Qiagen 质粒抽提试剂盒

质粒抽提一、溶液及培养基配制：1、LB液体培养基（1）配方:酵母提取物（Yeast extract）5g/L胰蛋白胨（Tryptone）10g/L（2）配制：A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。

B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于锥形瓶中，搅拌使药品全部溶化。

C、定容。

D、加塞、包扎。

F、高压灭菌121 C, 30min ,灭菌后室温保存备用。

若要分装需要在超净台内。

G、培养基完全溶解，降至室温后，加氨苄霉素（AMP ）。

先将AMP用三蒸水配制为100mg/ml母液，而后每1ml母液加至1000ml培养基。

（可以多配制一些，分装为1ml/管）2、LB固体培养基（1）配方:酵母提取物(Yeast extract)5g/L氯化钠（NaCl）5g/L胰蛋白胨（Tryptone）10g/L氨苄青霉素溶液100^g/ml （终浓度）（即100mg溶于1ml超纯水或生理盐水或PBS，再加入1000ml培养基）琼脂粉15g/L（2）配制：A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。

B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，搅拌使药品全部溶化。

C、5mol/L NaOH 溶液调pH 到7.4。

D、定容。

E、分装、加塞、包扎。

F、高压灭菌121 C, 30min。

G、火菌后，将融化的LB固体培养基置与55 C的水浴中（或室温），待培养基温度降到55C时（手可触摸）加入抗生素，（免温度过高导致抗生素失效），并充分摇匀。

（3）倒板：一般20ml倒1块板，培养基倒入培养皿后，打开盖子，水分晾干后盖上盖子并用封口膜封口，4 C保存备用，使用前提前拿出，防止水蒸气滴入板中。

首要检查是否有足够的固体和液体LB培养基，基本上每个质粒需要一块固体培养基，小摇的2ml和大摇的250ml LB培养基。

小摇的可以在一个50ml离心管中预备着，每次直接取用。

转化所需L形玻璃棒需确认已灭菌摇菌器申请，张评浒老师，王雪师姐；注意：考虑到多种东西需要灭菌，可以在转化之前或者小摇大摇那天一起灭菌。

纯化高转染级别的质粒DNA 【工作台流程】BENCH PROTOCOL准备工作：1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1)2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water)3.可选：加 LyseBlue 试剂于 Buffer P14.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解5.Buffer P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill6.细菌扩增培养补充：1.准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液，2个用于接下来的菌块重悬和与buffer混合2.1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯，因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA3.5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制4.准备1个冰浴盒用于步骤65.准备室温下的异丙醇10.5ml6.4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳步骤：peocedureA.细菌培养、收获和裂解bacterial culture,harvest & lysis1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度；6000×g；15min从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落，2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm，注意孵化容器容积至少4倍于培养液）抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。

(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。

(孵化容器容积至少4倍于培养液，培养至细菌密度约3-4×109/ml，即离心后菌块湿重约3g/L培养基)培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠溶于800ml蒸馏水，用1 N NaOH 调pH值至7.0，用蒸馏水调整至1L。

QIAGEN Plasmid Mini,Midi,and Maxi Kits（说明书中文翻译版）Plasmid Midi Kit(cat.Nos.12143and12145)The kit can be stored at room temperature(15~25℃)for up to2years.使用前的注意事项：（1）将Rnase A solution加入Buffer P1中，混匀，2~8℃储存。

（2）可选步骤：按1:1000的比例将LyseBlue试剂加入到Buffer P1中。

（3）使用前在4℃预冷Buffer P3，检查Buffer P2是否出现SDS沉淀。

（4）需准备好异丙醇和70%酒精。

（5）标志：圆形代表小提试剂盒；三角形代表中提试剂盒；正方形代表大提取试剂盒。

表1推荐LB培养物体积试剂盒高考倍质粒低拷贝质粒小提3mL不推荐中提25mL100mL大提100mL500mL具体操作步骤：1.收取过夜培养的细菌培养物，在4℃条件下6000×g离心15min。

