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免疫荧光最全攻略：从protocol到问题解决免疫荧光（Immunofluorescence）：简称IF，与western blotting一样，也是根据抗原抗体反应的原理，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体或抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下进行观察，从而确定抗原或抗体的性质和定位，包括直接法和间接法。
一、实验步骤1. 样品准备（贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等）（1）对于贴壁细胞：先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌 PBS洗去残留的乙醇。
待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。
（2）对于悬浮细胞：有2种方法，①先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。
②先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。
（3）对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。
（4）对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。
2、固定（防止离体组织自溶抗原扩散）固定液包括：有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）；交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，不过，目前甲醛用的还是最多的，但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。
固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。
以细胞样品为例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min。
3、通透（目的是使抗体进入胞内）0.5%Triton X-100( 一种去垢剂，用PBS配制 )室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了Triton X-100，丙酮也可作为通透剂，并且丙酮固定后的样品不需要通透。
间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性1 材料和仪器293细胞大鼠抗LMP2单克隆抗体FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体荧光显微镜2 检测方法2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.5~2.0×105个细胞/孔，37℃，5% CO2培养箱培养过夜，细胞生长成片。
2.2 每个细胞孔感染2.0×106VP供试品重组腺病毒，同时设置293细胞阴性对照孔。
37℃，5% CO2培养箱培养两天，细胞完全病变。
2.3 收集293细胞。
用PBS洗涤两次，重悬到100µlPBS缓冲液中，每孔10µl 涂于细胞片上，室温自然晾干。
2.4 将细胞片置于4℃丙酮中固定15分钟，PBS洗两次，室温晾干。
2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。
2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。
2.6 细胞孔使用1：20 PBS稀释抗体，置于湿盒中，37℃孵育1小时。
PBS洗8~9遍，保持湿润。
2.7 覆盖1：40稀释的FITC标记（PBS稀释）的羊抗大鼠IgG，置于湿盒中，37℃孵育30分钟。
PBS洗8~9遍，室温晾干。
(如用PBS有颗粒沉淀)2.8 伊文氏蓝负染5分钟。
超纯H2O洗3遍，室温晾干。
2.9 50%甘油封片。
2.10 显微镜下观察照相。
3 结果判定显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色，供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光，即判定为阳性。
检测结果应为阳性。
注：1、每一步均需晾干，细胞浓度可以比较高。
2、水洗效果要好，无盐粒子颗粒。
3、丙酮固定过夜效果较好。
PBS稀释。
当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。
培养液成分太多了。
而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。
抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。
上网查一下，有很多protocol。
一般一比几百到一万都有，依抗体而定。
间接免疫荧光法检测人血清或血浆中微小巴贝西的IgG目的微小巴贝西IgG抗体试剂盒用来检测或半定量人微小巴贝西IgG抗体。
试验总结和解释北美巴贝西虫病是由微小巴贝西虫引起的，通过被感染的蜱的叮咬传播，通常认为贝西虫病可以通过噬吞噬细胞无形体和（或）伯氏疏螺旋体共传播。
传统方法通过外周血涂片制作薄血膜观察红细胞内部特征性的内含物。
免疫荧光法用微小巴贝西感染的仓鼠或大鼠红细胞作为特征性内含物的来源用来进行特异性抗体检测。
病人血清稀释缓冲液在孔板中孵化使得抗体和微小巴贝西抗原反应。
洗板移去未反应的血清蛋白，然后加入荧光标记的抗人IgG，这个结合物需要时间与抗原抗体化合物反应。
再一次洗板移去未反应的结合物。
反应结果通过荧光显微镜，观察，阳性结果被视为苹果绿的荧光内含物包裹在被感染的红细胞里。
空白对照是没有荧光或荧光类似物在对照孔，阳性对照通过高倍稀释确定最高活性或终点稀释。
试剂加样板10*12孔涂有包括微小巴贝西感染的仓鼠或大鼠红细胞，真空包装。
IgG结合物，2.5ML黄色帽滴管含有亲和纯化的DyLight 488荧光标记羊抗人牛血清白蛋白IgM和伊文思兰试剂。
阳性对照，0.5ML蓝色帽滴管含有人反应性的血清1:64的稀释倍数，终点滴度是1：512。
阴性对照，0.5ML红色帽滴管含有人非反应性的血清1:50倍稀释。
