肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究

绿色荧光蛋白的研究进展作者：杨慧敏， 李文刚， 吴高锋， 魏娟， 王鑫作者单位：杨慧敏,吴高锋,魏娟,王鑫(河南农业大学,郑州,450002)， 李文刚(郑州牧专,郑州,450011)刊名：中国畜牧兽医英文刊名：CHINA ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE年，卷(期)：2008，35(8)引用次数：1次1.方六荣.陈焕春表达绿色荧光蛋白伪狂犬病病毒转移载体的构建及转移特性[期刊论文]-中国兽医学报 20012.李夏.陈素文.喻达辉绿色荧光蛋白及其在转基因动物研究中的应用[期刊论文]-南方水产 20053.范伟兴.宋建兰表达绿色荧光蛋白伪狂犬病病毒Bartha-K61株TK突变株的构建[期刊论文]-畜牧兽医学报2003(05)4.林爱星.刘小军.陈永福绿色萤光蛋白及其在转基因表达检测中的应用 1997(03)5.岳莉莉.齐义鹏.社会胜用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统高效表达绿色荧光蛋白标记的HB Ve抗原[期刊论文]-病毒学报 1998(03)6.Chafee I.Too Y.Euskirchen G Green fluorescent protein as a marker for gene expiree 19947.Fleckenstein J M.Holland J T.Hasty D L Interaction of an outer membrane p rotein ofenterotoxigenic Escherichia coliwith cell surface heparan sulfate proteoglycans 2002(03)8.Galipeau J.Li H.Paquin A Vesicular stamatitis delivery in experimental brain cancer 1999(12)9.Grignani F.Kinsella T.Mencarelli A High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein 1998(01)10.Heim R.Cubitt A B.Tsien R Y Improved green fluorescence 1995(6516)11.Heim S.Freeman R B J.Eulitz C Auditory temporal processing deficit in dyslexia is associated with enhanced sensitivity in the visual modality 2001(03)12.Ikawa M.Kominami K.Yoshimura Y Green fluorescent protein as a maker in transgenic mice 1995bas Y A.Gurskaya N G.Yanushevich Y G Diversity and evolution of the green fluorescent protein family 200214.Loimas S.Toppinen M R.Visakorpi T Human prostate carcinoma cells as targets for herpes simplex virus thymidine kinase-mediated suicide gene therapy 2001(02)15.Ogawa H.Inouye S.Tsuji F Localization,trafficking,and temperature Dependence of the Aequorea GFP in culture dvertebratet 199516.Rasher D C.Eckerd S W W Primary structure of The Aquaria Victoria green fluorescent protein1992(02)17.Valdivia R H.Alexander E H Applications for green fluorescent protein (GFP) in the study of hostpathogen interactions 199618.Wang S.Hazelrigg T Implications for bed mRNA localization from spatial distribution of exuprotein in Drosophila genesis 1994(6479)1.期刊论文罗文新.陈敏.程通.管宝全.李少伟.李少菁.张军.