荧光抗体稀释液(Evans Blue法)

免疫荧光染色法
原理
用荧光素标记已知抗体或抗原，检查细胞或组织标本相应的抗原或抗体。

在荧光显微镜下，抗原抗体特异性结合部位的荧光素受激发光照射而发出明亮的荧光。

根据荧光物存在的位置和数量，可确定抗原抗体在组织细胞中的位置和分布。

用于标记的荧光素有异硫氰酸（FITC )和四乙基罗丹明(RB200），前者发射的荧光波长为490~619nm（黄绿色荧光），后者发射的荧光波长为540~660nm（橙红色荧光）。

染液配制
0.5%伊文思蓝液：0.5g伊文思蓝溶于89mL pH7.2~7.4的PBS液中，再加11mL 1%NaN，过滤，4°保存。

荧光素标记抗体用0.02%伊文思蓝溶液稀释，伊文思蓝液将细胞背景染成蓝色荧光，与细胞特异性荧光（如异硫氰酸荧光素）形成鲜明的对比，并减少了飞特异性荧光。

染色步骤
用间接荧光法染色
（1）用95%酒精固定单层细胞培养物10~30min，或用冷丙酮固定5~10min
（2）PBS洗三次，每次5min，边洗边振荡
（3）滴加未标记的Ⅰ抗液，置37°湿盒中30min
（4）PBS洗三次，每次5min，边洗边振荡。

以除去飞特异性吸附的抗体，减少背景染色（5）滴加荧光标记Ⅱ抗，置37°湿盒中30min
（6）PBS洗三次，每次5min，边洗边振荡
（7）揩干玻片周围水分并甩掉材料上的水分
（8）荧光显微镜下观察。

伊文思蓝染色液(0.5%)简介：伊文思蓝(Evans Blue)又称偶氮蓝，分子式C 34H 24N 6Na 4O 14S 4，分子量为960.80，CAS 号为314-13-6伊文思蓝与台盼蓝都是细胞活性染料，常用于检测细胞膜的完整性和细胞是否存活。

活细胞不会被染成蓝色，而死细胞会被染成淡蓝色。

活细胞因有外排功能而无法被伊文思蓝染色，因此可以通过此方法在显微镜下区分死细胞与活细胞，但无法区分死亡与坏死。

组成：操作步骤(仅供参考)：(一)血脑屏障通透性1、 取处理后的实验动物(以小鼠为例)，静脉注射Evans Blue Stain (0.5%)，小鼠眼睛、皮肤出现蓝色。

0.5～1h 后处死小鼠，取目的脑组织。

2、 脑组织置于1.5ml 离心管中，加入1ml PBS ， 迅速用组织匀浆器将脑组织制成匀浆, 离心。

3、 取上清，加入等量三氯乙酸，4℃孵育。

该步骤亦可采用如下操作: 取上清，按上清:丙酮=3:7比例加入丙酮，室温孵育24h 。

4、 离心15min 。

5、 取上述溶液，用分光光度计测620 nm 处吸光值(OD 值)。

同时测定已知不同梯度的标准依文思蓝的OD 值，绘制标准曲线。

根据标准曲线计算出待测待测样品的依文思蓝含量。

(二)活细胞染色1、取100μl 重悬细胞到常规离心管内，入100μl Evans Blue Stain 轻轻混匀染色(染色时间可适当延长，但不宜超过10min)。

2、吸取少量经过染色后的细胞，用血细胞计数板计数。

通常如果要比较精确地进行定量，每个细胞样品至少数500个细胞，数出蓝色细胞和细胞总数。

细胞存活率计算公式如下:细胞存活率＝(细胞总数－蓝色细胞数)/细胞总数×100%注意事项： 编号 名称 DK0001 Storage Evans Blue Stain(0.5%) 100ml 4℃ 避光 使用说明书 1份1、Evans Blue Stain对人体有轻微毒性，请小心防护。

