起滤纸小片放在分好的平皿中，盖好盖，37℃培养箱中培养24h。
4.每隔6至8小时观察有无抑菌圈及其大小。
抑菌圈法实验流程
实验目的：通过抑菌圈法检测不同抗生素对细菌的敏感性，为临床治疗提供参考依据。
实验原理：利用纸片或圆筒在琼脂平板上制造抑菌圈，测定不同药物对细菌的抑制能力。
当细菌被抗生素抑制生长时，抑菌圈周围的菌落会出现明显的清晰区域，即抑菌圈。
抑菌圈大小与细菌对该药物的敏感性成正比。
实验步骤：
1. 培养细菌：选取待测菌种，在无菌条件下接种于琼脂平板上，进行预培养。
2. 制备药物纸片：将不同抗生素药物浸泡在无菌纸片中，使纸片充分吸收药物。
3. 在琼脂平板上制造抑菌圈：用无菌铁环或无菌棉签将药物纸片放置于琼脂平板表面，轻轻压实，使药物充分扩散。
然后在纸片周围接种待测菌种，使其均匀生长。
4. 培养细菌：将琼脂平板倒置，放入培养箱中，在适宜的温度下培养细菌。
5. 观察抑菌圈：经过一定时间的培养，观察琼脂平板上细菌的生长状态，记录不同药物纸片周围的抑菌圈大小和形态。
6. 结果分析：根据抑菌圈的大小和形态，判断该菌株对不同药物的敏感性，为临床治疗提供参考。
实验注意事项：
1. 所有操作均在无菌条件下进行，避免外界微生物的污染。
2. 选择合适的药物浓度，避免药物过浓或过稀而影响实验结果。
3. 操作时要注意卫生，避免药物接触到皮肤或口腔。
4. 实验后应及时处理琼脂平板和药物纸片，避免造成环境污染。
抑菌试验方法一、引言抑菌试验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对微生物生长的影响。
该试验可用于评估抗菌剂的效果、食品、药品和化妆品的微生物安全性，以及环境中抗菌材料的性能等。
本文将介绍抑菌试验的一般步骤和常用方法。
二、试验步骤1. 试验前准备在进行抑菌试验前，首先要准备好所需的试验材料和设备。
包括培养基、试验物质、细菌菌株、培养皿、试管、移液器等。
同时，要保持实验环境的清洁和无菌。
2. 菌种培养选择合适的细菌菌株，将其接种到含有适当培养基的试管中，并在37℃恒温培养箱中培养过夜，使其达到指定的细菌浓度。
3. 制备菌液将过夜培养的菌株转移到新的培养基中，通过菌液稀释法，制备出所需的菌液浓度。
菌液的浓度应根据试验要求进行调整。
4. 试验组装将试验物质分别添加到培养基或培养皿中，使其与菌液充分接触。
同时，设置对照组，用无抑菌物质的培养基或培养皿进行对照。
5. 培养条件将试验组和对照组置于适当的培养条件下，如温度、湿度等。
根据不同的试验要求，可选择不同的培养时间和培养条件。
6. 菌落计数在培养结束后，使用显微镜或肉眼观察试验组和对照组的菌落情况，并进行菌落计数。
菌落计数可通过平板计数法或滴定法进行。
7. 数据分析根据菌落计数结果，对试验组的抑菌效果进行评估。
常用的评估指标包括菌落形成率、抑菌率、最小抑菌浓度等。
三、常用方法1. 纸片扩散法该方法常用于评估固体试样的抑菌效果。
将试验物质涂布于纸片上，然后将纸片放置在含菌液的培养基表面上，通过观察菌落的生长情况来评估抑菌效果。
2. 悬浮液法该方法常用于评估液体试样的抑菌效果。
将试验物质与菌液混合，通过培养一定时间后，观察菌液的浑浊度或使用菌落计数法来评估抑菌效果。
3. 筛选法该方法常用于筛选具有抑菌活性的试验物质。
将试验物质与菌液混合后，通过培养一定时间后，观察菌落情况，筛选出对菌株有明显抑制作用的试验物质。
4. 斑点法该方法常用于评估试验物质对特定细菌菌株的抑菌效果。
