植物组织培养实验室的构建与操作技术(PPT)

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植物组织培养常规技术幻灯片PPT

（3）确定最佳的取材时期。（4）内部已污染的材料弃之不用。 2. 材料表面灭菌（1）对灭菌剂的要求（2）常用灭菌剂种类（3）灭菌方法
常用外表灭菌剂的使用及其效果
种类
酒精升汞漂白粉次氯酸钠次氯酸钙
使用浓度（%）
70-75 0.1-0.2 饱和上清液 2-10 9-10
灭菌时间（分）
使用超净工作台应注意的问题
超净工作台不应安装在尘埃太多的地方。
在使用前应预热30-40分钟。
操作前应先将实验材料和操作器械、药品等物品事先放入台内，不要中途拿进。
台面上放置的东西不宜太多，特别是注意不要把东西迎面堆的太高，以免挡住气流。
定期检查，更换过滤器。
〔六〕接种器械的灭菌
❖灭菌方法灼烧灭菌法：
离心机
〔五〕驯化移植室
❖ 用途：主要用于试管苗的驯化和移栽；也可用于母株的预栽培。
❖ 设施：室内应备有弥雾装置、荫棚、移植床〔苗床〕、恒温恒湿控制仪、光照调节装置等设施以及培养土、培养盆〔钵〕、育苗盘等器材。
❖ 驯化移植室1、2
二、常用仪器设备与器械
〔一〕常用仪器设备：超净工作台；高压蒸汽灭菌锅；冰箱；烘箱；天平；蒸馏水器；酸度计；摇床与转床；光照培养箱
20~50
15
75~150
20
250~500
25
1000
30
1500
35
2000
40
121℃ 122℃ 120℃
排汽一定舒缓，以免造成培养基沸腾，沾染瓶塞引起污染。
负压过滤器
〔三〕植物材料消毒
1．减少材料带菌的防范措施（1）取材前对母株的预处理：减少带菌机会，改善生理

植物组织培养实验室的构建和操

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3）消毒间
配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅，较大的实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。
如果没有条件的话，可以将上述工作间合并成一个准备间，要求是设备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风，地面要便于清洁、防滑。
14
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2）培养基配制间
面积60平方米左右，配备的主要仪器设备有：冰箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积180-200L为宜，用于储存培养基母液、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保存植物材料。天平应有不同感量。
PHS-802中文台式酸度计
通用型或经济型酸度计43
（三）观察分析仪器设备
显微镜类型：倒置显微镜普通显微镜荧光显微镜电子显微镜体视显微镜
第一章组培的基本条件及一般技术
一、实验室设置及仪器设备
实验室是进行组培研究的主要场所，应能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌操作、培养、鉴定等多方面的工作。
第一章组培的基本条件及一般技术
1.构成与配置
准备室
缓冲室基本实验室无菌操作室
实验室组成
培养室
细胞生物学实验室辅助实验室温室
第一章植组物培组的基织本培条件养及一般技术
▪ 第一章植物组织培养实验室的构建和操作技术
第一章组培的基本条件及一般技术
第一节实验室及主要设备
第一章组培的基本条件及一般技术

