循环肿瘤细胞在肺癌诊断及预后中的应用
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通讯作者： 钟 理。E-mail： lee_z@ yahoo． com
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J Diag Pathol，February 2015，Vol． 22，No． 2
EpCAM 的肿瘤细胞，无法富集。最近，抗 CD146 抗 体用于 EpCAM 阴性 CTCs 的检测，同样能检测出预 后差的 EpCAM 阴性的肿瘤患者［13］。 2. 1. 3 CTC-Chip 第一代 CTC 芯片的基础是微流 体学。在一张规格与标准载玻片相同的硅片上覆盖 8 万个显微位点，每个位点都包埋了能够捕获 CTC 的抗体。当 血 样 流 过 微 流 芯 片 时，这 些 位 点 捕 获 CTC。该设 计 造 价 高，且 与 抗 体 覆 盖 位 点 接 触 的 CTC 数量很大程度上取决于显微位点周围的血流通 畅性。Nagrath 等［21］发现，CTC-chip 比 CellSearchTM系 统分离纯度高 100 倍，利于分子生物学方面的检测。 第二代微涡字形芯片（ HB-chip） 为使样品流体迅速 充分混合，设计了一种小室流动槽，明显提高了捕获 CTCs 的数量。将微芯片装在载玻片上，增加血样的 处理量，提高了 CTCs 的捕获率。利用标准的病理 检测方法进行鉴别，提高了捕获稀有 CTCs 的能力 及检测结果的准确性。但由于仍局限于用 EpCAM 筛选 CTCs，可能会出现假阳性［22］。 2. 1. 4 流式细胞分析 原理是利用荧光抗体结合 CTCs，使 CTCs 染色，然后用流式细胞仪分析，将着 色细胞视为阳性，检出率为 1 /105 。其优点是测量 速度快，可对 CTCs 定量计数，能测定细胞形态，并 对同一细胞做各种特性的多参数分析。缺点是流 式细胞术检测癌细胞的价值主要依靠可分析的细 胞总数量，其敏感性较低。大约需要 50 ml 的外周 血才能 检 测 瘤 负 荷，要 提 高 其 检 测 CTCs 的 敏 感 性，需采用 免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 技 术 进 行 富 集［16］。 近年 来，Georgakoudi 等［17］ 发 明 了 活 体 流 式 细 胞 仪，这是一种 结 合 了 活 体 高 速 实 时 影 像 法 和 体 外 流式细胞仪 的 一 种 新 型 生 物 医 学 光 学 仪 器，可 实 时检测活 体 CTCs 水 平。此 法 主 要 的 特 点 是 无 需 抽血，属微创诊断法。 2. 1. 5 酶 联 免 疫 斑 点 法 （ enzyme-linked epithelial immunospot assay，ELISPOT） 该方案对分离得到 的 CTCs 进行 24 ～ 48 h 短期培养，在此过程中 CTCs 会产生一些与侵袭、转移、脱落相关的蛋白质，蛋白 质与包埋在培养皿底部的荧光抗体结合，通过检测 荧光间接检测出 CTCs，用免疫磁珠分选去除 CD45 阳性细胞，富集得到肿瘤转移相关蛋白（ CXCＲ4） 阳 性细 胞［18］，进 一 步 检 测 分 泌 特 异 性 蛋 白 的 CTCs。 现在 EPISPOT 方案已应用于临床外周血和骨髓来 源的 CTCs 检测［19，20］。 2. 1. 6 反转录聚合酶链反应（ reverse-transcriptase