抑菌实验程序2 抑菌实验基本程序，先确定抑菌性，后确定最小抑菌浓度(活性)2(1 抑菌性实验:在灭菌平皿中加入牛肉汤培养基后，中间划一线，两侧点接药物和细菌，35?孵育16~20h，看菌与药物接触处菌落是否变形，若变形即为有抑菌性，可进行下面的实验 2(2 最小抑菌活性确定:思路:菌种准备—抗菌培养基(不同梯度剂量)—温育—观察生长情况—确定最小浓度方法:2(2(1 菌种准备:准备10支试管，排成1排，内置去离子水配成的生理盐水(0.8%), 除第1管加入10 ml外，其余每管加入肉汤9ml，在第1管加入活化的菌1-2环，混匀振荡后，吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第10管，并从第10管中吸取1ml弃去，(使用时可通过预实验数菌落数，也可以直接选用其中的第7，8管)即为浓度为104 CFU,一般可直接用于接种测试。
2(2(2 培养基制备:牛肉浸膏琼脂培养基，以1NNaOH或HCl调pH7.2~7.4,灭菌后备用2(2(3 梯度药物浓度培养基制备:准备十支灭菌水的试管，排成一排，除第1管加入1.6ml无菌水外，其余每管加入肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第9管，并从第9管中吸取1ml弃去，第10管为不含药物的生长对照。
根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50?水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
通常按1?9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
2(2(4 含药平板上接种:将1中的菌点接在准备好的药物琼脂培养基3中，每点直径可以用灭菌的打孔器打孔，直径5-8mm,接好后置35?孵育16~20h，观察2(2(5 结果评定:将平板置于白色底衬下，确定抑制细菌生长的最低药物浓度，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
抑菌圈实验说明抑菌圈法是衡量杀菌防霉剂效果的一种方式，主要用于测定杀菌防霉剂对细菌、霉菌、酵母菌的抑菌作用，是定性或半定量的方法。
通过杀菌防霉剂在琼脂平板上的扩散能力来初步筛选更有效的杀菌防霉剂品种。
用具和材料霉菌培养皿，无菌吸管（或针筒），圆片滤纸（直径2cm），带玻璃珠的无菌水，带过滤漏斗的三角牌，镊子，接种针（环），熔化状态的琼脂培养基（最好保温于45℃左右水浴中），一定浓度的药剂，供试验用的菌种。
试验过程1.用接种环挑取各试管斜面的菌种于带玻璃珠的无菌水中，用手振荡数分钟使孢子分散，过滤后制成混合孢子悬液。
2.用无菌吸管（或针筒）向各培养皿中注入一定浓度的混合孢子悬浮液0.5mL。
3.向各培养皿内注入15Ml~20ml的熔化状琼脂培养基（约45℃），将菌液与培养基混合均匀，待其冷却。
4.用镊子将圆片滤纸在不同浓度的防霉剂中浸渍片刻，取出置于带菌培养基平板的中央，盖上盖子5.置适宜温度下，培养2~3d，观察滤纸片圆片周围抑菌圈的有无及大小。
注意事项1.所有的操作用具和材料都要事先做灭菌处理，操作必须在无菌室（或无菌箱）内于火焰旁进行。
2.霉菌、细菌、酵母菌等各种微生物都必须分别配置混合菌液，即这里指的混合菌液是霉菌或酵母菌等诸种菌的分别混合液，并非霉菌、细菌和酵母菌的混合液。
3.混合菌液的浓度一般为106~108cfu/mL.4.倒入培养皿的琼脂培养基温度不能太高（一般为45℃左右），否则会引起微生物死亡。
也不能太低，因为琼脂会很快凝结，以致搅拌不均匀，影响试验结果。
5.各种微生物的最适生长温度不同（例如霉菌一般为25~30℃，细菌一般为32~37℃等），恒温培养时宜分开放置。
结果评判由于滤纸圆片所吸附的药液慢慢向四周扩散，因此在滤纸片的周围就出现清晰的抑菌圈（加入该防霉剂对供试菌有抑制效果）。
抑菌圈的大小代表药剂抗菌力的高低。
在一定的药剂浓度范围内，药剂的浓度越高则抑菌圈的直径越大。
此法同样适合于测定单个菌的抗菌效果。