园艺植物组织培养ppt课件

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植物组织培养的应用原理
▪ 细胞的分化和形态建立：由脱分化的细胞再分化出完整植株有两种途径：一种叫做不定器官形成(adventitious organ formation)或叫做器官形成 (organogenesis)，即在愈伤组织的不同部位分别形成独立形成不定根和不定芽，另一种叫做体细胞胚胎发生 (somatic embryogenesis) ，即在愈伤组织的表面形成类似于合子胚的结构，我们称其为为体细胞胚，不定胚 (adventitious embryo)或胚状体 (embryo )，体细胞胚胎所经历的发育阶段与合子胚相似，一般经历球形胚、心型胚、鱼雷形胚和子叶胚4个发育阶段。
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奠基阶段
▪ 20世纪50年代开始以后
1952年Morel和Martin
1953-1954年Muir 1955年Miller 1957年skoog和Miller
1958年Steward
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迅速发展阶段
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1
绪论第一章、实验室设备和基本操作技术第二章、植物组织器官培养第三章、茎尖分生组织第四章、单倍体细胞培养第五章、细胞培养第六章、种质保存第七章、组培苗工厂化生产的经营与管理
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2
参考书
✓ 植物细胞组织培养，刘庆昌、吴国良，中国农业大学出版社，2003.1
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组织培养类型
➢ 根据培养方法
1 平板培养 2 微室培养 3 悬浮培养 4 单细胞培养
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组织培养类型
➢ 根据培养基的作用 :1 诱导培养; 2 增殖培养; 3 生根培养 ➢ 根据培养目的: 1 脱毒繁殖; 2 微体快繁; 3 试管育种;试管嫁接 ➢ 根据培养条件:1 光培养; 2 暗培养 ➢ 根据培养过程:1 初代培养;2 继代培养

植物组织培养基本理论与操作技术(PPT 42页)

(四)、pH值
1.培养基适宜PH值5.0-6.5，一般为5.6－5.8；可用0.1M的NaOH和HCl溶液进行调整。
2.ｐH值影响培养基的硬度。
PH＞6.5 PH＜5.0
培养基会变硬培养基不易凝固
3.灭菌之前，培养基的ｐH要比标准提高0.2 －0.3个单位。
(五)、气体(必要条件)
1.培养瓶内氧气的充足与否与封口材料有关。可用棉塞或特制的封口塑料。通气最好的是棉塞，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。
磁力搅拌器
恒温水浴锅
冰箱
2、配药室
功能：培养基母液的配制、药品贮藏等。
配备：工作台；冰箱、各类天平、酸度计、药品橱、移液器、各类玻璃容器等。
要求：干燥、洁净。
药品橱
工作台
电光分析天平
电子天平
托盘天平
3、贮藏室
•功能：贮藏各种上玻璃器皿、日用品等。 •结构：明亮、干燥。 •面积：根据需要而定
培养基中添加白糖可有效提高培养基的渗透压。
实训一
在参观完学院的植物组织培
？
养室后，你认为有存在什么问题？如果给你一块空地，请你设计一个合理的组培实验室以及需要配置的仪器设备。
•
1、先天下之忧而忧；后天下之乐而乐。—— 范仲淹
•
2、捐躯赴国难，视死忽如归。——曹植
•
3、近乡情更切，不敢问来人。——宋之问
(五)、气体(必要条件)
2.培养基内氧气充足与否与培养基的种类和培养方式有关。 ◆固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。 ◆液体培养时，可考虑采取振荡培养的方式，以增加通气性。
(六)、渗透压

植物组织培养培养基及操作技术 ppt课件

1、多数植物要求pH5.6-5.8 2、用0.1-1N的NaOH和0.1-1N的HCI调节. 3、注意：经高压灭菌后，培养基pH会下降0.2-0.8,故
调整pH值时,应高于0.5；
pH的大小会影响琼脂的凝固能力，当pH>6.0 时，培养基将会变硬，pH <5.0时，琼脂凝固不好。
ppt课件
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培养基及其配制
（一）培养基的种类
1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基
2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基
3、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基
4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、改良培养基。
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培养基及其配制
初代培养基：指用来第一次接种外植体的培养基。
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培养基及其配制
3、肌醇
• 又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。 • 使用浓度：一般为lOOmg／L， • 作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状
体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。
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培养基及其配制
4、氨基酸 (amino acid）
特点：是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。
(5)KM—8P培养基:它是1974年为原生质体培养而设计的。
特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。
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2、White培养基 ◆1943年由White为培养番茄根尖而设计 ◆ 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素 ◆无机盐浓度较低 ◆使用广泛 ◆在生根培养、胚胎培养中有良好的效果
0.02 6.2 0.25

