本文以大肠杆菌DH10B为例介绍外源基因在大肠杆菌中表达全过程
克隆步骤包括：模板制备（基因组DNA提取）-感受态细胞的制备-PCR-纯化回收-酶切-连接-转化-挑菌摇菌-质粒抽提-酶切鉴定-测序
1) 基因组DNA提取（以家蚕为例）
1. 取家蚕五龄后部丝腺约0.5g，于10ml匀浆器内，加2mlDNA抽提缓冲液，在
冰上充分研磨，转入5ml的离心管；
2. 加入RnaseA（10ul）至终浓度20ug/ml，37℃水浴1h；
3. 加入ProteinaseK（25ul）至终浓度100ug/ml，55℃水浴2h；
4. 分装到1.5ml eppendorff管，0.6ml/管；
5. 加入等体积的平衡酚（pH8.0），充分混匀，5000g，15min，取上清；
6. 重复5，再抽提1次；
7. 用等体积的酚/氯仿（1/1，v/v），氯仿各抽提1次
8. 将上清移入新离心管，加入1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），2倍体积的
无水乙醇，充分混匀，4℃过夜
9. 用牙签将絮状沉淀物挑出。用75%冰酒精洗涤3次，37℃控干；
10. 200µl 0.1 TE(pH8.0)溶解DNA；
11. 检测OD值；
12. 做好标记，以供进一步实验之用。
2) 感受态细胞的制备
1. -20℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏（划板），37℃，8-12小时；
2. 用灭菌牙签挑取单菌落，放入3ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
3. 取100μl过夜培养物接种到另一3 ml LB培养基中，37℃振荡培养2∼2.5 h，
使OD值在0.6左右（把握好浓度，OD值可以不用测）；将菌液分装到1.5ml EP 管中（在超净台完成）
4. 5000 g离心4 min收集菌体，将菌体重悬于800 μl 75 mmol/L冷CaCl2中，
冰浴30 min；（CaCl2要用高纯度的，切记！）
5. 4℃，5 000 g离心4 min，弃上清；
6. 加入200μl 75 mmol/L冷CaCl2，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放4 h
后用于转化，或加0.1倍体积甘油混匀，－70℃保存备用。可以保存至少6个月。
3) PCR
1、PCR反应体系：
ddH2O 37.7 μL
10×PCR buffer 5 μL （25mM）
dNTP 4 μL
引物1/2 1μL/1μL
Taq酶 0.3μL
模板 1μL
PCR反应体系总体积 50 μL
充分混匀，稍离心。
2、PCR反应条件
Step 1 94℃ 5min
Step 2 94℃ 30s;
Step 3 55℃ 1 min;
Step 4 72℃ 1 min 30 s;
Go to step2 35 cycles;
72℃ 10 min ；
4℃保温
3、PCR完成后，取3μL电泳检测大小是否正确。
玻璃奶法纯化回收DNA片段，-20℃保存供进一步实验之用。
4) 玻璃奶纯化回收
1.对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；
2.电泳后的胶在紫外光下切割目的片段；
3.放入EP管称重（此步可以大概估计一下，称重太麻烦），加入3倍体积的6M NaI;
4.65℃水浴至胶完全溶解；
5.加入glass-milk充分混匀。冰上放置10分钟（中间摇2-3次）；
6.12000rmp5-10S，去上清；
7.沉淀用600μlNewWash或75%乙醇洗3次（充分弹起）；
8.37℃烘干，0.1×TE溶解（30μl左右），37℃5-10min促进溶解；
9．12000rmp 2min,上清即为回收的DNA，用时不要动沉淀。
5) 酶切
酶切体系：
PCR产物 12 μl
10×K buffer 3 μl
EcorI/BamHI 1/1 μl
DdH2O 13 μl
Total30 μl
37℃ 2h酶切; 65℃ 15min,使酶失活
6) 连接
连接体系：
10×Ligase buffer 1 ul
PGEM4Z（EcorI/BamHI酶切）0.2 ul
目的片段（酶切产物） 7.8 ul
T4DNA Ligase 1 ul
Total 10 ul
16℃ 9h左右。
注：所有试剂、PCR、酶切、连接体系均为本实验所用，别的实验请自行调整！
7) 质粒DNA的转化
1. 连接混合物5 μl加到200 μl上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴
30 min；
2. 再进行热休克，42℃保温2 min，迅速置冰上1∼2 min，加入1 ml已温育至
37℃的LB培养基；
3. 37℃振荡培养1－2 h，3000rmp/min稍离心，去部分上清（800μl左右，确
保够涂板用）后涂布于数个含80 μg/ml Amp的LB平板上。37℃倒置培养过夜。
8) 挑菌摇菌
挑取单菌落于3mlLB液体培养基中，加入5ulAmp,37℃震荡培养10h左右（根据菌液混浊程度而定）。
9) 质粒抽提
1. 取过夜培养液1.5 mL 于Eppendorf中,5000 rpm,5 min，收集菌体细胞
2. 真空吸去上清后，向沉淀中加150 μL SolutionⅠ，振荡器混匀，室温放置15
min，
3. 加300 μL Solution Ⅱ,150 μL氯仿，轻轻混匀，冰上放置5 min。
4. 加450 μL的Solution Ⅲ，充分混匀后，冰浴10 min或更长的时间。
5. 4 ℃，12000 rpm离心5 min，将上清转移到新的1.5 mL 的Eppendorf中，
加入0.6倍体积的异丙醇，冰浴10 min或更长时间。
6. 4 ℃，12000 rpm离心5 min，去掉上清，沉淀用250 μL的TER溶解，（TER：
1×TE中含20μg/mLRNase）,37 ℃保温20 min。
7. 再加入300 μL的PPT沉淀Buffer，4℃沉淀20 min，
8. 12000 rpm,5 min，沉淀用75%的酒精洗一次，37℃烘干直到没有酒精味道，
9. 用0.1×TE溶解DNA，-20℃备用。
10) 酶切鉴定
酶切体系：
DNA 4 μl
10×K buffer 1.5 μl
EcorI/BamHI 0.5/0.5 μl
ddH2O 8.5 μl
Total 15 μl
37 ℃2h.
进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
11) 测序
对鉴定正确的细菌做成甘油菌寄到生物公司测序
甘油菌制备：
1. 取100ul鉴定正确的菌液于3mlLB液体培养基中，加入5ulAmp,37℃震荡培
养7h左右（根据菌液混浊程度而定）；
2. 分装至EP管中，每管加入3-4滴甘油，摇匀。用封口膜封装。