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纸片法、牛津杯法等，但原理都是一样的，纸片法做起来比较简单，不用特殊的材料，可能比较适合你：
1.把实验室用的普通滤纸用打孔器打成0.5cm直径的圆片，装在试管中密封灭菌（121度，20分钟）。
2.将已经培养好的菌制成一定浓度的悬浮液，取1ml该菌悬液至灭过菌的（121度，20分钟）培养皿中，倒入适量（约4毫米厚吧）已灭菌的培养基（温度约45度，用手摸瓶壁不感觉烫手即可），轻轻转动培养皿，使培养基与菌液混匀，静置凝成平板。
3.将用于试验的农药配制成几个所需的浓度，用无菌镊子夹起一片滤纸放入药液中浸透，夹出时在容器边缘停靠片刻，滤掉多余的药液，把滤纸片放在平板中凝好的培养基的中心，用镊子稍用力按一下，使之与培养基充分紧贴。
4.按上述方法，每个浓度做3个重复，以灭菌水浸湿的滤纸片做空白对照。
5.在适当温度下培养一定时间后观察，用直尺或游标卡尺测量抑菌圈的大小，计算抑菌率就OK了！
希望能对你有帮助，有什么问题可以短消息我：）
2。
1.O/129抑菌试验（1）原理：0／129（二氨基喋啶）对弧菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌属细菌无抑制作用。
（2）培养基：碱性琼脂平板。
（3）方法：将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取0／129纸片（含药40μg）贴于平板上，35℃培养l8～24h 观察结果。
（4）结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药。
（5）应用：用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属对0／129敏感，而气单胞菌属耐药。
2.杆菌肽试验（1）原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其他群链球菌绝大多数对其耐药。
（2）培养基：血琼脂平板。
（3）方法：将待检菌纯培养物（肉汤）均匀涂布于血液琼脂平板上，稍于后贴上0.04U／片的杆菌肽纸片，35℃培养l8～24h观察结果。
（4）结果：抑菌环直径>lOmm为敏感，抑菌环直径<lOmm为耐药。
（5）应用：用于A群链球菌与非A群链球菌的鉴别。
3.奥普托欣（Optochin）试验（1）原理：几乎所有肺炎链球菌对奥普托欣试验敏感，而奥普托欣试验对其他链球菌则无抑制作用。
（2）培养基：血琼脂平板。
（3）方法：将待检菌菌落或肉汤培养液均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴上含5μg/片的Optochin纸片，35℃培养l8～24h观察结果。
（4）结果：抑菌环直径：>14mm为敏感，若抑菌环直径≤14mm，对此菌株应再做胆汁溶菌试验，以证实是否为肺炎链球菌。
（5）应用：主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。
抑菌效力检查操作规程抑菌效力检查操作规程一、实验室准备工作1. 确保实验室内环境干净整洁，无杂草杂物。
2. 准备所需的实验设备和试剂，包括培养基、培养皿、试管、培养箱等。
3. 检查设备和试剂的质量，确保其符合检测要求。
4. 检查消毒设备的有效性，保证消毒质量。
5. 确保实验人员了解并熟悉相关的实验操作规程。
二、样品准备1. 根据检测要求，选择需要检测抑菌效力的样品。
2. 样品应具备代表性，以确保检测结果的准确性。
3. 样品应进行有效的消毒处理，以去除可能影响实验结果的外源性菌群。
4. 样品应进行适当的稀释处理，以确保实验过程中的菌落计数在合适的范围内。
