当前位置：文档之家 › 胰岛细胞药物筛选模型的建立_小鼠胰岛的原代培养_丘渭遥

胰岛细胞药物筛选模型的建立_小鼠胰岛的原代培养_丘渭遥

  • 格式：pdf
  • 大小：200.22 KB
  • 文档页数：4

文章编号： 1006－6233（ 2011） 12－1654－04
胰岛细胞药物筛选模型的建立—小鼠胰岛的原代培养
丘渭遥
（ 深圳大学医学院生化中心， 广东 深圳 518057）
摘 要： 目的： 用胰岛细胞作为糖尿病新药的细胞筛选模型需保持其结构完整、生理功能稳定和
足够长的存活时间，为此本文对小鼠胰岛分离纯化和培养方法进行优化。方法： 用胶原酶、透明质酸 酶和 DNA 酶消化，Ficoll 400 密度梯度离心法分离胰岛； DTZ 染色法和台盼兰染色测定胰岛的纯度和
参考文献： ［1］ 姜泗长，方耀云． 耳鼻咽喉科临床误诊误治及处理［M］．
昆明： 云南科技出版社，2000． 128－129． ［2］ 中华医学会耳鼻咽喉科学分会、中华耳鼻咽喉科杂志编
辑委员会． 慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型分期及内窥镜鼻 窦手术疗效评定标准［J］． 中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33 （ 3） ： 134． ［3］ 江满杰，李泽卿，王秋萍． 南京城区儿童慢性鼻窦炎流行 病学调查［J］． 医学研究生学报，2006，19（ 1） ： 613． ［4］ 陈和平，李春林，樊宏． 鼻内镜手术治疗慢性鼻窦炎鼻息 肉［J］． 中国耳鼻咽喉头颈外科杂志，2008，15 （ 4） ： 842 － 843． ［5］ 李轶． 38 例内窥镜鼻窦手术临床观察和分析［J］． 中国实 用医药，2008，3（ 20） ： 288－290． ［6］ 尹秋鸿，刘虹，李长国，等． 鼻内镜手术治疗鼻窦炎鼻息肉 87 例分析［J］． 中国内镜杂志，2006，12 （ 1） ： 456－458．
Ficoll 液 1mL，然后依次沿 管 壁 慢 慢 分 层 加 入 23% 、 20% 和 11% 的 Ficoll 液 各 1mL。4℃ 400rpm 离 心 4min，继之 2000rpm 离心 12min。收集位于第二层面 的胰岛加入 Hanks 液 600rpm，1min 离心清洗。之后加 入 RPMI1640 完全培养基（ 含 10% FBS） 37℃ 5% 二氧 化碳培养。培养 24h 后，成纤维细胞均已贴壁，再次收 集胰岛并反复洗涤离心，获得完整单离的纯净胰岛。 1． 4 胰岛的培养 1． 4． 1 培养基质的预处理方法： Poly －L －Lys 的处理 方法： Poly－L－Lys 均匀涂附培养板壁面，置于 37℃ ，0． 5h，用去离子水洗涤，晾干即可。明胶和 laminim 的处 理方法： 将相应培养基质溶液均匀涂附培养板壁面，置 于 4℃ 过夜，用前再用少许培养基冲洗一次。胶原处 理方法： 用吸管吸少许胶原涂于灭菌培养瓶 /孔板内壁 培养面 上； 向 培 养 瓶 内 通 以 氨 气 后 封 上 瓶 盖，作 用 30min，待胶原凝固，然后用无菌生理盐水冲洗、凉干， 即可使用。 1． 4． 2 胰岛的培养： 用以上方法处理的培养板培养胰 岛。 1． 5 胰岛生物活性的测定 1． 5． 1 胰岛数目和活力的测定： DTZ 染色计算收获胰 岛数目。