第六章基因工程抗体

双特异性抗体研究摘要：靶向肿瘤相关抗原与免疫效应细胞表面触发分子的双特异性抗体，可高效地将体内的免疫效应细胞富集于肿瘤细胞周围，激活免疫效应细胞特异性地杀伤肿瘤细胞，从而起到治疗肿瘤的目的，是目前肿瘤免疫治疗研究中的一个热点。

单链双特异性抗体(scBsAb)是目前比较有临床应用前景的一种小分子基因工程抗体，是在DNA水平上把编码不同单链抗体(scFv)片段的基因通过一段域间连接肽(interlinker)连接起来，直接表达成单链的双特异性抗体分子。

由于不同特异性的抗体片段之间为共价连接，稳定性好，可以在各种表达系统中稳定表达。

已有许多不同的氨基酸序列作为interlinker用来构建scBsAb。

一、双特异性抗体的制备方法早在单克隆抗体出现前，人们就已经知道双特异性抗体。

最早具有双特异性的抗体出现在1961年，是将两种不同特异性的多克隆抗体的Fab片段混合物经过温和氧化而制备的。

双特异性抗体的制备方法有以下几种：1.化学偶联法：在体外用化学交联剂如SPDP、DTNB、O-PDM等可将两种不同特异性的mAb或抗体片段通过二硫键或硫醚键连成双特异性抗体，同时设法避免链内或错配二硫键的产生。

该方法不需要细胞融合，制备简便迅速，产物易纯化。

但操作中难免由于改变抗体的抗原结合部位结构而破坏其活性。

目前，对交联剂本身的致畸、致癌性尚未有确切报道，该类BsAb 较多在体外用于基础研究、细胞毒性观察和特异性的鉴定。

有报道用O-PDM将三个不同特异性的Fab片段交联从而构建成三特异性抗体。

2.双杂交瘤法：广发应用的双特异性抗体生产方法是在二次杂交瘤中共表达两种不同特异性的mAb。

但是，共表达两种不同的mAb会产生九种不需要的轻、重链配对产物，有活性的双特异性IgG大约占10-50%。

而且，从这些结构相似的抗体中分离纯化目的蛋白也费时费力。

另外，多倍体的杂交—杂交瘤细胞稳定性差，若想连续获得BsIgG，必须经常进行克隆，以保持两套基因的完整。

基因工程抗体名词解释基因工程抗体是利用基因工程技术对人工合成抗体进行定制和改造的一种生物工程技术。

抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质，它可以识别和结合体内外的异物，从而协助机体进行免疫防御。

基因工程抗体通过选择性克隆和定制抗体基因序列，可以产生特异性更强、稳定性更好、生产成本更低的抗体。

基因工程抗体包括以下几种：1. 单克隆抗体（Monoclonal Antibodies）：基因工程技术可以使得单个淋巴细胞克隆产生大量相同的抗体，从而获得具有高度特异性的单克隆抗体。

这种抗体广泛应用于医学诊断、疾病治疗和科学研究等领域。

2. 重链抗体（Recombinant Antibodies）：重链抗体是利用基因工程技术使抗体重链蛋白的编码基因与其他蛋白的编码基因相融合，生成融合抗体。

这种重链抗体可以通过改变其结构和功能来提高其生物活性和稳定性。

3. 组合抗体（Bispecific Antibodies）：基因工程技术可以将两种不同的单克隆抗体的编码基因进行融合，产生具有双特异性的组合抗体。

这种抗体可以同时结合两个不同的目标分子，从而实现更强的疗效和更多样化的应用。

4. 人源化抗体（Humanized Antibodies）：由于小鼠源抗体和人类抗体在体内效价和安全性方面存在差异，基因工程技术可以通过改造抗体的基因序列，使得抗体具有更接近人类抗体的结构和功能。

这种人源化抗体更适合在治疗和预防疾病时使用。

基因工程抗体的应用广泛，其中的一些常见应用包括：1. 肿瘤治疗：通过基因工程技术，可以定制针对特定肿瘤抗原的单克隆抗体，用于治疗癌症。

2. 自身免疫性疾病治疗：基因工程抗体可以定制具有特异性和高效的抗体，用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等。

