间接免疫荧光法实验操作常见问题(20110524)

免疫荧光最全攻略：从protocol到问题解决免疫荧光（Immunofluorescence）：简称IF，与western blotting一样，也是根据抗原抗体反应的原理，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体或抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下进行观察，从而确定抗原或抗体的性质和定位，包括直接法和间接法。

一、实验步骤1. 样品准备（贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等）（1）对于贴壁细胞：先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌 PBS洗去残留的乙醇。

待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。

（2）对于悬浮细胞：有2种方法，①先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。

②先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。

（3）对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。

（4）对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。

2、固定（防止离体组织自溶抗原扩散）固定液包括：有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）；交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，不过，目前甲醛用的还是最多的，但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。

固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。

以细胞样品为例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3、通透（目的是使抗体进入胞内）0.5%Triton X-100( 一种去垢剂，用PBS配制 )室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了Triton X-100，丙酮也可作为通透剂，并且丙酮固定后的样品不需要通透。

间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性1 材料和仪器293细胞大鼠抗LMP2单克隆抗体FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体荧光显微镜2 检测方法2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.5~2.0×105个细胞/孔，37℃，5% CO2培养箱培养过夜，细胞生长成片。

2.2 每个细胞孔感染2.0×106VP供试品重组腺病毒，同时设置293细胞阴性对照孔。

37℃，5% CO2培养箱培养两天，细胞完全病变。

2.3 收集293细胞。

用PBS洗涤两次，重悬到100µlPBS缓冲液中，每孔10µl 涂于细胞片上，室温自然晾干。

2.4 将细胞片置于4℃丙酮中固定15分钟，PBS洗两次，室温晾干。

2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。

2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。

2.6 细胞孔使用1：20 PBS稀释抗体，置于湿盒中，37℃孵育1小时。

PBS洗8~9遍，保持湿润。

2.7 覆盖1：40稀释的FITC标记（PBS稀释）的羊抗大鼠IgG，置于湿盒中，37℃孵育30分钟。

PBS洗8~9遍，室温晾干。

(如用PBS有颗粒沉淀)2.8 伊文氏蓝负染5分钟。

超纯H2O洗3遍，室温晾干。

2.9 50%甘油封片。

2.10 显微镜下观察照相。

3 结果判定显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色，供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光，即判定为阳性。