台盼兰染色计算细胞活力，参照 Freshneiy 方 法［6］。 1． 5． 2 培养上清中胰岛素含量的测定： 每天取培养孔 内全部上清用胰岛素放射免疫试剂盒检测胰岛素含 量，同时补充等量的新鲜培养基。以接种后培养第 1 天内的胰岛素分泌良为基准，胰岛素的分泌水平表达 为同一培养孔后来检测的胰岛素含量与第 1 天的胰岛 素分泌量相除所得到的比值。 2 结果与讨论 2． 1 不同酶体系对小鼠胰岛分离效果的影响： 采用不 同组分配比的酶液分别对小鼠胰腺组织进行消化，结 果如表 1。
·1654·
第 17 卷 第 12 期 2011 年 12 月
河北医学
HEBEI MEDICINE
Vol． 17，No． 12 Dec． ，2011
活力； 放射免疫方法检测胰岛分泌水平变化。结果： 0． 1% 胶原酶 /0． 1% 透明质酸酶 /0． 1% DNase －Ⅰ
（ v / v） 为 4： 2： 0． 5 的消化酶体系，采用 4℃ 和 37℃ 两步消化法可得到较高纯度和活力的胰岛； 用聚赖氨
（ v /v）
0． 1% 胶原酶（ 4： 1） /0． 1% 透明质酸酶（ 2： 1） / 独立的细胞团以 100－300μm 为主，经 24h 培养完全单离为胰岛，无粘蛋白样物
0． 1% DNase－Ⅰ（ 0． 5： 1） （ v / v）
从表 1 可知 0． 1% 胶原酶/0． 1% 透明质酸酶/0． 1% Dnase－Ⅰ为 4： 2： 0． 5（ / v） 消化酶体系的分离效果 最好。Dnase－Ⅰ的引入可以剔除消化过程中因部分细 胞破损而泄露的遗传物质，从而消除了细胞团 的 粘 连［7］，取得理想的分离效果。 2． 2 不同消化方法对胰岛生物活性的影响 2． 2． 1 不同消化方法对胰岛收获数目和活力的影响： 采用二步消化法，即先让加好酶液的组织 4℃ 保温一 定时间后再进行 37℃ 消化，终止后测定收获的胰岛的 数目和活力。数据为三次独立实验的平均值。结果如 表 2。
低复发率，保存鼻腔的生理功能具有一定的临床应用 价值。
临床应用鼻内窥镜行鼻息肉切除，既切除了鼻腔 内息肉，又清除了鼻窦内炎性病灶，从而减少了鼻息肉 的复发率。鼻内窥镜手术的原则是在不损伤鼻腔、鼻 窦解剖结构的前提下，清除病变组织，保留其本身的生 理功能［5］。总之，鼻内窥镜手术重建了窦口鼻道复合 体的通气和引流情况，恢复了鼻窦黏膜的纤毛清除功 能，具有组织损伤小、鼻腔生理功能损伤小、术后复发 率低等优点，值得临床广泛应用［6］。
变化曲线。数据为三次独立实验的平均值。与未经冷 消化处理的胰岛进行对照，采用 2h 冷消化方法在提高 胰岛收率同时，胰岛分泌功能无明下降。表明冷消化 与热消化结合的两阶段消化模式可以提高收率。原因 可能是胰岛在胰腺内是分散分布的，在冷消化过程中， 酶活性低，但能够通过扩散和渗透作用进入组织块内 部，在后续的热消化过程中达到里应外合的效果。
表 2 两阶段消化模式对收获胰岛的影响
4℃ 冷消化 时间* （ h）
0
37℃ 热消化 收获胰岛数目 台盼兰染色拒染
计算机水平、分子水平、细胞水平和模型动物水平 是现代新药筛选建立模型的四个不同层次的基本平 台［1］。细胞水 平 的 筛 选 是 以 体 外 培 养 细 胞 为 检 测 手 段，可提供细胞内外综合变化，进行多靶点和功能及高 通量筛选，是发现新药的重要途径。