3. 传染病治疗：通过基因工程技术，可以改造抗体的结构和功能，用于治疗传染病，如艾滋病、流感和乙肝等。

4. 分子诊断：基因工程抗体可以用于检测和诊断疾病，如癌症标志物的检测和感染性病原体的检测等。

基因工程抗体[摘要]抗体在生物医学领域中的应用极为广泛,其制备技术经历了从多克隆抗血清、单克隆抗体到基因工程抗体等3个发展阶段。

基因工程抗体是按人类设计所重新组装的新型抗体分子,可保留或增加天然抗体的特异性和主要生物学活性,去除或减少无关结构,从而可克服单克隆抗体在临床应用方面的缺陷。

关键词: 基因工程抗体；抗体基因工程抗体,即应用基因工程技术将抗体的基因重组并克隆到表达载体中,在适当的宿主中表达并折叠成有功能的一种抗体分子。

一、基因工程抗体概述基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。

此技术的基本原理是[1],首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA,逆转录成cDNA,再经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因,按一定的方式将两者连接克隆到表达载体中,并在适当的细胞(如大肠杆菌、CHO细胞、酵母细胞、植物细胞及昆虫细胞等)中表达并折叠成有功能的抗体分子,筛选出高表达的细胞株,再用亲和层析等手段纯化抗体片段。

基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分,保留原有抗体的亲和力和特异性。

借助于基因工程技术,既可以对完整抗体,又可以对抗体片段进行改造。

二、基因工程抗体类型1.重组抗体片段小分子抗体以表达抗体轻重链可变区基因为主,含或不含外源肽链的分子较小的抗体片段,以分子小、体内半衰期短、免疫原性低、可在原核细胞系统表达、易于基因工程操作等特点而倍受关注。

主要包括单链抗体、双特异性抗体、二硫键抗体、抗体Fab段、单域抗体(single domain antibody,SDA)、三链抗体(triabody)、抗体F(ab')2等。

目前研究较多的是单链抗体、双特异性抗体、二硫键抗体和抗体Fab段。

1.1单链抗体单链抗体单链抗体是用基因工程方法将抗体重链和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组蛋白,是保持了亲本抗体的抗原性和特异性的最小功能型抗体片段,具有分子小、免疫原性低、无Fc端、不易与具有Fc受体的靶细胞结合、对肿瘤组织的穿透力强等特点,可作为将药物、毒素、放射性核素、细胞因子导向肿瘤的有价值分子;还可以将单链抗体基因导向到肿瘤细胞,在肿瘤细胞中表达,干扰肿瘤细胞蛋白表达,这种抗体称为胞内抗体。

基因工程抗体综述前言：抗体的实验研究始于上世纪末，1888年Emile及Alexander Yersin由白喉杆菌的培养上清分离到可溶性毒素，后者注入动物内可引起典型的白喉发病症状。

Von Behring及同事Kitasato(北里)报告，以白喉或破伤风毒素免疫动物后，其血清中可产生一种中和毒素的物质，该物质能阻止毒素引发的疾病，来自实验动物的抗血清用于感染的患儿，获得明显的治疗效果，尤其是在发病的早期。

于是将能中和毒素的物质称为抗毒素(antitoxin)，随后引入抗体一词，泛指抗毒素一类的物质，而将引起相应抗体产生的物质称为抗原（antigen）。

1896年Gruber和Durham发现了凝集素。

1897年Draus发现可与相应抗原形成沉淀反应的抗体，称为沉淀素。

于是认识到毒素及细菌之外的众多蛋白质均可诱导相应抗体的生成，是一种广义的免疫现象。

直至本世纪30年代，“抗体”一词才得以通用，1939年，Tiselius和Kabat采用电泳方法证实抗体的活性存在于泳动速度最慢的血清组分，称为丙种球蛋白（gammaglobulin）。

免疫后的抗血清的电泳图形中，gamma球蛋白明显升高，抗血清经相应抗原吸收后再电泳，其gamma球蛋白又恢复到正常血清图形相同。

在之后相当长的一段时期内，人们曾将抗体与gamma球蛋白作为同义词相互用。

但事实上，具有抗体活性的球蛋白并不都泳动至gamma组分，反之在gamma组分的球蛋白并不都具有抗体活性。

在1968年和1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会所属专门委员会决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白（immunoglobulin），由此可见，抗体是一个生物学和功能的概念，可理解为能与相应抗原特异结合的具有免疫功能的球蛋白，免疫球蛋白则是一个结构概念，除抗体外，它尚包括正常个体中天然存在的免疫球蛋白及病理情况下（如骨髓瘤，巨球蛋白血症及冷球蛋白血症等）患者血清中的免疫球蛋白及其亚单位等，因此，抗体是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都具有抗体活性，至少目前尚不了解这此天然的或病理的球蛋白的免疫功能。