夏宁邵橙色荧光蛋白--绿色荧光蛋白GFPxm的改造-生物工程学报2003,19(1)最近报道了从大型多管水母中分离出新的gfp基因.经大肠杆菌表达并纯化出的绿色荧光蛋白(GFPxm)具有476nm的激发峰和496nm的发射峰,但是只能在低温下成熟的缺点限制了它的应用.这里进一步报道GFPxm的12种突变型.在大肠杆菌中的表达结果表明,有7种突变型在37℃条件下产生高的荧光强度.在25、32和37℃条件下表达6 h,GFPxm16、GFPxm18和GFPxm19的相对荧光强度均高于增强型绿色荧光蛋白(EGFP),而GFPxm16和GFPxm163在42℃高温表达时仍能保持高的荧光强度.这7种突变型中的4种在哺乳动物细胞中已获得良好表达.此外,有6种突变型的荧光光谱红移,目前所达到的最长激发峰为514nm、最长发射峰为525nm.另外有3种突变型具有包括紫外在内的两个激发峰,1种突变型只有单一的紫外激发峰.首次报道具有橙色荧光的突变型OFPxm,它的激发峰为509nm、发射峰为523nm.523nm属于黄绿色,但肉眼看到的蛋白为橙色.OFPxm在高温下可得到高水平表达且很好地成熟,但是因为低的量子产率而荧光强度相对较低.2.学位论文左妍四环素-绿色荧光蛋白生物传感器的构建及活性测定2004将来源于水母的绿色荧光蛋白基因(gfp)和来源于E.coli转座子Tn10的四环素阻遏蛋白基因(tetR)共同构建到E.coli表达载体pET-30a+上,使融合蛋白两部分蛋白间插入不同长度肽联,获得TetR C-端与GFP N-端融合蛋白:TR∷GFP和TR∷GFPs.在E.coli BL21中诱导表达并纯化了两种形式的融合蛋白.TR∷GFP(蛋白间间隔19aa)保留了GFP的荧光特性,即在395nm激发,可以510nm附近有最大发射峰.在四环素存在时,TR∷GFP在400nm-700nm范围内的荧光强度普遍增强,在510nm处增幅最大,由原来1.132增至2.214,增幅为95.6﹪,而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响不大,表明TR∷GFP,能感受外界四环素.TR∷GFPs(蛋白间间隔5aa)具备GFP荧光性质,但不具备感受四环素能力.对其中GFP部分定点突变(T203Y),获得发射荧光红移的突变融合蛋白(TR∷GFPsm).在E.coli BL21中诱导表达并纯化了TR∷GFPs和TR∷GFPsm,TR∷GFPsm经395nm激发,在526nm处出现最大发射峰;在四环素存在时,TR∷GFPsm在400nm-700nm范围内荧光强度普遍增强,以526nm处增幅最大,由原来20.33增至41.6,增幅为104.6﹪;而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响幅度较小,表明TR∷GFPsm,能感受外界四环素.用不同浓度的tc滴定TR∷GFPsm,显示4.1218μM的TR∷GFPsm随着tc浓度的增加,荧光强度相应呈指数增长,最终达到饱和.初步说明TR∷GFPsm具有tc生物传感器性质.为了使TetR与四环素结合所产生的构象变化能更好地传递给GFP,将TetR插入到GFP171aa-172aa,构建了GFP与TetR中间融和蛋白GFP()TR,在E.coli BL21中诱导表达,该融合蛋白失去荧光性质.为了获得对四环素更为敏感的传感器,用易错PCR构建了TR∷GFP和TR∷GFPsm突变体库,初步摸索了平板筛选荧光突变体的方法.3.期刊论文左妍.杨克迁四环素-绿色荧光蛋白融合蛋白的构建及其活性测定-生物工程学报2005,21(1)将来源于水母的绿色荧光蛋白基因(gfp)和来源于E.coli转座子Tn10的四环素阻遏蛋白基因(tetR)共同构建到E.coli表达载体pET-30a+上,获得TetR C-端与GFP N-端融合蛋白.对经诱导表达并纯化后的融合蛋白(TR::GFP)进行荧光发射光谱分析表明,该融合蛋白保留了GFP的荧光特性,即在395 nm激发下,可在510 nn附近有特征发射峰.在加入四环素后,融合蛋白在395 nm激发下,在400 nm～700nm范围内的发射光谱发生明显变化,荧光强度普遍增加,且以510 nm处最大发射峰增幅最大,由原来1.132增至2.214,而四环素对相同浓度的GFP与TetR荧光影响不大,结果表明该融合蛋白,能感受外界四环素,并产生一定的荧光变化.4.学位论文邹奇大鼠肝卵圆细胞移植对暴发性肝衰的治疗作用及示踪研究2007目的：建立成年大鼠肝卵圆细胞增殖模型，进一步进行卵圆细胞的分离、纯化、鉴定和培养；利用绿色荧光蛋白基因转染和荧光染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)染色两种方法进行标记，比较两种方法标记细胞的可行性；随后选择较优标记方法标记的卵圆细胞移植治疗暴发性肝功能衰竭大鼠，探索卵圆细胞移植治疗暴发性肝衰的可行性及有效性。

绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。

所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。

将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。

关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。

1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。

长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。

1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。

GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。

基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。

GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。

本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。

其上有所用酶的酶切位点。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取欧阳学文南方医科大学预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFPN3和质粒pET28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）8 5.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（LuriaBertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASEFREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFPN3质粒全图谱1310．P ET28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

万方数据２００４年６月绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）研究进展７１随着生命科学和医学研究的不断深入，研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因，现有的报告基因主要有：分泌型胎盘磷酸酯酶（ｓ秘Ｐ）、Ｂ一半乳糖苷酶（互丑ｃｚ）、８一葡糖苷酸酶（ＧＵＳ）、萤火虫荧光素酶（ＬＵｃ）等，但这些基因的检测方法并不理想，它们都需要底物和辅助因子，因而在活体中的应用受到限制。

最近，一种全新的非酶性报告基因——绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）引起了人们的关注，该蛋白能够自身催化形成发色结构并在蓝光激发下发出绿色荧光。

作为报告基因，ＧＦＰ是目前唯一能在活细胞中表达的发光蛋白；作为荧光标记分子，ＧＦＰ既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害。

最近又发现Ｇ即还是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子，可以跟踪观测第二信使。

近来关于ＧＦＰ方面的研究和综述越来越多，但多是针对某一方面的特点或应用，作者将ｃＦＰ基础理论和应用研究进展作一简要综述。

ｌＧＦＰ基础理论研究进展１．１发展历史１９６２年蹦ｎ舢ｕ飓等…首先从多管水母属（枷ｒｉａ、ｒｉｃｔｏ．ｒｉａ）中分离出了ｃＦＰ；１９９２年Ｐｒａｓｌｌｅｒ等ｕ３克隆了ＧＦＰ基因的ｃＤＮＡ，并分析了ＧＦＰ的一级结构；１９９４年ｃｈ址ｅ等ｂ３首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了ＧＦＰ，开创了ＧＦＰ应用研究的先河，之后很快发现ＧＦＰ能在多种异源细胞中表达，ＧＦＰ在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮；１９９ｒ７年１０月１８—２２日在美国Ｎｅｗ—Ｊ嘲ｙ专门召开了一次关于ＧＦＰ的国际会议。

１．２ＧＦＰ结构、生化特性、发光机制、光谱特性１．２．１结构由正常野生型ｃＦＰ（ｗｔＧ即）的ｃＤＮＡ序列推出的蛋白质一级结构，由２３８个氨基酸残基组成，ｓＤ卜ＰＡＧＥ凝胶电泳测定其分子量为２７—３０ｌ【Ｄ。

晶体学证据Ｈ’表明，ＧＦＰ中央是一个Ｂ罐（ｐ一锄）结构。

ＧＦＰ的生色团位于“一６９的六肽内。

绿色荧光蛋白(GFP) 基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白(green fluoresce nt protein , GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。

GFP由3个外显子组成，长 2.6kb； GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为 27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60C处理。

1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm , 宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平行B折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成.1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平行B折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

实验一质粒DNA 的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA 提取方法：碱裂解法。

该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA ，比较方便、省时，提取的质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。

二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。

迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到 200kb 。

质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

绿色荧光蛋白的原核表达和纯化及鉴定的实验设计与实践王青松;胡晓倩【摘要】该文以绿色荧光蛋白FRP为实验对象,通过设计原核蛋白表达、镍柱亲和纯化、荧光光谱分析、SDSPAGE电泳分离、Western blotting免疫印迹及蛋白质质谱鉴定等内容的生物化学综合实验,提高学生的生物化学实验技能.荧光光谱分析表明,纯化的GFP蛋白的最大激发波长为480 nm,最大发射波长为500 nm,与已知的GFP荧光光谱基本相同.SDSPAGE电泳分离发现,GFP的亲和纯化效果好,且纯化得到的GFP分子量约为27 kDa,与理论值相符.该实验适用于生物科学专业本科生系统完整地学习蛋白质表达、纯化和鉴定的实验方法,具有很好的综合性,取得非常好的教学效果.【期刊名称】《实验技术与管理》【年(卷),期】2014(031)005【总页数】4页(P38-41)【关键词】绿色荧光蛋白;亲和纯化;SDS-PAGE电泳;Western blotting;LC-MS/MS质谱【作者】王青松;胡晓倩【作者单位】北京大学生命科学学院生物基础教学实验中心,北京100871;北京大学生命科学学院生物基础教学实验中心,北京100871【正文语种】中文【中图分类】Q-331绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一种在美国西北海岸生长的名为Aequorea victoria的维多利亚水母中发现的蛋白质。

GFP全长共238个氨基酸，分子量约为27kDa，它的发光核心是由第65至67个氨基酸（丝氨酸－酪氨酸－甘氨酸）残基组成的结构域，可自发地形成一种荧光发色团，在波长395 nm的紫外光激发下可产生绿色荧光［1－4］。

自1962年日裔科学家下村修在维多利亚水母中发现绿色荧光蛋白至今，GFP已经广泛应用于蛋白质表达纯化、蛋白质相互作用、蛋白质细胞内定位示踪和模式生物转基因等生物学研究中［5－8］。

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）对蛋白质进行电泳分离，是生物学研究中广泛使用的实验技术。

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达张历涵20彭千20一、质粒转化入感受态细胞并培育1、原理实验室提供的质粒第一要转入大肠杆菌进行培育与增殖，制备出感受态的细胞，咱们就能够够方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁衍，就能够取得大量质粒。

所谓感受态，是指细菌生长进程中的某一时期的培育物，只有某一生长时期中的细菌才能作为转化的受体，能同意外源DNA而不将其降解的生理状态。

感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，显现各类蛋口质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。

细胞表面正电荷增加，通透性增加, 形成能同意外来的DNA分子的受体位点等。

本实验为了把外源DNA （重组质粒）引入大肠杆菌, 就必需先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。

2、实验步骤DH-5 a和BL-21感受态细胞的制备（1）将0~4 °C保留的DH-5Q和BL-21菌类别离接种在LB液体培育基中37 °C下250 r/min留宿培育16 h。

（2）将别离接种留宿菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培育基中，37 €活化培育2〜3h至OD=〜。

（3）取mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min,然后于4 °C下5000 r/min离心5 min。