Ⅱ型糖尿病是由于胰岛素抵抗或胰岛素分泌缺陷 引起的［2］。在 正 常 的 生 理 条 件 下 胰 岛 是 一 个 完 整 的 独立的功能单位，能够敏感地响应血糖浓度变化，分泌 激素维持 血 糖 浓 度 平 衡［3］。 但 是 体 外 原 代 培 养 时 容 易去分化 而 失 去 特 定 的 生 理 功 能 或 响 应 性［4］。 因 此 分离出结构完整的胰岛，保持体外培养胰岛结构完整 性，能维持胰岛细胞稳定的分泌功能，是建立细胞水平 糖尿病药物筛选模型的必要条件。为此本文对原代小 鼠胰岛的分离、纯化及体外培养方法进行探索和改进。 1 材料与方法 1． 1 动物与试剂： 昆明种小鼠（ 中山医科大学试验动 物中心） ； 胎牛血清（ 杭州四季青生物工程有限公司） ； RPMI－1640 培养基（ Gibco BRL products） ； 胰蛋白酶、 胶原酶Ⅳ型、透明质酸酶（ Sigma Chemical Co． ） ； Dnase －Ⅰ（ Bovine pancreas） （ 华美生物工程公司） ； Ficoll 400 （ Sigma Chemical Co． ） ； 双硫腙（ DTZ） 分析纯（ 上海试 剂三厂） ； Poly － L － Lysine （ Sigma 进 口 分 装） ； Gelatin， Type G2500（ Sigma Chemical Co． ） ； Laminin（ 小鼠） （ Invitrogen Corporation） ； 台盼兰（ 上海试剂三厂） ； 胰岛素 放免试剂盒（ 中国原子能科学院同位素研究所） 。 1． 2 小鼠胰岛分离方法［5］： 取 3 －4 周龄小鼠，引颈处 死，消毒后暴露胰腺，无菌取出胰腺置 D－Hank 液中。 用眼科剪剪碎至 1mm 以下。清洗后移至试管内，加入 一定配比的消化酶液，4℃ 放置一段时间后，37℃ 消化。 见组织片细薄均等附着于管壁，表示消化终了。加入 Hank 液，过 400μm 不锈钢筛。收集滤液置于冰水浴 保存，Hanks 液离心清洗，去上清。 1． 3 胰岛的纯化［5］： 于上法得到的沉渣中加入 25%
酸作培养基质能稳定地维持胰岛分泌功能，且相对成本低廉。原代小鼠可以体外存活 6 周，维持稳定
分泌功能 10d。结论： 采用上述消化、培养方法，原代小鼠胰岛能保持完整的结构并能在较长的时间维
持其胰岛素分泌功能。
关键词： 胰 岛； 原代培养； 糖尿病； 药物筛选； 模 型
文献标识码： B
doi： 10． 3969 / j． issn． 1006－6233． 2011． 12． 35
细胞破损严重，体系粘稠 细胞破损严重，体系粘稠 细胞团均在 400μm 以上，经 72h 培养仍无法单离胰岛，有粘蛋白样物 细胞团略小，72h 培养仍无胰岛单离出来，粘蛋白样物较多 细胞团较小，出现完整单离的胰岛夹杂于粘蛋白样物中间
0． 1% 胶原酶（ 4： 1） /0． 1% 透明质酸酶（ 2： 1） 独立的细胞团约 100－300μm，经 24h 培养完全单离为胰岛，仍有少量粘物
·1655·
第 17 卷 第 12 期 2011 年 12 月
河北医学
HEBEI MEDICINE
Vol． 17，No． 12 Dec． ，2011
表 1 不同消化酶体系组成对胰岛分离的影响
消化方法
消化结果
0． 25% 胰蛋白酶 7： 1（ v酶 / v组织碎片 ，下同） 0． 25% 胰蛋白酶 /0． 02% 胶原酶 7： 1（ v / v） 0． 02% 胶原酶 7： 1（ v / v） 0． 02% 胶原酶 16： 1（ v / v） 0． 1% 胶原酶 4： 1（ v /v）