检测结果应为阳性。

注：1、每一步均需晾干，细胞浓度可以比较高。

2、水洗效果要好，无盐粒子颗粒。

3、丙酮固定过夜效果较好。

PBS稀释。

当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。

培养液成分太多了。

而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。

抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。

上网查一下，有很多protocol。

一般一比几百到一万都有，依抗体而定。

间接免疫荧光法检测人血清或血浆中微小巴贝西的IgG目的微小巴贝西IgG抗体试剂盒用来检测或半定量人微小巴贝西IgG抗体。

试验总结和解释北美巴贝西虫病是由微小巴贝西虫引起的，通过被感染的蜱的叮咬传播，通常认为贝西虫病可以通过噬吞噬细胞无形体和（或）伯氏疏螺旋体共传播。

传统方法通过外周血涂片制作薄血膜观察红细胞内部特征性的内含物。

免疫荧光法用微小巴贝西感染的仓鼠或大鼠红细胞作为特征性内含物的来源用来进行特异性抗体检测。

病人血清稀释缓冲液在孔板中孵化使得抗体和微小巴贝西抗原反应。

洗板移去未反应的血清蛋白，然后加入荧光标记的抗人IgG，这个结合物需要时间与抗原抗体化合物反应。

再一次洗板移去未反应的结合物。

反应结果通过荧光显微镜，观察，阳性结果被视为苹果绿的荧光内含物包裹在被感染的红细胞里。

空白对照是没有荧光或荧光类似物在对照孔，阳性对照通过高倍稀释确定最高活性或终点稀释。

试剂加样板10*12孔涂有包括微小巴贝西感染的仓鼠或大鼠红细胞，真空包装。

IgG结合物，2.5ML黄色帽滴管含有亲和纯化的DyLight 488荧光标记羊抗人牛血清白蛋白IgM和伊文思兰试剂。

阳性对照，0.5ML蓝色帽滴管含有人反应性的血清1:64的稀释倍数，终点滴度是1：512。

阴性对照，0.5ML红色帽滴管含有人非反应性的血清1:50倍稀释。

封片剂，1ML白色帽滴管含有50%甘油磷酸盐缓冲液。

PBS，1L粉剂溶于1L纯净水中配制成PH7.2的磷酸盐缓冲液。

警告1.对照血清经过食品药品管理局的传染性检测，然而由于没有测试能确保传染性不存在，这些试剂和血清标本应避免皮肤接触和摄入。

2.反应板是经过化学灭活的抗原，具有潜在的传染性，应进行相应处理。

保存试剂盒应存放在2-8℃，在室温中打开滴管和加样板袋。

标本采集血液凝固后离心分离血清，血清移至密封的灭菌管，存放在2-8℃。

如果实验操作超过五天，样品存放在-20℃冷冻。

急性期标本在疾病发作期采样，恢复期标本在间歇期收集检查滴度变化。

组织免疫荧光间接法
组织免疫荧光间接法是一种检测细胞内蛋白质表达及其定位的重要方法。

该方法通过使用特异性抗体与荧光素作为探针，可以快速准确地检测出目标蛋白质存在的位置。

该方法的操作步骤如下：
1. 取得样本组织，并将其固定在载玻片上。

2. 使用相应的特异性抗体与荧光素作为探针，将其加入样本中。

3. 让样本与探针反应一定的时间，使其充分结合。

4. 用洗涤液清洗样本，去除未与探针结合的抗体和荧光素。

5. 使用激光显微镜观察样本，在激光的照射下，荧光素会发出荧光信号，以此确定目标蛋白质的存在及其位置。

组织免疫荧光间接法具有以下优点：
1. 高灵敏度：与其他方法相比，该方法可以检测到非常低浓度的目标
蛋白质。

2. 高特异性：该方法使用特异性抗体与荧光素作为探针，可以清楚地
确定目标蛋白质的位置。

3. 快速准确：该方法操作简便，可以在较短的时间内得到结果。

4. 多功能：该方法还可以用于检测不同种类的细胞和组织中的蛋白质。

然而，该方法也存在一些不足之处，例如：
1. 需要耗费大量的抗体，并且抗体需要提前准备。

2. 对于一些表达较低的蛋白质，由于检测的灵敏度限制，结果可能会
产生假阴性。

3. 由于需要使用荧光素，该方法对于一些染料不稳定的样本有一定的
局限性。

总之，组织免疫荧光间接法是一种快速准确的检测蛋白质存在和位置
的方法，可以广泛应用于医学、生物学等各领域的科研中。

但是，我
们在进行该方法时需要注意其局限性，以保证获得准确的结果。

免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。

利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。

细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。

这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。

固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。

免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。

最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。

总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。

基本实验步骤：（1）细胞准备。

对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

免疫荧光双标操作方法及注意事项一、试剂准备及实验准备1.标记抗体：根据实验需要，准备需要标记的一抗和二抗。

常用的标记物有荧光染料如FITC、TRITC等。

2.细胞或组织标本的固定：将要检测的细胞或组织标本用4%的多聚甲醛（PFA）或其他固定剂进行固定，并进行透明化处理如脱水和透明剂浸泡。

3. 阻断剂和洗涤缓冲液：准备含有蛋白质如BSA、牛血清白蛋白（BSA）和非离子表面活性剂如Tween-20的阻断剂和洗涤缓冲液。

4.标本处理：将固定的标本在洗涤缓冲液中进行多次洗涤，去除多余的固定剂。

5.孵育液：准备含有特定抗体和荧光标记抗体的孵育液，同时加入阻断剂以防止非特异性结合。

6.孵育：将洗涤后的标本用孵育液进行孵育，一般在室温下孵育1-2小时或在4℃下过夜。

二、显微镜观察及图像获取1.滴加反褪色剂：孵育完毕后，用洗涤缓冲液多次洗涤标本，之后加入反褪色剂如DAPI，并在黑暗中孵育15-30分钟。