《实验植物组织培养》PPT课件

对照
NaCl
冰水
实验六
实验安排
一、配制培养基本周（第10周）二、无菌操作下周（第11周）
三、无菌培养四、观察记录
第12、13、14、15 周每周进行观察
※ 上交实验报告时间：第16周
实验目的
（1）深刻理解植物组织培养的基本概念和理论依据。
（2）训练利用实验室的条件来合理设计和完成实验的基本技能。
3.培养基灭菌
高压灭菌(压力1.1 kg/cm2 , 121℃, 20min )。湿热灭菌
共500mL,分装12瓶
大量元素25mL
微量元素5mL
各物质加入量：
有机物5mL
①大量元素母液（20×） 50mL/L；
肌醇5mL 铁盐2.5mL
②微量元素母液（100×） 10mL/L；蔗糖15g
③有机附加成分母液（100×） 10mL/L冷；凝脂2.9g
2.接种（1）切取材料左手持镊，右手持刀→切取材料→叶片：0.5cm×0.5cm，茎段带一个腋芽。
（2）接种取三角瓶→打开封口膜→接种叶块：正接，每瓶3块茎段：形态学下端插入培养基，每瓶3个
（3）重新封口（4）做标记班级，日期
三、无菌培养
将接种好的三角瓶置于培养室进行培养。培养条件：光/暗 = 14 h/10 h；
依据一
分化外植体愈伤组织芽、根完整植株
脱分化再分化
冲洗
表面消毒
外植体
接种
脱分化
愈伤组织
再分化再分化
植物组织培养的过程
实验设计的依据
依据二
培养基中植物生长物质的种类和浓度在脱分化和再分化中起重要作用，尤其是生长素和细胞分裂素类的比例。