基因工程抗体名词解释
基因工程抗体是由人工合成或修改的基因来产生的抗体，也称为重组抗体。

与传统的抗体不同，基因工程抗体不受限于动物来源，可以通过人工合成的方式来获得。

基因工程抗体的制备过程包括选择目标抗原、构建重组抗体基因、转染宿主细胞、高效表达和纯化等步骤。

因为基因工程抗体可以定制化地设计和制备，具有高度特异性和亲和力，因此在生物医学研究、临床诊断和治疗等方面具有广泛的应用前景。

常见的基因工程抗体包括单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体和重组抗体等。

其中，单克隆抗体是指由单一克隆细胞产生的抗体，具有高度特异性和一致性；人源化抗体是将动物源的抗体人源化，避免了人体免疫系统对异种抗体的攻击；嵌合抗体是将两种或以上不同来源的抗体结合起来产生的新型抗体，具有更广泛的抗原覆盖范围和高亲和力；重组抗体则是根据目标抗原的结构和性质，设计并合成新的抗体基因来产生新型抗体，具有更高的特异性和亲和力。

基因工程抗体的发展将会在生物医学领域带来更多的应用和发展机会，同时也将推动基础研究和药物研发的进步。

第六章基因重组与基因工程教学大纲要求1.熟悉基因工程、基因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念；2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程；3.了解重组DNA技术在医学上的应用。

教材内容精要一、自然界的基因转移和重组自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。

基因重组的方式有：接合作用、转化、转导、转座。

1．接合作用(Conjugation) 当细胞(细菌)与细胞(细菌)相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞(细菌)转移到另一个细胞(细菌)。

2．转化与转导作用(1)转化作用(Transformation)：由外源性DNA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。

(2)转导作用(Transduction)：当病毒从被感染的(供体)细胞释放出来，再次感染另一(受体)细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。

3．转座(转位)(Transposition) 可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。

故由插入序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。

转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。

可分为插入序列(insertionsequenceIS)转座和转座予(transposons)转座。

4．基因重组不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。

基因重组有两种类型：位点特异的重组(sitespecial recombmatlon)和同源重组(homologous recomblnation)。

二、重组DNA技术’1．重组DNA技术的相关概念(1)DNA克隆：克隆(Clone)就是来自同一个体的相同的集合。

DNA克隆（DNA clone）：应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的重组DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。

2023-10-30contents •基因工程抗体概述•基因工程抗体技术•抗体工程技术•基因工程抗体和抗体工程的应用•未来展望与挑战目录01基因工程抗体概述基因工程抗体是指通过基因工程技术对抗体基因进行改造或合成，以产生具有特定性能的抗体分子。

基因工程抗体是通过操作DNA分子层面，根据需求对抗体基因进行各种形式的改造，如插入、敲除或突变等，以获得具有特定性能或去除不良特性的抗体。

基因工程抗体的定义基因工程抗体的种类将鼠源性抗体的人源化改造，使其具有人抗体的亲和性和特异性，同时降低鼠源性抗体的免疫原性。

人源化抗体单克隆抗体双特异性抗体突变体抗体通过杂交瘤技术，将鼠源性的B细胞和骨髓瘤细胞融合，产生的杂交瘤细胞能产生单一抗体的克隆。

具有识别两种不同抗原表位的抗体，通常用于肿瘤免疫治疗和自身免疫性疾病的治疗。

通过基因突变技术，改造抗体分子的结合位点，以获得更强的亲和力、更高的稳定性或降低免疫原性。

基因工程抗体可以用于肿瘤免疫治疗，如靶向肿瘤细胞的抗体-药物偶联物(ADC)，通过将细胞毒性药物偶联到抗体上，实现定向杀伤肿瘤细胞。

肿瘤免疫治疗基因工程抗体可以用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等，通过抑制或调节免疫反应达到治疗目的。