2.洗涤和封片：用洗涤缓冲液洗涤标本多次，之后将标本转移到玻片上，加入封片剂后盖上盖片。

3.显微镜观察：将玻片放到显微镜上，使用荧光显微镜进行观察。

根据实验需要调整荧光滤镜和荧光强度。

4.图像获取：使用相机或图像分析软件获取荧光图像。

根据需要可以拍摄彩色图像，并使用图像处理软件进行图像调整与分析。

注意事项：1.实验卫生：在实验过程中需要保持实验台面和工作区干净，避免污染。

2.阻断非特异性结合：在孵育液和洗涤缓冲液中加入阻断剂，以防止非特异性结合，提高荧光信号的特异性。

3.控制实验参数：在进行实验时，需要控制实验参数的一致性，例如处理时间、温度、孵育液的浓度等。

4.标本固定：固定标本的时间和浓度需要根据标本类型和目的进行优化，过度固定可能会导致蛋白质的损失，而过轻固定则会导致识别困难。

5.孵育液的选择：根据实验需要选择好的一抗和二抗，合理选择荧光染料和孵育液，以获得明亮而清晰的荧光信号。

6.显微镜观察：根据实验目的和样本特点，选择适当的荧光滤镜和荧光强度，避免背景信号过强或过弱。

免疫荧光双标操作方法及注意事项在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。

双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method) 也分为直接法和间接法。

(1) 直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体( 如抗 A 和抗 B) 以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。

直接法简便可靠，但灵敏度较低。

(2) 间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。

使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。

免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油： 0.01M PBS (1 ：1)。

条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

5 、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。

6 、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

二、注意事项1、荧光染色后一般在 1h 内完成观察，或于4℃保存 4h ，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

2 、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清 +荧光标记物 ;(2) 阴性对照：阴性血清 +荧光标记物 ;(3) 荧光标记物对照： PBS+ 荧光标记物。

免疫荧光操作步骤及注意事项一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。

其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。

试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油 9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制搪瓷桶三只（内有 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。

实验步骤1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。

3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。

4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5. 立即用荧光显微镜观察。

观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++--++++）荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在 1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从 10 min 到数小时，一般 30 min 已足够。

活细胞间接免疫荧光法1 转染细胞4h后，用PBST洗涤三次。

2 固定。

用置于-20℃预冷的甲醇进行固定，500 ul/孔，室温作用10 min。

用PBST洗涤三次。

3 封闭4 一抗加入1：100倍稀释的阳性血清（用1%的BSA稀释）200 ul/孔，37℃作用1h。

用PBST 洗三次5 二抗加入1：500稀释的Alexa fluor 488标记的羊抗鸡IgY(用1%的BSA稀释)，200uL/孔，37℃作用lh。

用PBST洗涤三次。

6 荧光显微镜下观察结果。

转染Vero 细胞4h后，用PBST洗涤三次，用置于-20℃保存的冷丙酮(丙酮：乙醇=2：3)进行固定，500uL/孔，室温作用10min。

用PBST洗涤三次，加入1：100倍稀释的ARV阳性血清200uL/孔，37℃作用lh。

用PBST洗涤三次，加入1：500稀释的Alexa fluor 488标记的羊抗鸡IgY，200uL/孔，37℃作用lh。

用PBST洗涤三次一．实验器材：1．器材：40孔塑料板、40孔板离心机、微量加样器、振荡器、盖玻片、荧光显微镜等。

2．试剂：单抗隆抗体（单抗）、荧光标记抗鼠免疫球蛋白、PBS（pH7.2-7.4）、甘油、叠氮钠（NaN3）等。

二．方法（微量法）1．将分离好的单个核细胞用PBS洗2次，1000rpm每次10分钟。

用含0.1% NaN3PBS调细胞浓度在0.5-1×108/ml（5000万-1亿/ml），加在40孔板上，每孔10ul，含5-10×105细胞，然后加入单抗（第一抗体）50ul（同时加入AB型血清5ul）振荡混匀，置4℃，至少30分钟。