2.（弃去上清液）使用4mL Buffer P1重悬菌体沉淀。

3.加入4mL Buffer P2，颠倒4~6次使彻底混匀，室温（15~25℃）孵育5min。

注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液会变蓝。

4.加入4mL预冷过的Buffer P3，颠倒4~6次使彻底混匀，冰上孵育15min。

注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液混匀后直至蓝色消失。

5.在4℃条件下≥20000×g（14000×g）离心30min。

6.平衡柱子QIAGEN-tip100：加入4mL Buffer QBT，通过重力流使液体过柱。

7.将第5步的上清液转移至QIAGEN-tip中，使其依靠重力流通过柱中的树脂。

8.使用10mL Buffer QC洗涤QIAGEN-tip，使Buffer QC依靠重力流通过柱中的树脂。

洗涤2次。

质粒提取试剂盒原理质粒提取试剂盒是一种用于提取质粒DNA的试剂盒，其原理主要基于离心、蛋白酶消化和硅胶膜吸附等方法。

在进行质粒提取实验时，首先需要将含有目标质粒的细菌培养物进行离心，将细菌沉淀物收集起来。

接着，通过加入蛋白酶等消化酶，将细菌细胞壁和膜等部分消化掉，释放出目标质粒。

最后，利用硅胶膜的吸附作用，将目标质粒吸附在硅胶膜上，再通过洗涤等步骤将杂质去除，最终得到纯净的质粒DNA。

质粒提取试剂盒的原理主要包括以下几个步骤：1. 离心，将含有目标质粒的细菌培养物进行高速离心，使细菌沉淀成为一个团。

这样做的目的是将细菌细胞从培养基中分离出来，为后续的蛋白酶消化提供条件。

2. 蛋白酶消化，将离心后的细菌沉淀物加入蛋白酶等消化酶，通过消化细菌细胞壁和膜等部分，释放出目标质粒。

这一步骤是质粒提取试剂盒中至关重要的一步，能够有效地将目标质粒从细菌细胞中释放出来。

3. 硅胶膜吸附，将经过蛋白酶消化的细菌沉淀物加入硅胶膜柱中，利用硅胶膜的吸附作用将目标质粒吸附在硅胶膜上。

硅胶膜具有很强的吸附能力，可以有效地将目标质粒与其他杂质分离开来。

4. 洗涤，通过洗涤等步骤将杂质去除，最终得到纯净的质粒DNA。

这一步骤是为了去除硅胶膜上的杂质和残余的蛋白酶等物质，使得提取的质粒DNA更加纯净。

总结来说，质粒提取试剂盒的原理是通过离心、蛋白酶消化和硅胶膜吸附等方法，将目标质粒从细菌细胞中提取出来，并最终得到纯净的质粒DNA。

这一原理简单易懂，操作方便，适用于实验室中的质粒提取工作。

通过对质粒提取试剂盒原理的深入了解，可以更好地进行质粒提取实验，并取得准确可靠的实验结果。

QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi KitCatalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。

在开始之前作如下准备1）按照说明把RNase A加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。

选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P12）pre-chill Buffer P3 4°C存放。

3）检查Buffer P2 是否有SDS沉淀物，可以放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。

4）准备异丙醇。

5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml的96-100%的酒精。

大量质粒提取过程在LB培养基中种植转化的E.coli菌。

使用100ml（高复制数的质粒）或者250ml（低复制数的质粒）过夜培养。

操作步骤如下1.收获LB培养过夜的细菌，在6000g，4℃条件下离心15min。

2.加入10ml Buffer P1（根据SBI要求加倍，用20ml）重悬细菌。

3. 加10ml Buffer P2（根据SBI要求加倍，用20ml），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。

如果使用了LyseBlue试剂，溶液应该变成均匀蓝色。

4.在孵育期间，打开针口的密封盖.并把过滤器放到合适的架子上。

5.加入10ml冰浴的Buffer P3（根据SBI要求加倍，用20ml）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。