合集下载

糖尿病动物模型建立

糖尿病动物模型建立

糖尿病动物模型建立糖尿病是一种常见的慢性代谢性疾病，严重影响着人类的健康。

为了深入研究糖尿病的发病机制、预防和治疗方法，建立可靠的糖尿病动物模型至关重要。

糖尿病动物模型的建立方法多种多样，主要包括化学药物诱导、手术诱导、自发性糖尿病动物模型以及基因工程技术诱导等。

化学药物诱导是较为常用的方法之一。

其中，链脲佐菌素（STZ）是常用的诱导剂。

STZ 能够选择性地破坏胰岛β细胞，导致胰岛素分泌不足，从而引发糖尿病。

在使用 STZ 诱导糖尿病模型时，剂量和给药途径是关键因素。

一般来说，小鼠的常用剂量较低，大鼠的剂量相对较高。

给药途径可以是腹腔注射或静脉注射。

此外，还有一些其他的化学药物，如四氧嘧啶，也可用于诱导糖尿病模型，但相对而言，STZ 更为常用。

手术诱导糖尿病模型主要是通过胰腺切除或胰岛切除的方式。

例如，切除大部分胰腺组织会使胰岛素分泌显著减少，从而导致糖尿病的发生。

这种方法的优点是模型的致病机制明确，但手术操作复杂，对动物的创伤较大，术后护理要求高，且模型的稳定性和重复性可能受到一定影响。

自发性糖尿病动物模型则是指某些特定的动物品系在自然状态下自发出现糖尿病症状。

例如，db/db 小鼠和 ob/ob 小鼠就是常见的自发性糖尿病模型。

这些小鼠由于基因突变，导致胰岛素抵抗或胰岛素分泌缺陷，从而自然发展为糖尿病。

自发性糖尿病动物模型的优点是更接近人类糖尿病的自然病程，但缺点是价格昂贵，饲养条件要求高。

基因工程技术诱导的糖尿病动物模型是近年来发展起来的新技术。

通过基因编辑技术，如敲除或过表达某些与糖尿病相关的基因，可以构建出特定类型的糖尿病模型。

这种方法可以精准地模拟特定的糖尿病发病机制，但技术难度较大，成本较高。

在建立糖尿病动物模型时，需要考虑多种因素。

首先是动物的选择。

常用的实验动物包括小鼠、大鼠、豚鼠等。

小鼠和大鼠因其繁殖快、饲养成本低、遗传背景清晰等优点，被广泛应用。

但不同品系的动物对糖尿病的易感性可能不同，因此需要根据研究目的选择合适的品系。

小鼠胰岛分离实验报告

小鼠胰岛分离实验报告

一、实验目的1. 掌握小鼠胰岛的分离方法。

2. 了解胰岛细胞的基本特性及其在糖尿病研究中的应用。

3. 培养实验操作技能，提高生物实验的实践能力。

二、实验原理胰岛是胰腺内的一种内分泌腺体，主要由β细胞组成，分泌胰岛素，调节血糖水平。

胰岛素是一种重要的激素，能够降低血糖浓度。

胰岛分离实验是研究胰岛素生理功能和糖尿病的重要手段。

三、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠，3-4周龄。

2. 试剂：胶原酶、生理盐水、双硫腙、葡萄糖、胎牛血清、DMEM基础培养基、Percoll等。

3. 仪器：解剖显微镜、相差显微镜、CO2恒温培养箱、恒温水浴摇床、低速台式离心机、剪刀、镊子、眼科剪、头皮针等。

四、实验步骤1. 动物准备：将小鼠颈椎脱白法处死，置于75%酒精浸泡消毒。

2. 解剖：取仰卧位，V字形剪开大鼠腹部至箭突，用镊子轻轻分离脏器，用血管夹夹住胆管位于十二指肠处的出口，向上约45°沿肠系膜方向牵拉固定保持一定张力。

3. 胰腺灌注：将儿科头皮针近针尖处弯成L型，连接V型胶原酶溶液，以6ml/min的速度缓慢灌注，使胰腺逐渐充盈。

4. 胰腺摘取：迅速用眼科剪剪下胰腺，快速剪除脂肪组织、结缔组织及淋巴结，放入装有约2-3 ml的4°C预冷胶原酶溶液的离心管内。

5. 消化：将离心管置于38°C水浴中10分钟，使胰腺消化成细沙状。

6. 终止消化：加入含10%FBS的DMEM HIGH完全培养基终止消化。

7. 离心：混匀，1000 r/min，离心3分钟。

弃上清。

8. 清洗：加入4°C预冷过的PBS重悬细胞悬液，50目筛网过滤。

收集细胞悬液，再次1000 r/min，离心3分钟，弃上清。