弃上清液，沉淀加入mL预冷的mol/L CaCl2缓和悬菌。

冰上放置15-30 min后，4 °C下5000 r/min离心10 mine （4）弃上清液，沉淀用mL预冷的mol/L CaCl2 （含15%甘油）缓和悬菌，放在一20 °C冰箱内保留。

感受态细胞的转化（1）取制备好的感受态细胞100 Ul,冰上解冻，均匀悬浮。

（2）加入2 Ul酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 mine（3）42 °C水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。

（4）加入200 UILB液体培育基，37 °C, 50-100 rpm振荡培育lh。

石河子大学分子生物学实验结课论文绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析学生姓名学号专业年级、班级指导教师所在学院中国·新疆·石河子2016年1月绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。

本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。

关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达1 前言1.1实验目的掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。

1.2实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。

与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。

正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。

绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。

采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。

gfp 实验步骤GFP实验步骤GFP（绿色荧光蛋白）是一种广泛应用于生物学研究中的荧光标记物质，它可以通过荧光显微镜观察到其在细胞或组织中的分布情况。

下面将介绍GFP实验的步骤。

1. GFP基因的克隆需要将GFP基因克隆到感兴趣的载体中。

通常，可以使用限制性内切酶对GFP基因和载体进行酶切，并通过连接酶将两者连接在一起。

连接后的重组载体可以通过大肠杆菌的转化来复制。

2. 细胞培养接下来，将含有重组载体的大肠杆菌进行培养，以扩增GFP基因。

培养条件要求适当的温度和培养基。

当细菌生长到一定程度时，可以进行提取。

3. GFP的纯化提取细菌后，需要进行GFP的纯化。

纯化步骤可以使用亲和层析、离心、电泳等方法。

通过这些步骤，可以得到高纯度的GFP。

4. GFP的表达将纯化后的GFP溶液加入到感兴趣的细胞中，使其表达GFP。

可以通过转染、转化等方法将GFP引入到细胞中。

在细胞培养的过程中，可以观察到GFP表达的情况。

5. 荧光显微镜观察使用荧光显微镜观察GFP在细胞中的分布情况。

荧光显微镜可以通过激发光源激发GFP发出的绿色荧光，并通过镜头观察到荧光现象。

可以通过调节显微镜的对焦、放大倍数等参数来观察GFP的细节。

6. 数据分析观察到GFP的荧光后，可以进行数据分析。

可以计算GFP的表达量、观察GFP在细胞中的定位、动力学等。

通过数据分析，可以得到关于GFP在细胞中的信息。

7. 应用GFP广泛应用于生物学研究中。

例如，在细胞生物学中，可以利用GFP标记蛋白质、细胞器等，观察它们在细胞中的动态变化；在遗传学研究中，可以利用GFP标记基因，观察其在不同组织中的表达情况。

总结：GFP实验的步骤包括GFP基因的克隆、细胞培养、GFP的纯化、GFP的表达、荧光显微镜观察、数据分析和应用。

通过这些步骤，可以获得GFP在生物体内的相关信息，为生物学研究提供重要的实验手段。

GFP作为一种荧光标记物质，在生物学研究中具有广泛的应用前景。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。

方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。

然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。

再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。

将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。

用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。

最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。

结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。

关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (7)5.3.1 双酶切 (7)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (9)5.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (12)6.TE缓冲液（P H8.0） (12)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达张历涵2013141241098彭千2013141241068一、质粒转化入感受态细胞并培养1、原理实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖，制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。

所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。

感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。

细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。

本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。

2、实验步骤2.1 DH-5α和BL-21感受态细胞的制备（1）将0~4 ℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。

（2）将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。

（3）取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min 离心5 min。

弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。

冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。

（4）弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存。

2.2 感受态细胞的转化（1）取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解冻，均匀悬浮。

（2）加入2 μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。

（3）42 ℃水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。

（4）加入200 μl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。

基因克隆和表达的实验设计实验目的研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。

实验方法；通过分别将0M-5a（pEGFP-N3）和0M-5a（pET-28a）提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入0M-5a感受态细胞中进行转化，通过限制性核酸内切酶Not l与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后，通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体Bl-2/内进行表达，再用IPTG诱导GFP 基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。

材料与方法：实验材料克隆菌0W-5a、表达菌6l-21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a 和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶Bam H1、Not I仪器设备Eppendof 离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管。

实验原理生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或类核中。

DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DWA制品的污染常影响到以后的DWA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。

苯酚、氟仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。

经苯酚、氟仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。

DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase 去除RNA污染。

实验步骤1、100ml细菌过夜培养液，5000rpm离心10分钟，去上清液。

2、加TE悬浮沉淀，并加10%S0S，50ul20mg/ml（或1mg干粉）蛋白酶K，混匀，37℃保温1小时。