2．用含0.1%NaN3的PBS洗一次，1000rpm离心3-5分钟弃上清。

3．加荧光标记抗鼠抗体（第二抗体）工作液20ul，混匀振荡置4℃/30分钟（时间不能超过）。

4．用含0.1%NaN3的PBS洗2次，方法同上，弃上清，加入含60%甘油的PBS5-10ul（依据所加细胞量而定）振荡均匀，点片，并加盖玻片。

（一）免疫组化组织细胞的固定凡需进行病理研究的标本均需进行固定。

将组织置于某些化学试剂中，使细胞内的物质免疫组织化学实验技术及应用尽量接近于其生活状态时的形态结构和位置称为固定。

而用于免疫组化研究标本的固定不仅是使细胞内的蛋白质凝固，终止或减少外源性和内源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更重要的是保存组织或细胞内的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。

不同的抗原，其抗原稳定性不同，依抗原耐受固定液的程度可分为：①不稳定性抗原，如T淋巴细胞表面抗原属此类抗原，一般以冰冻切片进行免疫组化染色；②半稳定性抗原，如B淋巴细胞的胞浆免疫球蛋白等；③较稳定抗原，例如HBsAg、HBcAg、AFP、CEA、S—100、Keratin和部分多肽类激素等，其抗原性受固定剂种类、固定时间、温度等影响不大。

固定剂的种类很多，性能不一，因此固定不同的组织应选择合适的固定剂，特别是标记半稳定抗原时，更要选择合适的固定剂和固定条件。

固定液的种类较好的固定液应具有强渗透力，能迅速渗入至组织内部；其次不会使组织发生过度收缩变形，并能使组织内易观察的成分得以凝固为不溶性物质；还要使组织达到一定硬度，有较好的折光率。

固定液分为简单固定液和混合固定液。

因目前大多数固定液都是有毒有机溶剂组成，欧美国家已不再使用，基本由环保组织固定液替代。

西奈山环保组织固定液由植物多糖、乙醇、醋组成，固定效果明显优于常规甲醛。

固定的方法1．浸泡法这是最常用的固定法，将取好的组织直接浸泡在固定液中，固定的时间一般在2～24h它适用于动物标本、尸检标本及临床活检标本等。

2．蒸气法比较小而薄的标本可用锇酸或甲醛蒸气固定。

主要用于血液、细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。

具体方法：在一有盖培养皿内滴人1％一2％锇酸水溶液3滴，将涂片放人其中，固定30s至lmin左右，立即水洗后进行染色。

3.注射、灌注固定法主要适用于动物实验标本的固定。

将固定液注入血管，以达到充分的固定。

免疫荧光间接法注意事项1. 引言1.1 什么是免疫荧光间接法免疫荧光间接法是一种常用的免疫学实验技术，在细胞生物学和分子生物学研究中具有重要的应用。

通过利用特异性的抗体与待检测的抗原结合，然后使用荧光标记的二抗来识别和定位目标蛋白或细胞结构，从而实现对目标分子的定量或定位分析。

这种方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便等优点，因此被广泛应用于科研领域。

免疫荧光间接法的原理是基于免疫学的理论，利用抗体与抗原特异性结合的原理来实现对待检测分子的检测和定位，其灵敏度和特异性取决于抗体的选择和标记的二抗的性能。

在实验中，需要注意一些关键因素，如样本处理、试剂及仪器选择、实验操作、数据分析和安全措施等。

通过严格遵循这些注意事项，可以确保免疫荧光间接法实验的顺利进行，并保证结果的准确性和可靠性。

【2000字】1.2 为什么需要注意事项在进行免疫荧光间接法实验时，需要特别注意一些事项，这是因为这种方法在生物学研究中扮演着非常重要的角色。

免疫荧光间接法是一种通过标记一种特定抗体来检测样品中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体与特定抗原结合后，再通过荧光标记的二抗来实现信号的放大与检测。