包括显微镜检查、分离培养及鉴定、药敏试验等在内的临床微生物的检验方法（检验程序）如何验证？很多人对此非常困惑。

由CNAS2016.5.30新鲜发布的《临床微生物检验程序验证指南》犹如一盏明灯给大家指明了具体的方向。

虽然是针对认可实验室制定的指南文件，其他实验室亦可参考。

部分内容节选4.3 显微镜检查显微镜检查程序包括涂片制备、染色镜检和结果报告过程。

实验室在开展各种类型显微镜检查（如革兰染色、抗酸染色、墨汁染色等）前应对本实验室使用的检验程序进行验证，并由经培训有涂片镜检能力的实验室人员操作。

检查方法可包括手工染片法和自动化染片法。

所有样品及其盛放容器均应当作有传染性物质，并按照实验室生物安全要求进行操作。

4.3.1 验证要求显微镜检查程序的验证应包括能力验证/实验室间比对和实验室内人员比对（当多名人员从事该项目时）。

如果没有可获得的能力验证或室间质评，实验室应自行组织实验室间比对（宜与通过认可的实验室比对）。

若实验室同时开展手工染片法和自动化染片法，应进行两种方法的实验室内部比对。

4.3.2比对方案4.3.2.1 样品数量每项检查应使用至少 5 份样品进行验证，覆盖全部样品类型，无菌样品类型包含阴性和阳性结果。

实验室应优先使用已知结果的留样样品，当不可获取时可采用模拟样品。

4.3.2.2 检验程序按临床标本常规方式处理,由本岗位工作人员使用实验室检验程序进行涂片制备、染色、镜检、判读。

4.3.2.3 结果报告根据实验室程序文件规定进行结果报告，其中抗酸杆菌应根据“分级报告标准”报告镜检结果。

4.3.3 可接受标准每项检查的比对结果符合率≥80% 。

4.4.1 血培养血培养检验程序包括从病人血液采集、运送、接收、孵育及监测的全过程。

目前临床实验室广泛使用全自动血培养系统。

临床微生物实验室血培养系统性能验证的主要目的是评估系统使用的培养基能否用于培养临床常见微生物（包括酵母菌、厌氧菌、苛养菌等）以及仪器（自动化系统）能否及时检测出血液中的大部分病原菌。

Evans Blue资料检索一、Evans Blue使用原理伊文思蓝（evans blue，EB）是一种生物染料，经静脉注射后很快与血浆清蛋白结合，用EB外渗作为血浆蛋白外渗指标，可观察皮肤蓝色外渗的部位和范围。

以往的研究表明内脏病变在相应脊髓节段的皮肤引起神经源性炎性反应，而穴位处体表的神经源性炎性反应伴随着局部血管通透性的改变可导致EB渗出点的出现，因而在进行了穴位与内在相关联系的神经机制一系列实验后，认为神经源性炎性反应（以EB渗出反映）可作为经脉显示的标志。

[3]二、Evans Blue的使用方法1、使用5%的Evans Blue( SIGMA) 溶液(0．9%氯化钠溶液配制)，按50 mg /kg剂量在大鼠尾静脉注射[6]成功标准为注射后大鼠眼睛即刻变蓝。

[1]2、腹部脱毛后，在鼠板上标记大鼠头、耳根、尾根的位置，将大鼠以仰卧位固定于鼠板上的同一位置，分别拍摄造模后5、10、15、20、25h的大鼠腹部图像。

拍摄照片要求:采用脑立体定位仪的三维支架，标定拍摄高度为25cm，造模后4h拍照。

[3]三、Evans Blue的观测指标及方法1、经纬网格计数法：①构建经纬网格:大鼠腹部照片构建以５ｍｍ×５ｍｍ为计数单位距离的经纬网格，该坐标系构建以胸骨上缘中点为原点，以腹部正中线及其垂直线为坐标轴（纵轴上至胸骨上缘，下至耻骨联合水平）②渗出点计数：（1）目标渗出点应隐于皮下，而在表皮且呈片状渗出或色泽鲜艳者乃表皮损伤所致，为假阳性点，需排除。

（2）无ＥＢ渗出点记为０；１个ＥＢ渗出点完整地出现在１个网格内，将其记为１；若１个渗出点横跨２个及以上网格时，则以“记上不记下，记右不记左”为计数原则将其记录。

（3）肋弓下缘为网格Ｌ，对Ｌ１—Ｖ１６网格内ＥＢ渗出点个数逐一进行记录，并将数据输入ＳＰＳＳ２２．０软件中（见图２）。

③统计学方法（1）聚类分析选取聚类树状图结果中分层级别最高且又独立的若干个坐标点，即“特征网格”（2）轮廓分析判定“特征网格”的渗出点数与不同芥子油浓度、时间的关系。