自身免疫性疾病治疗基因工程抗体可以作为疫苗的一部分，通过刺激机体产生特异性抗体来增强免疫力。

疫苗开发基因工程抗体的应用02基因工程抗体技术从免疫原刺激的B细胞中提取抗体基因，包括重链和轻链可变区基因。

抗体基因的获取将抗体基因与适当的载体连接，构建成表达载体。

载体构建将表达载体导入合适的宿主细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞系。

转化宿主细胞在宿主细胞中表达抗体，通常以融合蛋白的形式存在。

抗体表达抗体基因的克隆和表达抗体库的建立和筛选抗体筛选通过亲和力、特异性等指标筛选出高亲和力和高特异性的抗体。

抗体库的建立通过PCR扩增抗体基因，构建成多样性抗体库。

B细胞克隆从免疫动物的脾脏或淋巴结中提取B细胞，并克隆化。

基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体基因工程抗体【摘要摘要摘要摘要】：基因工程抗体以其独特的优点(免疫原性低、可按人的意愿加以改造等)正逐渐取代动物源性单抗。

随着基因工程和蛋白质工程等生物技术在抗体研制领域的广泛应用, 适应不同需要的基因工程抗体的种类日趋多样化, 构建日趋合理化, 在体内的生物学效应也日臻完善, 使之较天然单抗的治疗效果更好, 范围更广, 并在初步临床试用中展示了光辉的前景。

【关键词】：基因工程抗体生物技术【前言】：单抗作为一种有效的新型生物制剂促进了基础医学、临床医学、生物学、农学等众多生命学科的发展, 尤其在疾病的预防、诊断及治疗方面的作用日益重要。

然而作为体内的应用, 啮齿类动物单抗的高免疫原性, 使所有病人均发生不同程度的人抗鼠抗体反应(HAMA), 削弱了治疗的有效性, 并对清除抗体的器官产生毒性损害, 因此其应用严重受限。

为了创造出更理想的治疗用抗体分子, 将制备单抗的细胞工程技术与生产重组分子的基因工程技术和蛋白质工程技术相结合, 产生了基因工程抗体。

短短的几年研究使得这个领域的发展日新月异, 目前已成为抗体应用研究的热点。

但随着研究的深入进展, 也暴露出许多问题。

目前在以单抗为基础的临床治疗研究中, 面临五个最重要的问题及技术挑战:(1)使基因工程抗体具有与亲本抗体相一致的亲和力及特异性;(2)(2)克服人抗动物单抗及人抗任何与单抗相交联的细胞毒性物质的免疫反应;(3)(3)制备合适的细胞毒性物质;(4)(4)符合体内药物动力学及生物分布特性;(5)高产量, 低成本。

本文综述了近几年国内外学者为攻克这几个难题在基因工程抗体领域所做的努力及研究进展。

1.基因工程抗体概述基因工程抗体又称重组抗体, 是指利用重组DNA 及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配, 经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。

目前报道的基因工程抗体很多, 分类方法不一, 大体可以分为三类。

基因工程抗体的定义及种类
基因工程抗体是通过基因工程技术手段，将人工合成的抗体基因导入到生物体中，使其能够产生特定的抗体蛋白。

基因工程抗体具有高效、可定制、可扩展的特点，被广泛应用于生物研究、医学诊断和治疗等领域。

根据抗体来源的不同，基因工程抗体可以分为以下几类：
1. 全人源抗体：完全由人类基因编码的抗体，与人体内自然产生的抗体非常相似，因此具有较低的免疫原性和较高的亲和力，被广泛用于治疗人类疾病。

2. 人鼠嵌合抗体：将人源的可变区（variable region）基因与
小鼠的恒定区（constant region）基因组合，形成具有人源可
变区和小鼠源常变区的抗体。

这种抗体在结构上更接近于人体抗体，可以减少免疫反应。

3. 草鼠抗体：有时称为小鼠源抗体，是最早被研究和开发的基因工程抗体。

草鼠抗体的可变区与小鼠相同，常量区与人类相似。

尽管草鼠抗体具有较高的免疫原性，但其广泛用于研究和诊断领域。

4. 单特异性抗体：这是由单个抗体链变体或人工构建的抗体基因克隆产生的抗体。

与完整抗体相比，单特异性抗体更小，更便于制备和改造，广泛应用于研究和临床领域。

5. 二抗（二抗体）：由两种不同的单克隆抗体通过基因工程技
术合并而成，具有双重特异性。

这种抗体可用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。

总的来说，基因工程抗体的种类非常丰富，每一种都具有特定的特点和应用价值。

随着基因工程技术的不断发展，未来还会有更多新型的基因工程抗体涌现。

基因工程抗体检测原理及方法基因工程抗体检测原理及方法，说起来很高大上，实际上它就是通过一种“魔法”般的方式，帮助我们在看不见的细微世界里找到病原、毒素，甚至是我们身体里面的某些小小的异常。