这种方法通常用于检测蛋白质的表达水平、确定细胞的定位以及研究细胞间的相互作用等方面。

在实验过程中，如果没有按照正确的操作步骤进行，就会导致实验结果的不准确或是出现误差。

需要严格遵守一些注意事项，以保证实验的准确性和可靠性。

这些注意事项涉及到样本处理、试剂及仪器、实验操作、数据分析以及安全等方面，每一个环节都至关重要。

免疫荧光间接法的注意事项不仅仅是为了确保实验过程的顺利进行，更重要的是为了保证实验结果的准确性。

只有在遵守各项注意事项的前提下，我们才能得到可靠的实验结果，为科研工作提供有效的支持。

所以，我们必须认真对待免疫荧光间接法中的注意事项，以确保实验的顺利进行和结果的可靠性。

2. 正文2.1 样本处理注意事项在进行免疫荧光间接法实验时，样本处理是非常关键的一步，直接影响到实验结果的准确性和可靠性。

间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性1 材料和仪器293细胞大鼠抗LMP2单克隆抗体FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体荧光显微镜2 检测方法2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.5~2.0×105个细胞/孔，37℃，5% CO2培养箱培养过夜，细胞生长成片。

2.2 每个细胞孔感染2.0×106VP供试品重组腺病毒，同时设置293细胞阴性对照孔。

37℃，5% CO2培养箱培养两天，细胞完全病变。

2.3 收集293细胞。

用PBS洗涤两次，重悬到100µlPBS缓冲液中，每孔10µl 涂于细胞片上，室温自然晾干。

2.4 将细胞片置于4℃丙酮中固定15分钟，PBS洗两次，室温晾干。

2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。

2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。

2.6 细胞孔使用1：20 PBS稀释抗体，置于湿盒中，37℃孵育1小时。

PBS洗8~9遍，保持湿润。

2.7 覆盖1：40稀释的FITC标记（PBS稀释）的羊抗大鼠IgG，置于湿盒中，37℃孵育30分钟。

PBS洗8~9遍，室温晾干。

(如用PBS有颗粒沉淀)2.8 伊文氏蓝负染5分钟。

超纯H2O洗3遍，室温晾干。

2.9 50%甘油封片。

2.10 显微镜下观察照相。

3 结果判定显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色，供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光，即判定为阳性。

检测结果应为阳性。

注：1、每一步均需晾干，细胞浓度可以比较高。

2、水洗效果要好，无盐粒子颗粒。

3、丙酮固定过夜效果较好。

PBS稀释。

当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。

培养液成分太多了。

而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。

抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。

上网查一下，有很多protocol。

一般一比几百到一万都有，依抗体而定。

5、共定位的视野该如何选择？答：共定位时，首先判断哪些细胞是转染成功的，比如我过表达了蛋白A，想做蛋白A和蛋白B的共定位关系，则在视野中寻找已成功转染蛋白A的细胞，一般荧光强度会显著高于周边其他细胞，再在这个细胞上观察蛋白B的表达，6、视野中细胞与细胞之间存在散在的发光点。

答：有两种情况可造成：1，拍照时PBS量过少引起的非特异性；2，PBS未过滤，未溶解的残渣黏附而导致成功免疫荧光如下图：三、除此之外，这些注意事项也要牢记1、合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。

但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。

如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。

2、抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。

在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。

使用只有二抗染色的片子3、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。

这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。

通常情况下，需要通过以下步骤得以实现：细胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。

前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。

使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。

另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。

4、封闭条件的优化选择为了防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前用封闭液封闭，这样可以减少非特异性的背景着色。

封闭液可以选择二抗来源一致的血清，一般来说，血清价格比较昂贵，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以说是万能的封闭血清。