荧光一抗稀释液使用说明
货号：A1841
规格：10ml/100ml
保存：-20℃保存，有效期为2年。

短期可2-8℃保存。

产品说明：
免疫荧光一抗稀释液(Immunofluorescence Staining Primary Antibody Dilution Buffer)可以用于免疫荧光实验时荧光一抗的稀释和配制。

产品添加了抗体保护剂、稳定剂等成分，有效增加了稀释后荧光一抗的稳定性。

用此稀释液稀释后的一抗可在2-8℃环境下稳定保存半年。

使用方法：
按照荧光一抗推荐效价（或个人优化条件），将适量抗体加入抗体稀释液即可。

例如，效价为1：1000时，可将1ul抗体加入到1ml抗体稀释液中，充分混匀后即可使用。

抗体最好现用现稀释，稀释后的抗体可2-8℃保存。

注意事项：
如需抗体回收再利用，建议在2-8℃进行一抗的结合反应，以减缓抗体效价的衰减速度。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

北京索莱宝科技有限公司
荧光抗体稀释液
货号：A1840
规格：10ml/100ml
保存：-20℃保存，有效期为2年。

短期可2-8℃保存。

产品说明：
本免疫荧光抗体稀释液(Immunofluorescence Staining Antibody Dilution Buffer)可以用于免疫荧光实验时荧光标记抗体的稀释和配制。

产品添加了抗体保护剂、稳定剂等成分，有效增加了稀释后荧光抗体的稳定性。

用此稀释液稀释后的抗体可在2-8℃环境下稳定保存半年。

使用方法：
按照荧光抗体推荐效价（或个人优化条件），将适量抗体加入抗体稀释液即可。

例如，效价为1：1000时，可将1ul抗体加入到1ml抗体稀释液中，充分混匀后即可使用。

抗体最好现用现稀释，稀释后的抗体可2-8℃保存。

注意事项：
如需抗体回收再利用，建议在2-8℃进行抗体的结合反应，以减缓抗体效价的衰减速度。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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北京雷根生物技术有限公司
荧光抗体稀释液(Kolmers 法)
简介：
荧光抗体稀释液用于荧光染色时一抗(primary antibody)、二抗(secondary antibody)的稀释和配制。

当荧光抗体的染色如果背景较高，可以用Leagene 荧光抗体稀释液(Kolmers 法)稀释至临界浓度，使特异性染色呈阳性而非特异性染色呈阴性。

Leagene 荧光抗体稀释液(Kolmers 法)由伊文思蓝、盐等组成，为蓝色液体，减少非特异性荧光，宜做常规应用。

组成：
自备材料：
1、 载玻片
2、 盖玻片
3、 荧光显微镜
操作步骤(仅供参考)：
1、 按实验具体要求操作。

2、 稀释抗体后应4℃避光保持。

注意事项：
1、 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。

2、 在使用荧光抗体稀释液的情况下，虽然可减缓淬灭，仍需尽量避光。

有效期： 12个月有效。

编号 名称 IH0347 IH0347 Storage 荧光抗体稀释液(Evans Blue 法) 50ml 100ml 4℃ 避光 使用说明书 1份。

Evans Blue是一种具有吸附性能的分子，它可以与蛋白质非共价结合而不影响其功能。

Peroxynitrite是一种反应性氮物质，它与多种生物大分子如蛋白质、核酸等发生反应，
从而引起细胞损伤和炎症反应，甚至导致细胞死亡。

测定Peroxynitrite的方法之一就是使用Evans Blue作为指示剂。

测定过程如下：
1. 首先，将待测样品与Evans Blue混合，在一定的条件下使其反应。

2. Peroxynitrite会导致Evans Blue与蛋白质结合，从而改变其光谱特性。

测量反应体系
的吸收光谱（通常为620nm和680nm），可以计算出相对于Evans Blue的蛋白质结合量。

3. 根据吸光度的变化量，可以推算出反应中Peroxynitrite的含量。

该方法具有快速、灵敏、专属性高等优点，被广泛应用于生物医学领域中对Peroxynitrite产生及相关疾病的研究。

1、测定血脑屏障完整性原理欧阳歌谷（2021.02.01）伊文思蓝属于一种常用的偶氮染料制剂,因其分子量大小与血浆白蛋白相近，而且在血液中与血浆白蛋白有很高的亲和力，由于正常状态下血浆白蛋白无法透过血脑屏障，所以染色时，如神经系统是完整的，与血浆白蛋白结合的依文思蓝无法使其着色。