可能你会想：“这和咱平常看电视或者做菜有什么关系？”别急，先听我慢慢给你解释清楚。

基因工程抗体呢，就像是一个超级侦探，它们被设计得既聪明又灵敏，能专门识别特定的“罪犯”——那些坏东西，比如病菌或者病毒。

咱们身体里有好多的细菌、病毒，有时候它们偷偷摸摸地潜伏在你身体的某个角落，咱不小心就被它们坑了。

但这个侦探不一样，经过基因工程的“训练”后，它们就变得无比精准，可以在你根本没有感觉到的情况下，找到这些潜在的“坏蛋”。

神奇吧？基因工程抗体的工作原理并不复杂。

大家都知道，抗体就像是我们体内的防卫队员，它们专门打击入侵者。

现在，科学家通过基因工程技术，把这些抗体“升级”了，赋予它们更多的能力，使它们变得更加专一，能精准地识别和结合某一种特定的物质。

就像你找一个人帮你做事，他只做你交代的任务，不做其他的，那效率多高！这时候，这些改造过的抗体就变成了超级特工，能在检测过程中迅速锁定目标，准确地告诉我们有没有问题。

有了这群聪明的侦探，咱们在做抗体检测时，效率自然提升了。

举个简单的例子，就像是你把一堆资料扔到桌子上，随便翻翻就能找到你要的那个文件。

原来那些复杂的检验流程，现在通过基因工程抗体的辅助，变得更加简便高效。

咱们通常会用抗体检测来检测体内是否有病原，比如艾滋病、乙肝、结核等，甚至是一些新型病毒，比如新冠病毒。

也就是说，通过这种技术，你基本上能迅速判断你的身体状况，这比盲目去医院检查好多了。

没错，这就是它的魔力——通过高科技手段，快速找出问题，不让坏东西趁虚而入。

方法上呢，通常咱们会用到几种手段来实现抗体检测。

常见的比如免疫层析法、酶联免疫吸附法等等。

听上去可能有点拗口，但实际上就是通过把特制的抗体和样本结合，看看会不会发生反应。

基因工程抗体概述和基本技术(Genetic Engineering Antibody)一、概述以生物高技术为手段，将动物淋巴细胞产生的抗体基因，人为地使其在非淋巴细胞中表达，所产生的抗体称基因工程抗体。

产生抗体的基因工程是建立在单克隆抗体(McAb)技术之上的，如果说后者是生物科学的一场革命，那么抗体的基因工程技术无疑是这场革命的拓宽和延续。

1975年，Khler和Milstein等创立的B淋巴细胞杂交瘤技术给抗体技术的深入研究及应用带来了突破，单克隆抗体作为临床诊断、治疗、预防及基础理论研究的新型制剂，已日益显示出重要的作用和广阔的应用前景，尤其是McAb或“McAb复合物”对临床某些疾病如肿瘤的治疗作用更引人注意。

将McAb与化疗药物、毒素或同位素等连接后，借助McAb的特异性识别，可有效地将治疗性药物运送到靶细胞，这种称为魔弹(magic bullets)的导向药物疗法的出现，曾令人们兴奋不已，以为找到了攻克癌症的尖端武器。

尽管这一技术有许多不可比拟的优点，随着研究的深入，也暴露出许多问题，其中最主要的就是难以获得大批量的人类杂交瘤抗体，致使用于临床治疗的McAb绝大多数都来源于小鼠和大鼠。

由于人和鼠之间遗传背景的差异，在人体内使用鼠源McAb，会被作为外源性蛋白抗原而产生人抗鼠抗体(human anti-murine antibodies, HAMA)，这种抗体会被迅速清除，如由静脉注入人血液中的小鼠单抗，会妨碍小鼠McAb与抗原或靶细胞的结合，从而降低McAb的治疗效应，更为重要的是HAMA可在人体内与小鼠McAb结合，可产生类似血清病的超敏反应，因而限制了鼠源McAb在临床上的反复使用。

最好的办法是应用人源性单抗。

但人-人杂交瘤技术尚未出现重大的突破，存在着建株困难、Ig产量太低、稳定性和亲和力差，以及本身还分泌一些杂蛋白等问题。

基因工程抗体技术依赖于两个基础：一是抗体的结构功能关系以及抗体多样性的遗传机制，二是分子生物学技术进展，特别是PCR技术，为基因片段的大量扩增提供了简单有效的途径。