三、实验操作1. 预热培养箱至适当的温度，通风静置一段时间以达到温度均一。
2. 准备培养基，按照指定比例配制好培养基。
3. 将培养基倒入培养皿或试管中，确保培养基平均分布。
4. 待培养基凝固之后，使用无菌技术在培养基上均匀地涂布待测样品。
5. 将涂布好的培养皿或试管放入预热好的培养箱中，设定适当的温度和时间。
6. 培养结束后，取出培养皿或试管，进行菌落计数和观察。
7. 记录实验结果，并依据相关标准对抑菌效力进行评估。
四、实验结果分析1. 对每个样品进行菌落计数，统计不同条件下菌落的数量和形态特征。
2. 将实验结果与对照组进行比较，判断样品的抑菌效力是否达到要求。
3. 如果样品的抑菌效力未达到要求，可以继续进行进一步的研究和优化，以提高其抑菌效力。
4. 根据实验结果和分析，撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果和结论等内容。
五、实验安全注意事项1. 操作人员应穿戴适当的实验服和个人防护用品，如手套、口罩和护目镜等。
2. 操作过程中要注意实验室内的卫生和消毒，避免交叉感染。
3. 各种试剂和培养基应按照规定存放和处置，避免对环境和人员造成危害。
4。
严禁食用实验中使用的试剂和培养基。
5. 在实验操作过程中，如有任何异常情况发生，应立即停止操作，并及时采取相应的安全措施。
1.2方法L2.1菌液制备将试验菌分别接种于肉汤培养基(金葡菌和大肠杆菌接种于营养肉汤,无乳链球菌接种于叠氮化钠葡萄糖肉汤)于37e培养箱培养18小时后,以倾注平板法培养计数,用无菌生理盐水稀释到含菌数为106cFu加LL备用"1.2.2药液稀释每组取8支试管,在一支试管加入smL原/乳炎康注射液,,药液,然后用灭菌肉汤进行倍比稀释,第2管至第6管中先后各加入2.smL灭菌肉汤,从第1管中取2.smL药液至第2管,混匀后取2.smL至第3管,依次类推,至第6管取2.smL弃之"使得第1至第6管药液浓度分别为50Omg/mL!250mg/mL!125mg/mL!62.5m留mL!31.25m留mL!巧.625mg/mL,第7管为smL无药液肉汤对照管,第8管为药液对照管"1.23细菌接种和琼脂平皿培养各试管中分别加入上述制备的菌液0.lmL,摇匀后置于37e恒温培养箱内培养24h,再于各试管中取样分别接种于各琼脂平皿,金黄色葡萄球菌接种于普通营养琼脂平皿;无乳链球菌接种于羊鲜血琼脂平皿;大肠杆菌接种于麦康凯琼脂平皿"置于37e恒温箱内再培养18一48h,在培养1811,24h和48h分别观察细菌生长情况"1.2.4最小抑菌浓度的判定以琼脂平皿中无细菌生长的试管药液浓度判定为/乳炎康注射液0的最低抑菌浓度(MIC)"2结果金黄色葡萄球菌在含药液浓度为50omg/mL浓度的肉汤中不生长,低于此浓度以下时生长良好;无乳链球菌在125m岁m工浓度以上的肉汤中不生长;大肠杆菌在25Omg/mL浓度以上肉汤中不生长"/乳炎康注射液0在肉汤中对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(Mlc)为500mg/mL,对无乳链球菌的MIC为125mg/mL,对大肠杆菌的呱C为25Om留mL"制备工艺金银花!蒲公英加水浸泡后.蒸馏.收集300ml蒸馏液"蒸馏后的药物渣与其他药物加水煎煮两次,第一次1.几.第二次1.Oh,合并煎液,#放冷,加入95%乙醇,使得药液乙醇浓度为85%,密闭冷藏24h,过滤,回收乙醇,药液冷却后再加入95%乙醇,使得酒精浓度达75%,冷藏抖11,j二滤,回收乙醇.药液减压浓缩至400耐"与蒸馏液合并,加入2%药用碳作用10二ill后过滤,调pH值至药液澄清,加入2%吐温一80和0.01%EDTA,静止后过滤.分装.灭菌.