相反如果神经系统血脑屏障被破坏，依文思蓝就可以进入神经系统并使其着色。

在荧光波长470与540 nm 各有一强峰，680 nm 处有一弱峰。

其在组织中的含量常使用化学透析法和比色法进行检测。

脑组织中血脑屏障的破坏，可以引起毛细血管的通透性增加，结合EB的白蛋白可通过BBB进入脑组织，应用化学比色法甲酰胺测定脑组织EB渗出量，可以反映血脑屏障的开放程度，并在此基础上进一步探讨不同细胞移植干预与BBB通透性的效应关系。

伊文思蓝灌注染色法结合共聚焦激光扫描显微镜观察脑切片中EB 荧光强度，可以检测血脑屏障中血管形态的改变，同时对脑组织中渗入的EB含量进行定量分析。

两者结合可以从形态学、组织定量上相互补充完善。

2、实验准备试剂：2%EB、1%戊巴比妥钠、0.9%氯化钠、20U/ml肝素钠、二甲基甲酰胺器材：冰冻切片机、共聚焦激光扫描显微镜、分光光度计、恒温箱、离心机、注射器、输液器、解剖器械等3、测定方法1、各组动物处死前0.5h（也有的为1h、2h）尾静脉（或股静脉）注入2%EB（2ml/kg，也有的用3、4ml/kg）（剂量与提前时间成反比？）2、1%戊巴比妥钠30-40 mg/kg麻醉后打开胸腔，心内灌注肝素生理盐水（0.9%氯化钠+20U/ml肝素钠）200-300ml（有文献提出当右心房流出液体变清澈时即可停止灌注），断头取脑作矢状切取半脑分离海马，一半脑组织进行冰冻切片，应用冰冻切片机行10-20μm切片，于共聚焦激光扫描显微镜下观察 EB通透情况。

3、另一半脑组织称重，剪碎置于二甲基甲酰胺（1ml/100mg脑组织，也可用三氯乙酸、甲酰胺）60℃孵育24h，1000r/min离心5min（有的作者认为脑组织在甲酰胺中匀浆呈胶状，上清液不能通过离心取得，水浴后直接取上清液比色），用分光光度计检测波长为620 nm的吸光度。