如果加入了LyseBlue试剂，混匀试剂直到没有颜色。

6.将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。

打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。

7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。

8.将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。

9.将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。

质粒提取试剂盒简介质粒提取试剂盒是一种用于从细菌中提取质粒的试剂盒。

质粒是一种可以在细菌细胞内自主复制的环状DNA分子，广泛应用于基因工程和分子生物学研究中。

质粒提取试剂盒通过一系列化学和物理方法，可以快速、高效地提取细菌中的质粒，并纯化出目标质粒，供后续实验使用。

组成质粒提取试剂盒一般包含以下主要试剂：1.细菌裂解缓冲液：用于破坏细菌细胞膜，释放细菌内的质粒和其他细胞组分。

2.蛋白酶K：用于降解细菌细胞中的蛋白质，减少蛋白质对质粒提取的干扰。

3.碱式溶液：用于中和细菌裂解液中的酸性成分，以保持适宜的酸碱平衡。

4.酚/氯仿混合溶液：用于分离DNA和蛋白质。

DNA会转移到酚相，而蛋白质则会转移到氯仿相。

5.洗涤缓冲液：用于去除酚/氯仿混合溶液中的残余蛋白质和杂质。

6.乙醇：用于沉淀DNA。

7.纯化缓冲液：用于溶解和稀释沉淀的DNA，以得到纯净的质粒DNA。

使用步骤步骤一：细菌培养和扩增1.首先，选择含有目标质粒的细菌菌落，将其接种到含有适当抗生素的琼脂培养基上。

2.在恒温振荡培养箱中以适当的温度和时间对细菌进行培养，使其形成细菌液培养物。

3.将细菌液培养物按照说明进行扩增，获得足够的细菌量以便后续提取质粒。

步骤二：质粒提取1.向适量的细菌液培养物中加入适量的细菌裂解缓冲液，充分混匀。

2.在室温下孵育一段时间，使细菌细胞完全裂解。

3.加入适量的蛋白酶K，消化掉细菌细胞中的蛋白质。

4.加入碱式溶液，中和酸性成分。

5.加入等体积的酚/氯仿混合溶液，轻轻倒置试管，使混合溶液充分混合。

6.离心混合溶液，使溶液分为上层酚相、中间界面层和下层氯仿相。

7.将上层酚相转移到新的离心管中。

8.加入等体积的洗涤缓冲液，轻轻倒置试管，使混合溶液充分混合。

9.离心洗涤溶液，将上层酚相转移到新的离心管中。

10.重复洗涤步骤，直到洗涤液清澈无色。

11.加入冰冷的乙醇，使DNA沉淀。

12.用洗涤缓冲液洗涤DNA沉淀。

13.用乙醇洗涤DNA沉淀。

质粒提取试剂盒
质粒提取试剂盒是一种用于从细菌中提取质粒的实验工具。

质粒是细菌中的一种环状DNA分子，常用于基因工程和遗传学研究。

质粒提取试剂盒通常包含以下主要试剂：
1. 细菌裂解缓冲液：用于破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒。

2. 酚/氯仿溶液：用于提取DNA，并去除细菌的碎片和蛋白质。

3. 乙酸缓冲液：用于沉淀DNA。

4. 纯化缓冲液：用于纯化提取的质粒DNA。

使用质粒提取试剂盒的步骤一般包括以下内容：
1. 收集细菌：在培养基上培养转染了目标质粒的细菌。

2. 细菌浸液：将培养的细菌转移到裂解缓冲液中，使其充分裂解。

3. 加入酚/氯仿溶液：将酚/氯仿溶液加入细菌浸液中，混合均匀，并离心分离液相。

4. 收集DNA：将DNA上清液收集到新离心管中，并加入乙酸缓冲液，沉淀DNA。

5. 洗涤DNA：倒掉上清液，用乙酸缓冲液洗涤DNA沉淀。

6. 溶解DNA：将纯化缓冲液加入DNA沉淀中，将DNA溶解。

通过质粒提取试剂盒，可以方便地从细菌中提取质粒DNA，并进行后续的分子生物学实验。

质粒提取操作步骤——QIAGEN(德国凯杰)质粒提取试剂盒一、细菌培养物的生长1. 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到2-5mL含有适当抗生素的LB液体培养基中生长。