之阳早格格创做正在共一构造细胞标本上需要共时检测二种抗本时，需举止单沉荧光染色.单沉免疫荧光标记表记标帜法(double immunofluorescence labeling method)也分为间接法战间接法.(1)间接法单沉免疫荧光标记表记标帜：将标记表记标帜有二种分歧荧光素的抗体(如抗A战抗B)以适合比率混同，滴加正在标本上孵育，而后洗去已分离的荧光抗体，正在荧光隐微镜下分别采用二种相映的激励滤片瞅察，即可对于二种抗本举止定位战定量.间接法简即稳当，然而敏捷度较矮.(2)间接法单沉免疫荧光标记表记标帜：用已标记表记标帜的二种特同性第一抗体孵育构造或者细胞，洗去多余的第一抗体后，再用二种分歧的荧光素分别标记表记标帜的第二抗体孵育构造或者细胞，洗去多余的第二抗体，后正在荧光隐微镜下分别采用二种相映的激励滤片瞅察，进而对于二种抗本举止定位战定量.使用此法应注意二种特同性第一抗体必须根源于分歧种属，且荧光标记表记标帜第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配.免疫荧光单标技能中支配重心战注意事项一、免疫荧光技能中标本创造的基础步调近似于酶免疫组化，分歧面如下： 1、免疫荧光不需要使用单氧火处理，启关战一抗孵育与其相共. 2、免疫荧光的二抗使用分歧荧光标记表记标帜的二抗孵育，孵育时间根据抗体的处事浓度决定. 3、二抗孵育之后充分洗片后即可揭片、启片战瞅察. 4、免疫荧光正在启片常常使用博用启片剂或者苦油：0.01M PBS (1：1).条件许可，提议买买抗淬灭的启片液，使标本不妨保存更暂. 5、荧光抗体的孵育以及后绝处理需要躲光. 6、荧光抗体染色假阳性大概会多，需要分别设定阳性战阳性对于照.二、注意事项 1、荧光染色后普遍正在1h内完毕瞅察，或者于4℃保存4h，时间过少，大概会使荧光提前出落. 2、屡屡考查均需树立以下三种对于照：(1) 阳性对于照：阳性血浑+荧光标记表记标帜物; (2) 阳性对于照：阳性血浑+荧光标记表记标帜物; (3) 荧光标记表记标帜物对于照：PBS+荧光标记表记标帜物.三、免疫荧光单目标体味之道 1、采用一抗时，央供根源于二种分歧的动物，尔用的是根源于家兔战大鼠的抗体，二抗则是分歧荧光旗号标记表记标帜的，尔用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)战donkey anti-rat-Tex-Red(黑). 2、尔的干法是二种一抗共时孵育，而后二种二抗共时孵育.抗体浓度、孵育时间要自尔摸索，尔感觉一抗4℃孵育过夜比较佳，背景比较浑晰. 3、尔的阳性对于照采与的是阳性构造切片，阳性对于照则分别是家兔战大鼠的IgG，荧光标记表记标帜物对于照是PBS+荧光标记表记标帜物. 4、启关血浑是二抗根源动物的平常血浑，尔用的是10%平常donkey血浑. 5、其余事项共免疫荧光单标支配.免疫组化单沉染色要领战步调正在死物医教战临床钻研考查中，常常需要检测二种分歧物量是可正在共一般品中共存或者共一种细胞中共存，果此出现了免疫构造化教单沉染色.此要领有几种典型，包罗免疫酶构造化教战免疫荧光细胞化教法分离;共十足片的再度染色法(先对于第一种抗本染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗本抗体解离，继之，对于第二种抗本染色、拍照);二种酶标抗体3又沉染色(分别用辣根过氧化物酶战碱性磷酸酶标记表记标帜第二抗体.用间接法分别隐现A战B抗本，如二种一抗去自共一种属，常有沉叠染色);分歧种属根源的抗体单沉染色.暂时，最常常使用的是末尾一种要领.分歧种属根源的抗体单沉染色，二种抗体间无接又反应.特同性较下，纵然细胞内抗本量很少也能检测.然而是，当二种抗本存留于共一部位而其中之一浓度较下，占千万于劣势时将妨碍另一种抗本染色，此种情况应分别染色，最先染色含量较少的抗本，再隐现含量歉富的抗本.正在该要领中应用最多的是把SABC法或者SP 法的真验过程沉复二次，其中二种分歧特同性抗体(不妨是小鼠或者大鼠单克隆抗体战兔多克隆抗体的所有二个拉拢)，与一抗对于应的分歧种属死物素化二抗战二种分歧隐色系统.即可将分歧部位或者相共部位的二种抗本隐现出去.该要领用于石蜡切片时应试虑所采用的二个抗体的建复要领该当普遍或者一个抗体的建复对于另一个抗体的染色截止不做用.SP法单沉染色步调1～6步调与SABC法相共，然而无需使用死物素阻断剂：7.切片加进A特同性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS浑洗3次，屡屡5分钟8.滴加死物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，既而PBS浑洗3次，屡屡5分钟;9.滴加链霉菌抗死物素蛋黑—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS浑洗3次，屡屡5分钟10.碱性磷酸酶隐色液(BCIP/NBT)隐色(紫蓝色).PBS浑洗3次，屡屡5分钟;11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可预防已隐色的抗本褪色);12.滴加抗小鼠二抗共种属的非免疫血浑，37~C孵育10分钟;13.滴加B特同性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育.PBS浑洗3次，屡屡5分钟;14.滴加死物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟.PBS浑洗3次，屡屡5分钟：15.滴加链霉菌抗死物素蛋黑—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS浑洗3次，屡屡5分钟16.过氧化物酶隐色液(AEC)隐色(陈黑色).PBS浑洗3次，屡屡5分钟17.苏木粗复染细胞核;18.火溶性启片剂启片. 正在使用SP法单沉染色之前需要对于待测抗本的本量、二抗的种属典型战隐色系统举止仔细安排.买买免疫组化单染试剂盒时;应采用与安排规划相共的配套试剂.正在采用一抗时应预防定位正在细胞的共一部位(如胞核、胞浆战胞膜)的二种抗本，如果不可预防，最佳采用免疫荧光构造细胞化教单沉染色要领，果为二种分歧颜色的荧光沉叠后浮现另一种颜色的荧光(如黑色荧光与绿色荧光沉叠浮现黄色荧光)，它比SP法的隐色系统更简单辨别战辨别阳性截止. 正在举止单沉染色之前，必须对于所采用的一抗分别举止单独染色预真验，预真验条件必须与单染条件相共，正在瞅察预真验截止战抗体定位粗确后，再举止单染真验.。