加入PBS溶液混匀清洗2次。

9. 密度梯度离心：弃上清，加入6 ml Percoll液轻吹打混匀，倾斜离心管，沿管壁缓慢加入等量PBS溶液形成两个密度梯度，水平离心机2000 r/min，离心20分钟。

小鼠胰岛细胞使用说明

小鼠胰岛细胞使用说明

小鼠胰岛细胞小鼠胰岛细胞产品说明：为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。

派瑞金提供的小鼠胰岛细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。

研发的小鼠胰岛细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。

同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。

注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。

3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。

培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。

4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。

5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。

小鼠胰岛细胞产品简介：1、产品名称：小鼠胰岛细胞（Mouse pancreatic islet cells）2、组织来源：小鼠胰岛3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶小鼠胰岛细胞简介：胰岛细胞作为糖尿病新药的细胞筛选模型需保持其结构完整、生理功能稳定和足够长的存活时间。

本公司生产的大鼠胰岛细胞采用混合酶消化而来，胰岛素分泌实验证明获得较高纯度和活力的胰岛细胞，细胞总量约为5×105cells/瓶，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

小鼠胰岛细胞培养基信息：1）培养基类型：DMEM高糖2）添加因子：FBS、Penicillin、Streptomycin 等小鼠胰岛细胞使用方法：细胞培1. 取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。

I型糖尿病（胰岛素依赖）动物模型

I型糖尿病（胰岛素依赖）动物模型

I型糖尿病（胰岛素依赖）动物模型
1、自发性糖尿病模型实验动物：BB大鼠、LETL大鼠、NOD小鼠模型特点：起病快、症状明显，BB大鼠伴有酮症酸中毒。

适用研究：I型糖尿病研究获取方法：直接购买
2、诱发性糖尿病模型（1）手术诱导实验动物：大鼠、猫、狗模型特点：切除胰腺后,β细胞缺失而产生永久性DM。

适用研究：I型糖尿病研究获取方法：全部或大部分切除实验动物的胰腺，但保存胰十二指肠动脉吻合弓。

如果连续两天血糖值超过11.1 mmol/L或者葡萄糖耐量试验120 min时的血糖值仍未恢复到注射前水平则认为DM造模成功。

（2）化学药物诱导（STZ）实验动物：小鼠、大鼠、家兔、狗模型特点：链脲佐菌素（streptozotocin STZ）诱导胰岛β细胞死亡。

适用研究：I型糖尿病研究获取方法：采用STZ腹腔注射。

STZ的参考剂量为50～150mg ／kg。

（另一种四氧嘧啶诱导法由于不如STZ好，这里就不作介绍。

）
3、转基因模型实验动物：NOD-RIP-B7-1小鼠模型特点：过表达辅助刺激因子B7-1而致糖尿病发病时间较正常NOD小鼠明显提前，在12周龄即发生糖尿病。

适用研究：I型糖尿病研究获取方法：自己构建转基因小鼠或直接定制购买。