将液体培养基置于37℃，300rpm的摇床中振荡8小时。

2. 用LB培养基以1/500~1/1000的比例稀释含菌落的培养基。

若为了获得高拷贝质粒，用100-200ul含菌落液体培养基接种到100ml LB培养基中；若为了获得低拷贝质粒，用250~500ul含菌落培养基接种到250ml LB培养基中。

让其在37℃，300rpm的摇床中振荡12-16小时。

二、细菌的收获和裂解1. 在6000×g，4℃条件下离心15min，收获细菌。

2. 加入10ml Buffer P1重悬细菌。

3. 添加10ml Buffer P2，剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。

4. 加入10ml冰浴的Buffer P3到此溶菌产物中，晃动离心管4-6次使其混匀。

5. 将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。

6. 打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。

7. 添加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。

三、质粒DNA的纯化1. 将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液慢慢滴下排空。

2. 将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。

3. 用2×30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip柱。

4. 再用15ml Buffer QN洗脱DNA，用离心管收集DNA洗脱液。

5. 加入10.5ml异丙醇到洗脱液中使DNA沉淀下来，混匀。

15000×g，4℃离心30min，离心后小心倒出上清液。

6. 洗DNA用5ml无内毒素-70%乙醇(添加40ml 96%-100%乙醇到试剂盒的无内毒素水中)，15000×g，4℃离心10min。

纯化高转染级别的质粒DNA 【工作台流程】BENCH PROTOCOL准备工作:1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1)2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water)3.可选: 加 LyseBlue 试剂于 Buffer P14.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解5.Buffer P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill6.细菌扩增培养1.补充:2.准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液, 2个用于接下来的菌块重悬和与buffer混合3.1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯, 因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA4.5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制5.准备1个冰浴盒用于步骤66.准备室温下的异丙醇10.5ml7.4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳步骤: peocedureA.细菌培养、收获和裂解bacterial culture,harvest & lysis1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度；6000×g；15min从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落, 2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm, 注意孵化容器容积至少4倍于培养液）抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。

(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。

(孵化容器容积至少4倍于培养液, 培养至细菌密度约3-4×109/ml, 即离心后菌块湿重约3g/L培养基)培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠溶于800ml蒸馏水, 用1 N NaOH 调pH值至7.0, 用蒸馏水调整至1L。

质粒提取试剂盒原理
质粒提取试剂盒是一种用于提取质粒DNA的试剂盒，其原理是利用离心、溶解、吸附、洗脱等步骤将目标DNA从细胞裂解液中分离出来。

下面将详细介绍质
粒提取试剂盒的原理及各个步骤的作用。

首先，细菌裂解液中的细胞膜和细胞壁会被破坏，使得细胞内的质粒DNA暴
露出来。

接着，加入试剂盒中的一种缓冲液，能够使DNA和其他细胞成分分离开来，使得DNA能够在后续步骤中被提取出来。

然后，通过离心将细胞碎片和其他
杂质沉淀到管底，上清液中的DNA得以分离。

接下来，将上清液加入试剂盒提供
的柱子中，DNA会在柱子上被特定的材料吸附住，而其他杂质则会被洗脱掉。

最后，用洗脱缓冲液将DNA从柱子上洗脱下来，得到纯净的质粒DNA。

质粒提取试剂盒的原理是基于DNA的物理性质和化学性质，通过不同步骤的
组合实现对质粒DNA的高效提取。

在整个提取过程中，试剂盒提供的各种缓冲液
和柱子起着至关重要的作用，能够使DNA得以分离和纯化。

这种原理简单而高效，适用于从各种细菌中提取质粒DNA，为后续的分子生物学实验提供了可靠的DNA
样本。

总的来说，质粒提取试剂盒的原理是通过细胞裂解、DNA分离、DNA吸附、
洗脱等步骤，将目标DNA从细胞裂解液中提取出来。

这种原理简单易行，操作方便，适用于实验室中的质粒DNA提取工作。

希望通过本文的介绍，能够让大家对
质粒提取试剂盒的原理有一个更加清晰的认识，为实验工作的顺利开展提供帮助。