活菌平板计数法将被检菌株分别划线接种于固体培养基,金黄色葡萄球菌接种于却莆曼琼脂培养基,大肠杆菌接种于麦康凯琼脂培养基,无乳链球菌接种于绵羊鲜血琼脂培养基,置37e培养24h"在大肠杆菌麦康凯琼脂培养基平皿上挑选光滑!圆整的红色菌落1个,接种普通肉汤培养基中,置37e振荡培养16一20h"在一排小嫩底试管中先加稀释液灭菌生理盐水,第1管加1.smL,从第2管起各管加0.gmL,取0.2mL细菌原液加入第1管中,作为第1个稀释浓度,接下来从第1管中取0.lmL加入第2管,作为第2个稀释度,依次类推进行一系列稀释,从第1管10倍稀释到10.9,然后取106,107,105,109四个稀释度中菌液0.lmL进行涂板,每个稀释度涂3块板,置37e倒置培养24h"选取菌落数介于30一300之间的平板作为有效计数平板,取3块板的细菌平均数乘以稀释倍数再乘以10,即为被检细菌原液中每mL细菌活菌数"金黄色葡萄球菌和无乳链球菌同大肠杆菌的计数方法进行平板计数".用无菌生理盐水稀释到含菌数为106cFu/mL备用.药物敏感试验在倒好的M一H琼脂平板上倒入0.2mL以校正好的细菌悬液(1护CFu/mL),用无菌棉拭子涂匀"平板加盖放置干燥至少3min,但不得超过巧min,用无菌镊子将药敏纸片贴在涂好菌液得平板上,各纸片中心相距至少24Inlll,两纸片中心至少30~"在15min内将平板置37oC培养18一24h"最低抑菌浓度(MIC)的测定按微量稀释法(microdilution)进行:先准备13支灭菌试管,每管加肉汤回,第1管加药物稀释液Inil,混合后取Inil加入第2管,依次倍比稀释到第13管(此时第1一13管药液浓度依次为:1280一0.3125u留而)"取u型底96孔聚苯乙烯微孔板,经紫外消毒,用微量移液器在每孔中加入上述稀释好的药液,浓度由低到高,每孔50ul,至第13孔,第14孔加肉汤IO0ul(空白对照),第15孔加药液100ul(药物对照),第16孔加肉汤SOul(菌液对照),1一13孔及第16孔加入上述制备好的应用菌液,每孔SOul,加液完毕盖上消毒玻板,振荡混匀,放入垫有湿纱布的方盘内,36e培养18一24h,观察结果"中药制备每味中药及方剂均按水提法进行制备。
抑菌圈法实验流程抑菌圈法（Kirby-Bauer法）是一种常用的抗菌药物敏感性试验方法，用于评估抗菌药物对细菌的抑菌效果和选择性。
实验流程如下：1.材料准备- 霍乱弧菌（Vibrio cholerae）培养基：将霍乱弧菌分离菌落接种到琼脂平板上，培养过夜。
-纯培养的霍乱弧菌菌液：选择一颗单菌落，将其转移到无菌培养基中，培养到对数生长期。
-抗菌药物纸材：将抗生素敏感纸片切成适当大小的圆片。
-灭菌钎子：用于将纸材固定在平板上。
-显微镊子：用于取出抗生素纸片。
2.制备琼脂培养基平板-在无菌条件下，将琼脂培养基加热至溶解。
-将琼脂培养基均匀倒入培养皿中。
-放置琼脂培养基凝固。
3.制备菌液悬液-用无菌生理盐水洗涤培养的霍乱弧菌菌落，使其悬浮在生理盐水中。
-用光度计测量悬浮液的浓度，调整到0.5的麦克斯韦尔稀释系数。
4.菌液接种-用梅林巴赫管（或吸管）吸取菌液悬液，通过刮平盖玻片法将其涂抹在琼脂平板上。
-用无菌棉签将菌液均匀涂抹在琼脂平板上。
5.抗生素纸片覆盖-用灭菌钎子将抗生素纸材固定在琼脂平板表面。
-用无菌镊子将预先标定好的抗生素纸片覆盖在菌液层上。
6.孵育-将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中孵育24小时。
7.测量抑菌圈直径-孵育后，观察平板上的抗生素纸片周围是否出现抑菌圈。
抑菌圈呈透明带状。
-用尺度卡测量抑菌圈的直径。
8.数据分析-根据抑菌圈的直径，查阅相关参考表确定该抗生素对该菌株的敏感性。
注意事项：-所有步骤都要在无菌条件下进行，以避免外部细菌的干扰。
-保持实验环境的洁净和安全，并进行相应的实验室安全措施。