伊文氏蓝血管染色步骤
伊文氏蓝（Evans Blue）血管染色是一种用于观察动物组织中血管的染色方法。

以下是一般的伊文氏蓝血管染色步骤：
1.准备工作：
准备足够的伊文氏蓝染料。

确保所有试剂和设备是无菌的，以防止污染。

确保实验室工作台面和器具是干净的。

2.动物处理：
使用实验动物（例如小鼠或大鼠）进行实验。

在实验开始前，注意动物实验伦理和法规。

3.伊文氏蓝溶液的制备：
制备适量的伊文氏蓝溶液，通常是在生理盐水或 PBS（磷酸盐缓冲液）中制备。

使用适当的浓度，通常是1-2％的伊文氏蓝。

4.伊文氏蓝注射：
将伊文氏蓝注射到动物的血管系统中。

这通常是通过静脉注射实现的。

注射的剂量和速度应根据实验需要进行调整。

5.动物安乐：
在注射后，根据实验设计，可以选择适当的时间点来收集样本。

这通常包括在伊文氏蓝注射后一段时间内进行观察。

6.动物灭活和取样：
根据实验需要，动物可以被人道地灭活。

收集组织样本，如心脏、肺、肝脏等，以进行后续的观察和分析。

7.切片和观察：
将组织样本切片，并使用显微镜观察伊文氏蓝在血管中的染色情况。

使用合适的滤光片来观察伊文氏蓝在组织中的分布。

请注意，这只是一般步骤的概述，实际操作可能会根据特定实验目的和动物模型的要求而有所不同。

在进行任何实验之前，请确保遵循适当的实验室安全和伦理规定。

一、实验目的1. 掌握荧光抗体标记技术的基本原理和操作步骤。

2. 学会使用荧光显微镜观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。

3. 了解荧光抗体标记技术在生物医学研究中的应用。

二、实验原理荧光抗体标记技术是将荧光素与特异性抗体结合，形成荧光标记抗体。

这种标记抗体仍保持抗体原有的活性，当与相应的抗原发生特异性结合时，荧光标记抗体在荧光显微镜下呈现出明亮的荧光，从而实现对抗原的检测和定位。

三、实验材料1. 实验试剂：FITC标记的抗体、抗原、抗体稀释液、磷酸盐缓冲液（PBS）、甘油、甲醇等。

2. 实验仪器：荧光显微镜、离心机、移液器、吸管、试管、载玻片等。

四、实验步骤1. 标准化抗体将FITC标记的抗体用抗体稀释液稀释至适当浓度。

2. 制备抗原将待检测的抗原用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至适当浓度。

3. 制备细胞悬液将待检测的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，离心弃去上清液，加入适量的磷酸盐缓冲液重悬细胞。

4. 混合抗原与抗体将抗原与抗体按一定比例混合，在室温下孵育一段时间。

5. 洗涤将混合后的溶液在室温下用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次洗涤后离心弃去上清液。

6. 封片将洗涤后的细胞沉淀用甘油封片，封片剂与细胞沉淀的比例为1:1。

7. 荧光显微镜观察将封片置于荧光显微镜下观察，调整显微镜参数，观察荧光标记的抗体与抗原的结合情况。

五、实验结果通过荧光显微镜观察，发现荧光标记的抗体与抗原发生了特异性结合，形成明亮的荧光复合物。

阳性细胞在荧光显微镜下呈现出明显的荧光信号，而阴性细胞则无荧光信号。

六、实验讨论1. 实验过程中，抗体与抗原的孵育时间、洗涤次数和封片剂的选择对实验结果有较大影响。

本实验中，抗体与抗原的孵育时间为30分钟，洗涤次数为3次，封片剂为甘油。

2. 荧光抗体标记技术具有特异性高、灵敏度高、操作简便等优点，广泛应用于生物医学研究、临床诊断等领域。

3. 在实验过程中，应注意以下几点：（1）抗体与抗原的比例要适中，过多或过少都会影响实验结果；（2）孵育时间不宜过长或过短，以免影响抗体与抗原的结合；（3）洗涤时要充分，以去除未结合的抗体和抗原；（4）封片剂的选择要合适，以保证荧光信号的稳定。

免疫荧光染色稀释抗体免疫荧光染色是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定细胞或组织中的特定蛋白质。