与Molecular Probes 一起成为荧光成像艺术家—免疫荧光实验五大挑战疑难解答Molecular Probes ®免疫荧光实验五大挑战疑难解答引言 .....................................................................................................3五大挑战疑难问题概述..........................................................................3背景荧光及其解决方案.. (4)背景荧光概述 .................................................................................4背景荧光的来源 .............................................................................4如何减少背景荧光 ..........................................................................5荧光成像中的光漂白效应及其消除方法 (6)光漂白效应概述 .............................................................................6如何改进光漂白效应 ......................................................................7荧光成像中的光串色效应 . (8)光串色效应介绍 .............................................................................8如何使光串色效应最小化 (9)活细胞成像中的光毒性及其消除方法 (9)光毒性现象.....................................................................................9如何避免光毒性 ...........................................................................10荧光成像中的光照度不均匀 . (11)光照度不均匀现象 ........................................................................11如何改进光照度不均问题 .............................................................11Molecular Probes ® 荧光检测&分析课堂 ............................................12细胞成像诊断工具小贴士 .. (13)目录Molecular Probes ®免疫荧光实验五大挑战疑难解答免疫荧光实验五大挑战疑难解答引言大多数情况下，科学都是1%的灵感加99%的重复试验，反复审视那些有瑕疵的结果并找出改进之处是收获科学硕果的重要一环。