-实验中要保持手部和工具的清洁，避免交叉污染。
-实验后应妥善处置实验废弃物，如纸材和实验用具。
抑菌圈法是一种简单、可靠的药敏试验方法，可用于评估抗生素的抑菌效果和终止治疗浓度建议。
通过该试验可以指导临床医生合理使用抗菌药物，防止药物滥用和耐药菌株的产生。
同时，该方法也可以用于研究新发现的抗生素的抗菌特性和敏感度。
文件编号： SC-SOP-00300 第 1 页共 1 页
1. 目的：规范抑菌实验检测操作
2. 范围：适用于抗菌肽抑菌实验检测
3. 职责：实验室人员对本操作规程的实施负责。
4. 内容：
准备待检液：于离心管中按照300ul待检液加入1.2ml甲醇，浸提60min，然后3500rpm 离心15min，取上清液用孔径为0.22um的一次性过滤器过滤，滤液置于无菌容器待用待用。
准备培养基：LB液体培养基、NA固体培养基（胰蛋白胨5g/L、蔗糖10g/L、酵母浸粉2g/L、牛肉浸膏4g/L、氯化钠3g/L、琼脂粉20g/L），NA液体培养基（胰蛋白胨5g/L、蔗糖10g/L、酵母浸粉2g/L、牛肉浸膏4g/L、氯化钠3g/L），（备注：此处指示菌为黄单胞菌，如以其他菌作为指示菌请使用对应培养基。
灭菌：NA培养基115℃灭菌20min，LB培养基、移液枪头、打孔器等121℃灭菌20min。
活化：将黄单胞菌菌种转接到NA固体培养基上，30℃过夜培养然后转接到NA液体培养基中30℃、200rpm培养至液体浑浊待用。
抑菌：吸取黄单胞菌菌液50ul滴在NA固体培养基上，用灼烧过的涂布棒或灭菌过的玻璃珠涂布均匀，然后将打孔器灼烧后冷却，在该培养基上打孔四个，用灭菌牙签将琼脂块挑出，往一个孔中加入20ul无菌水或生理盐水作为对照，其他三个孔加入20ul待检液，30℃培养24小时观察
∗100%
抑菌率：抑菌率=对照菌落直径−菌落直径
对照菌落直径−打孔器外直径
5. 注意事项
5.1 注意无菌操作
5.2 必须进行重复以增加数据准确性。
抑菌试验操作规程1．范围本规程适用于所有益生菌抑菌活性的测定。
2．试验前准备设备及器材：高温蒸汽灭菌锅，超净工作台，酒精灯，恒温摇床，恒温水浴锅，恒温培养箱，平皿（直径9cm），牛津杯（内径6mm，外径8mm，高10mm），移液管（10ml），微量移液器及吸头（1ml、200ul）。
3．操作步骤3.1 病原菌的制备3.1.1 病原菌：鸡致病性大肠杆菌，鸡致病性大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。
3.1.2病原菌扩培：在超净工作台内，挑取一环病原菌接种于100 ml无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200 rpm，培养8~12h，即为扩培好的病原菌悬液。
3.2 检测样品的制备3.2.1 乳酸菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶置于恒温培养箱内，37℃静置培养24~48h，即为扩培好的乳酸菌菌悬液。
3.2.2 芽孢杆菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶置于恒温摇床内固定，在适宜条件下培养14~18h，即为扩培好的芽孢杆菌菌悬液。
3.2.3 无细胞发酵上清液的制备：在超净工作台内，吸取扩培好的乳酸菌（或芽孢杆菌）菌悬液10ml，移入到无菌的50ml离心管中，旋紧离心管盖，于8000 rpm/min，离心15min，离心结束后，于超净工作台中，吸取5ml上清液，用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤，即为无细胞发酵上清液。