这种技术利用免疫学原理，结合荧光染料，使特定抗原以荧光信号的形式显现出来。

稀释抗体在免疫荧光染色中起着非常重要的作用，是实现染色成功的关键。

稀释抗体是指在染色过程中需要将所用的抗体进行适当的稀释，以达到较高的特异性和敏感性。

稀释抗体的关键是确定合适的稀释倍数，使得抗体能够充分结合目标抗原，同时阻断非特异性结合。

本文将从稀释抗体的选取和稀释倍数的确定两个方面来探讨免疫荧光染色中稀释抗体的重要性。

首先，稀释抗体的选取非常关键。

在选择稀释抗体时，需要考虑到抗体的来源、纯度以及特异性等因素。

一般来说，购买商业化的抗体更加方便，但需要确保其从可靠的供应商购买，并验证其在其他实验中的可靠性。

此外，可以选择在实验室内进行抗体制备，通过免疫小鼠或小动物获得抗体。

抗体的纯度也是选择稀释抗体的重要指标之一。

纯度越高的抗体在稀释过程中的非特异性结合风险越低。

常见的抗体纯度检测方法包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western Blot等。

若所用的抗体具有较高的非特异性结合，可能会导致染色结果的假阳性，从而影响实验的准确性。

其次，稀释倍数的确定是稀释抗体的另一个关键环节。

一般来说，稀释倍数的确定需要先进行初步的优化实验，以找到最佳的抗体稀释倍数。

常用的稀释倍数从1:50到1:200不等，具体需要根据实验中的情况来确定。

在初步的稀释实验中，可以设置不同的抗体稀释倍数，将其分别加入已固定的细胞或组织样本中，观察染色结果的强度和特异性。

一般来说，若抗体过度稀释，可能导致信号强度过弱，难以观察到目标抗原的区域；而若抗体过度浓缩，则可能出现非特异性结合和背景信号过高的问题。

通过逐步调整稀释倍数，最终选择出最佳的抗体稀释倍数。

这个倍数能够既保证抗体与目标抗原的高特异性结合，又使背景信号尽量降低，从而得到清晰可辨的染色结果。

不同细胞或组织类型对抗体的表达和结合情况有所不同，因此需要在不同样品中进行优化。

抗体稀释液和ELISA相关溶液的配制1、抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/L pH7.2PBSNaH2PO4·2H2O 0.39克Na2HPO4 1.27克NaCl 0.85克NaN3 200mg H2O（蒸馏水）至1000ml2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液p H7.4，PBSTNaCl 2.0克KH2PO4 0.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克KCl 0.2克NaN3 0.2克H2O 至1000ml 吐温（Tween）20 0.5ml3、包被液（简称CB）pH9.6Na2CO3 1.59克NaHCO3 2.93克NaN3 0.2克H2O 至1000ml 4、ELISA底物液（可溶性底物）磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.00.1mol/L柠檬酸（21.014克/100ml) 24.3ml0.2mol/L Na2 HPO4（28.4克/1000ml) 25.7mlH2O 50ml5、DAB底物液（不溶性底物，组化病理等）0.05mol/L pH7.6 Tris-HCLTris 6.05克HCL(36%) 3.15克（约2.7ml浓HCL）H2O 至1000mlDAB为3´，3´二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色6、DAB溶液配制：（组化及Western blot 显色）称DAB30mg，用0.05mol/L pH7.6Trs-HCL缓冲液100ml溶解,如有沉淀，过滤后使用，一般新鲜配制使用。

用前加入1%H2O2 1-1.5ml,H2O2浓度为0.01%，混均后使用。

7、3´，3´，5´，5´，-四甲基联苯胺（TMB）溶液配制：用二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF)或无水乙醇，将TMB配成1%浓度，4°C保存半年以内使用。

使用前，用pH5.0磷酸-柠檬酸底物液9.9ml加入0.1ml(1mg/TMB)1%TMB液，再按每毫升TMB加入30%的H2O2 1ul，混匀后立即使用。

抗体稀释液的配制Antibody Dilution BuffersPrimary Antibody Dilution Buffer:1%BSA (stabilizer and blocking)0.1% cold fish skin gelatin (blocking)0.05% sodium azide (preservative)0.01M PBS pH7.2 (TBS pH7.6 used in primary antibody dilution buffer produces weaker staining)Note: 1) Antibodies diluted using this buffer can be stored at 4 ºC for 6 months wi thout reducing binding activity.2) This buffer can not be used for diluting HRP conjugated antibodies since sodium azide is an inhibitor of HRP.HRP-conjugated Primary Antibody Dilution Buffer:1%BSA (stabilizer)0.1% cold fish skin gelatin (blocking)0.05% Thimerosal (preservative)0.01M PBS pH7.2Note: Antibodies diluted using this buffer can be stored at 4 ºC for 6 months wit hout reducing binding activity.Secondary Antibody Dilution Buffer:0.01M PBS, pH 7.20.05% sodium azide (preservative)Note: 1) Antibodies diluted using this buffer can be stored at 4 ºC for 6 months without reducing binding activity. 2) Do not use BSA or other serum containing reagents to dilute secondary antibodies since they may bind to BSA or serum therefore reducing antibody affinity. 3) Using TBS to dilute secondary antibodies often produces weaker staining. So use TBS only for the antibodies with high background staining or for alkaline phosphatase conjugated antibodies since phosphate is a inhibitor of alkaline phosphatase.HRP-Streptavidin Dilution Buffer:0.01M PBS, pH 7.20.05% thimerosal (preservative)Note: Antibodies diluted using this buffer can be stored at 4 ºC for 6 months wit hout reducing binding activity.AP-Streptavidin Dilution Buffer:0.05M TBS, pH 7.60.05% thimerosal (preservative)Note: 1) Antibodies diluted using this buffer can be stored at 4 ºC for 6 months without reducing binding activity. 2) PBS can not be used to dilute Streptavidin-AP since phosphate inhibit alkaline phosphatase activity.Fluorescent Dye (Avidin-FITC, Avidin-Texas Red, Avidin-AMCA) Dilution Buffer:0.01M PBS, pH 7.20.05% thimerosal (preservative)一抗稀释剂:1 % 牛血清白蛋白0.1% 冷海鱼皮胶0.05% 叠氮钠0.01M 磷酸缓冲液(PBS) pH7.2 (注: 1升)注备: 1) 一抗稀释剂可以储存在4 ºC , 6 个月.2) 此稀释剂不能用来稀释辣根过氧化酶 (HRP)标记的一抗,因为里面的叠氮钠会抑制辣根过氧化酶 (HRP) 的活性.辣根过氧化酶 (HRP)标记的一抗一抗稀释剂:1 % 牛血清白蛋白0.1% 冷海鱼皮胶0.05% 硫柳汞 (preservative)0.01M 磷酸缓冲液(PBS) pH7.2 (注: 1升)注备: 此稀释剂可以储存在4 ºC , 6 个月.二抗稀释剂:0.05% 叠氮钠0.01M 磷酸缓冲液(PBS) pH7.2 (注: 1升)注备: 1) 二抗稀释剂可以储存在4 ºC , 6 个月.2) 不要用含有牛血清白蛋白或其它血清的稀释剂来稀释二抗,因为二抗可能会与牛血清白蛋白或其它血清反应.3)用TBS稀释二抗会降低染色, 因此TBS用于有强背景的抗体活碱性磷酸酶标记得二抗,因为磷酸盐可以抑制碱性磷酸酶的活性.辣根过氧化酶-链霉亲和素(HRP-Streptavidin Dilution Buffer) 稀释剂:0.01M 磷酸缓冲液(PBS) pH7.2 (注: 1升)0.05% 硫柳汞注备:此稀释剂可以储存在4 ºC , 6 个月.碱性磷酸酶-链霉亲和素(AP-Streptavidin Dilution Buffer) 稀释剂:0.05M Tris缓冲液(TBS), pH 7.60.05% 硫柳汞注备: 1) 此稀释剂可以储存在4 ºC , 6 个月.2)磷酸缓冲液不能用来稀释碱性磷酸酶-链霉亲和素,因为磷酸盐回抑制碱性磷酸酶活性.荧光染料 (Avidin-FITC, Avidin-Texas Red, Avidin-AMCA) 稀释剂:0.01M 磷酸缓冲液(PBS) pH7.2 (注: 1升)0.05% 硫柳汞。