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• 要求
缓冲间需3-5平方米，应保持清洁无菌；有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服； 1-2盏紫外灯定时照射，对衣物及空间进行灭菌。
３、无菌操作室（接种室）
•功能
外植体消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备等
•要求
环境干爽，清洁，居于上风位空间宜小不宜大地面、天花板及四壁密闭光滑，无卫生死角室内物品越少越好，尽可能减少空气流动
达到严格无菌的条件
组培的常见技术路线：外植体→愈伤组织→不定芽→生根→再生植株
基本的工艺流程：容器具洗涤，物质准备→配置培养基并灭菌→外植体消毒与无菌操作接种→观察、记录、处理（脱分化、再分化、继代） →再生植株
➢标准的组培实验室洗涤室、准备室、无菌室、培养室、观察室等 ➢基本组培实验室准备室（含配药室）、缓冲间、无菌操作室、培养室
酒精灯、镊子、解剖刀，解剖刀片、剪刀、培养瓶，刀剪架等
４、培养室
• 功能
接种的材料进行培养生长的场所（其设计以充分利用空间和节省能源为原则）。
• 要求：
• 能控制光照和温度 • 保持相对的无菌环境 • 有排风窗和换气扇等培养室的换气装置 • 有适宜的培养架，日光灯照明。
• 主要设备
• 培养架、培养箱、空调机、除湿机、换气扇、臭氧发生器等。
•维护方法
定期消毒（紫外线照射、气雾熏蒸、药品喷洒）及时维护（干燥、洁净）
接种室主要设备及用具
• 接种箱
主体为玻璃箱罩、入口有袖罩
• 超净工作台
操作台面半出，大于0.03um直径的微生物很难在工作台的操作空间停留
• 解剖镜
分离微茎尖、转基因等
• 无菌操作用的器具
植物组织培养实验室的构建与操作技术
第一节植物组织培养实验室及主要设备
一、实验室设计与设备
实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。
• 实验室的大小应取决于工作的目的和规模 • 按组织培养流程来设计，避免某些环节倒排，引
起日后工作混乱 • 利用一定的设备、器材和特殊的实验室结构设计，
➢除C、H、O外，其它矿质元素通常以一定浓度的无机化合物形式，按一定比例配制而成，溶于水中以离子态被吸收
➢N有硝态氮KNO3和铵态氮(NH4)2SO4两种形式（一般NH4—N对植物生长较为有利）。
微量元素
• 浓度小于0.5mmol／L的元素，有 Fe、Cu、 Zn等。
• 铁盐在合成叶绿素中起重要作用，缺铁影响到胚的发育，阻碍子叶变绿。
一．培养基成分
主要为：水无机盐有机化合物生长调节物质培养体的支持材料
１．水
➢ 水是植物体的重要组成成分，是一切代谢过程的介质和溶媒，是生命活动过程中不可缺少的物质。
➢ 培养基大部分是水（固体培养基约75—80%）
➢ 天然水或自来水不能直接用于培养基配制
➢ 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般
3.有机化合物(organic compound)
[基本培养基（只含有大量和微量元素）]
为使培养物的生长更好，还需添加各种有机成分：糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等
（１）糖类（碳水化合物）
碳源，维持培养基的渗透压在1.5-4.1MPa。多使用蔗糖。
不同浓度会影响细胞的增殖分化，试管苗生长与繁殖浓度2-3%，幼胚培养4-6%，某些特殊培养中用8-10%。
第二节培养基及其配制
定义：
培养基(culture medium)——根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的人工制作的营养物质。是植物组织培养的重要基质。
•不同植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同 •没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官 •找到一合适的培养基，是培养成功的基础。
细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖
应用双蒸水或超纯水。
•保持母液及培养基成分的精确性
➢ 大批量快速繁殖培养，可用单•质防蒸止水贮或藏过纯程净发水霉。变
２．无机盐类(inorganic element）
离体组织生长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为： ➢大量元素 ➢微量元素
➢大量元素
➢指植物所需元素的浓度大于0.5mmol／L的元素，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
1、准备室（化学实验室）
• 功能：进行一切与实验有关的准备工作
• 器皿洗涤、药品的配制 • 培养基配制与分装 • 培养基和培养器皿的灭菌 • 培养材料的预处理等
• 要求：
• 明亮、通风 • 便于多人同时工作 • 地面应便于清洁，并应进行防滑处理
准备室主要仪器设备：
(1)工作台 (2)药品柜 (3)冰箱
(5)恒温水浴锅 (6)蒸馏水发生器
蒸馏水用于配制母液或培养基（普通实验可以用自来水代替蒸馏水） (7)电炉 (8)高压灭菌锅进行培养基、水和器械用具的灭菌
不锈钢蒸馏水器（单蒸水）
(9)酸度计测定培养基及酶制剂的pH值（普通实验可使用pH试纸）
(10)烘箱干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌
和测定干物重
(11)摇床振荡培养
(12)离心机分离培养基中的细胞以及解离细胞壁后的原
生质体
PHS-802中文台式酸度计
通用型或经济型酸度计
全多温振型幅恒高温速培轨养道摇摇床床
２、缓冲室（注意门的朝向）
• 工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩 • 功能
减少人体从外界带入的尘埃等污染物。
小型臭氧发生器
二、培养器皿及用具
1、培养器皿（包括玻璃器皿和塑料器皿）各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。
2、微孔过滤器（细菌过滤器） 0.45微米，抽滤灭菌用，如激素
3、器械用具镊子、剪刀、解剖刀、接种针（铲）等。
思考题
• 1、一个正规的组织培养实验室应具备哪些房间？
• 2、组织培养常用的设备有哪些？各有何用途？
普通冰箱、低温冰箱等。主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。 (4)天平
感量0.001g的分析天平、感量0.0001g的电子天平（用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品）、感量为0.1g的托盘天平（用于称取用量较大的糖和琼脂等）放置在水平、干燥、不受震动的操作台上