封片剂，1ML白色帽滴管含有50%甘油磷酸盐缓冲液。
PBS，1L粉剂溶于1L纯净水中配制成PH7.2的磷酸盐缓冲液。
警告1.对照血清经过食品药品管理局的传染性检测，然而由于没有测试能确保传染性不存在，这些试剂和血清标本应避免皮肤接触和摄入。
2.反应板是经过化学灭活的抗原，具有潜在的传染性，应进行相应处理。
保存试剂盒应存放在2-8℃，在室温中打开滴管和加样板袋。
标本采集血液凝固后离心分离血清，血清移至密封的灭菌管，存放在2-8℃。
如果实验操作超过五天，样品存放在-20℃冷冻。
急性期标本在疾病发作期采样，恢复期标本在间歇期收集检查滴度变化。
组织免疫荧光间接法
组织免疫荧光间接法是一种检测细胞内蛋白质表达及其定位的重要方法。
该方法通过使用特异性抗体与荧光素作为探针，可以快速准确地检测出目标蛋白质存在的位置。
该方法的操作步骤如下：
1. 取得样本组织，并将其固定在载玻片上。
2. 使用相应的特异性抗体与荧光素作为探针，将其加入样本中。
3. 让样本与探针反应一定的时间，使其充分结合。
4. 用洗涤液清洗样本，去除未与探针结合的抗体和荧光素。
5. 使用激光显微镜观察样本，在激光的照射下，荧光素会发出荧光信号，以此确定目标蛋白质的存在及其位置。
组织免疫荧光间接法具有以下优点：
1. 高灵敏度：与其他方法相比，该方法可以检测到非常低浓度的目标
蛋白质。
2. 高特异性：该方法使用特异性抗体与荧光素作为探针，可以清楚地
确定目标蛋白质的位置。
3. 快速准确：该方法操作简便，可以在较短的时间内得到结果。
4. 多功能：该方法还可以用于检测不同种类的细胞和组织中的蛋白质。
然而，该方法也存在一些不足之处，例如：
1. 需要耗费大量的抗体，并且抗体需要提前准备。
2. 对于一些表达较低的蛋白质，由于检测的灵敏度限制，结果可能会
产生假阴性。
3. 由于需要使用荧光素，该方法对于一些染料不稳定的样本有一定的
局限性。
总之，组织免疫荧光间接法是一种快速准确的检测蛋白质存在和位置
的方法，可以广泛应用于医学、生物学等各领域的科研中。
但是，我
们在进行该方法时需要注意其局限性，以保证获得准确的结果。
免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。
这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。
固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。
免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。
最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。
总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
基本实验步骤：（1）细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
免疫荧光双标操作方法及注意事项一、试剂准备及实验准备1.标记抗体：根据实验需要，准备需要标记的一抗和二抗。
常用的标记物有荧光染料如FITC、TRITC等。
2.细胞或组织标本的固定：将要检测的细胞或组织标本用4%的多聚甲醛（PFA）或其他固定剂进行固定，并进行透明化处理如脱水和透明剂浸泡。
3. 阻断剂和洗涤缓冲液：准备含有蛋白质如BSA、牛血清白蛋白（BSA）和非离子表面活性剂如Tween-20的阻断剂和洗涤缓冲液。
4.标本处理：将固定的标本在洗涤缓冲液中进行多次洗涤，去除多余的固定剂。
5.孵育液：准备含有特定抗体和荧光标记抗体的孵育液，同时加入阻断剂以防止非特异性结合。
6.孵育：将洗涤后的标本用孵育液进行孵育，一般在室温下孵育1-2小时或在4℃下过夜。
二、显微镜观察及图像获取1.滴加反褪色剂：孵育完毕后，用洗涤缓冲液多次洗涤标本，之后加入反褪色剂如DAPI，并在黑暗中孵育15-30分钟。
2.洗涤和封片：用洗涤缓冲液洗涤标本多次，之后将标本转移到玻片上，加入封片剂后盖上盖片。
3.显微镜观察：将玻片放到显微镜上，使用荧光显微镜进行观察。
根据实验需要调整荧光滤镜和荧光强度。
4.图像获取：使用相机或图像分析软件获取荧光图像。
根据需要可以拍摄彩色图像，并使用图像处理软件进行图像调整与分析。
注意事项：1.实验卫生：在实验过程中需要保持实验台面和工作区干净，避免污染。
2.阻断非特异性结合：在孵育液和洗涤缓冲液中加入阻断剂，以防止非特异性结合，提高荧光信号的特异性。
3.控制实验参数：在进行实验时，需要控制实验参数的一致性，例如处理时间、温度、孵育液的浓度等。
4.标本固定：固定标本的时间和浓度需要根据标本类型和目的进行优化，过度固定可能会导致蛋白质的损失，而过轻固定则会导致识别困难。
5.孵育液的选择：根据实验需要选择好的一抗和二抗，合理选择荧光染料和孵育液，以获得明亮而清晰的荧光信号。
6.显微镜观察：根据实验目的和样本特点，选择适当的荧光滤镜和荧光强度，避免背景信号过强或过弱。
免疫荧光双标操作方法及注意事项在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method) 也分为直接法和间接法。
(1) 直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体( 如抗 A 和抗 B) 以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2) 间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油： 0.01M PBS (1 ：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5 、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6 、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在 1h 内完成观察，或于4℃保存 4h ，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2 、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清 +荧光标记物 ;(2) 阴性对照：阴性血清 +荧光标记物 ;(3) 荧光标记物对照： PBS+ 荧光标记物。
免疫荧光操作步骤及注意事项一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。