evansblue染色原理Evansblue染色原理Evansblue染色是一种常用的生物学实验方法，用于研究细胞膜的通透性及细胞膜的完整性。

该染色方法以Evansblue染料为基础，通过染料分子与细胞膜结合，从而形成染色物质。

本文将详细介绍Evansblue染色的原理、应用以及相关注意事项。

Evansblue染料是一种天然有机染料，具有强烈的亲水性和负电性。

在生物实验中，Evansblue染料往往以盐酸盐的形式存在。

该染料分子由苯环和苯并环组成，其结构中还含有多个硫酸基团。

这种结构使Evansblue染料在水溶液中呈现出深蓝色。

由于其负电性，Evansblue染料可以与细胞膜上的阳离子结合，从而形成染色物质。

Evansblue染色的原理基于细胞膜的通透性及完整性。

正常情况下，细胞膜是一个半透膜，具有一定的通透性。

通过染色实验，可以评估细胞膜的通透性及完整性。

在实验中，将Evansblue染料添加到培养细胞的培养基中，染料分子可以通过细胞膜进入细胞内。

如果细胞膜完整且通透性较低，染料进入细胞内的数量较少。

而当细胞膜受损或通透性增加时，染料进入细胞内的数量会增加。

通过观察细胞内的染色物质，可以初步判断细胞膜的完整性。

正常情况下，细胞内应该没有或仅有少量的染色物质。

如果细胞内出现大量染色物质，则说明细胞膜受损或通透性增加。

这种方法可以用于评估细胞膜在各种条件下的完整性，例如在细胞应激、药物处理或疾病状态下。

Evansblue染色方法在生物学研究中有着广泛的应用。

例如，在肿瘤研究中，可以通过该方法评估肿瘤细胞膜的完整性，了解肿瘤细胞的特性。

此外，该方法还可用于评估细胞培养过程中细胞膜的完整性，以保证实验结果的准确性。

此外，Evansblue染色方法还可以应用于其他生物学研究领域，如细胞生物学、药物研发等。

在进行Evansblue染色实验时，需要注意一些问题。

首先，Evansblue染料应该选择纯度较高的产品，以保证实验结果的准确性。