3.3 双层平板的制备3.3.1 制备琼脂含量为2.0%的MH肉汤培养基，冷却至60℃左右，用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到水平放置的无菌平皿中，洁净工作台中晾干；3.3.2 用无菌镊子取6个事先灭过菌的牛津杯均匀放在上述倒有琼脂的平皿中，放置牛津杯时动作要轻；3.3.3 制备琼脂含量为1.0%的MH肉汤培养基，冷却至55℃左右（琼脂培养基可置于55℃的恒温水浴锅中保温），每100ml MH软琼脂培养基接种0.1ml指示菌，混合均匀；用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到事先放好牛津杯的平板上，于超净工作台中晾干后，立即进行抑菌试验。
抑菌试验操作规程
1．范围
本规程适用于所有益生菌抑菌活性的测定。
2．试验前准备
设备及器材：高温蒸汽灭菌锅，超净工作台，酒精灯，恒温摇床，恒温水浴锅，恒温培养箱，平皿（直径9cm），牛津杯（内径6mm，外径8mm，高10mm），移液管（10ml），微量移液器及吸头（1ml、200ul）。
3．操作步骤
3.1 病原菌的制备
3.1.1 病原菌：鸡致病性大肠杆菌，鸡致病性大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。
3.1.2病原菌扩培：在超净工作台内，挑取一环病原菌接种于100 ml无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200 rpm，培养8~12h，即为扩培好的病原菌悬液。
3.2 检测样品的制备
3.2.1 乳酸菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶置于恒温培养箱内，37℃静置培养24~48h，即为扩培好的乳酸菌菌悬液。
3.2.2 芽孢杆菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶置于恒温摇床内固定，在适宜条件下培养14~18h，即为扩培好的芽孢杆菌菌悬液。
3.2.3 无细胞发酵上清液的制备：在超净工作台内，吸取扩培好的乳酸菌（或芽孢杆菌）菌悬液10ml，移入到无菌的50ml离心管中，旋紧离心管盖，于8000 rpm/min，离心15min，离心结束后，于超净工作台中，吸取5ml上清液，用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤，即为无细胞发酵上清液。
3.3 双层平板的制备
3.3.1 制备琼脂含量为2.0%的MH肉汤培养基，冷却至60℃左右，用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到水平放置的无菌平皿中，洁净工作台中晾干；3.3.2 用无菌镊子取6个事先灭过菌的牛津杯均匀放在上述倒有琼脂的平皿中，
放置牛津杯时动作要轻；
3.3.3 制备琼脂含量为1.0%的MH肉汤培养基，冷却至55℃左右（琼脂培养基可置于55℃的恒温水浴锅中保温），每100ml MH软琼脂培养基接种0.1ml指示菌，混合均匀；用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到事先放好牛津杯的平板上，于超净工作台中晾干后，立即进行抑菌试验。
3.4 加样
在牛津杯的孔中加入200μl菌悬液（或无细胞发酵上清液），同时以相应的培养基作为阴性对照。
加样前要在双层平板上做好标记，以免错加或漏加。
加样后的平板，不能随意移动，要保持水平轻拿轻放。
3.5 培养及结果观察
加样结束后，将平板置于恒温培养箱中，37℃培养12~14h，即可观察结果。
用游标卡尺测定抑菌圈直径，当抑菌圈直径大于10mm，即认为检测样品对指示菌有抑菌作用。
童京京
2015-1-15。