2 肺癌 CTCs 的检测方法 2. 1 基于先免疫后富集检测方法 以免疫磁珠分 离法进行富集。血液中 CTCs 的数量极少（ 1 /109 ） ， 为了使检测的灵敏性达到临床可接受的水平，必需 对其先进行富集。免疫磁珠分离法是最常用的 CTC 富集技术，原理是用单克隆抗体包被磁珠，抗体与上 皮细胞标记物（ 如 EpCAM） 结合富集 CTCs［9，10］。采 用阴性富集的方法能将富集效率提高 1 × 103 ～ 1 ×
PCＲ，ＲT-PCＲ） 该方法检测 CTCs 的原理是，肺癌 中特异性 mＲNA 表达。由于 ＲT-PCＲ 法检测肿瘤特 异性分子具有高度的敏感性（ 每 106 － 107 个血细胞 中能检测出 1 ～ 10 个肿瘤细胞） ，较免疫组化灵敏 至少 100 倍。因此，ＲT-PCＲ 是最常用于检测 CTCs 的方法［12］。其缺点在 于 选 择 合 适 的 目 标 基 因 比 较 困难，样本污染容易造成结果假阳性，检测时需要裂 解细胞，限制了 CTCs 的下一步使用。而且由于 ＲTPCＲ 检测 CTCs 特异性不高，该法应用于临床诊断 的价值受到很大限制。为解决这些问题，产生了定 量反转录聚合酶链反应（ QPCＲ） 、荧光定量反转录 聚合 酶 链 反 应 （ FQ-PCＲ ） 等 新 技 术。 有 研 究 表 明［13］，免疫磁珠结合 ＲT-PCＲ 技术检测 CTCs，能克 服单独使用 ＲT-PCＲ 技术时存在假阳性和假阴性的 缺点。 2. 2 基于过滤作用的检测方法 ISET（ Isolation by size of epithelial tumor cells） 法基于 CTCs 与血细胞 大小和可变形性的不同进行分离。通过过滤作用可 以将 CTCs（ ＞ 8 μm） 与血细胞分开［23 － 26］。用该法 已成功地在非小细胞肺癌患者的外周血中检测到了 CTCs［27］。ISET 使用简单又廉价的聚碳酸酯过滤器 富集 CTCs，可以将间质细胞等失去上皮细胞特征的 CTCs 分离出来。据报道，在临床试验中 ISET 法对 转移性 肺 癌 CTC 检 测 的 灵 敏 度 已 经 高 于 传 统 的 EpCAM CellSearchTM 系统［26 － 28］。 2. 3 联合检测 在肿瘤的转移潜能从上皮—间质 过渡的过程中，各种上皮细胞标记物 （ 如 EpCAM） 下调以增加肿瘤细胞的侵袭性，CellSearchTM 系统等 以免疫磁珠分离为原理的检测技术，会由于 EpCAM 表达的减少使检测到的 CTCs 比实际数目少［26 ， － 28］ 因此基于抗原抗体反应的 CTCs 检测技术 难 以 稳 定、准 确 地 分 离 肺 癌 所 有 分 期 的 CTCs，结 合 使 用 ISET 法能弥补 CellSearchTM系统的不足。
诊断病理学杂志 2015 年 2 月第 22 卷第 2 期
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方法 免疫细胞化学法 CellSearch TM 系统 CTC-Chip 流式细胞分析 酶联免疫斑点法 反转录聚合酶链反应 ISET
表 1 肺癌 CTCs 检测方法的优点和局限性
优点 定性循环肿瘤细胞，定量瘤负荷 稳定可靠，实现了自动化和标准化 分离纯度极高，利于分子生物学方面的检测 实时检测活体，微创 敏感性极高 具有高度的敏感性 简单廉价，敏感性高
104 倍［11］。该法通过去除无关细胞，使 CTC 得到纯 化。阴性富集一般选择结合 CD45 抗体的磁珠，这 样可去除血液中大多数白细胞。该法特异性高且不 影响细胞活性，能高效地从外周血细胞中筛选出肿 瘤细胞。 2. 1. 1 免 疫 细 胞 化 学 法 （ immunocytochemistry， ICC） 其原理是将抗体用显色剂（ 如荧光素、酶、同 位素等） 标记，与特异性肿瘤标记物（ 包括上皮细胞 膜特异性抗原、上皮细胞角蛋白 CK 等） 结合，显色 的则为肿瘤细胞。该法不仅可以定性循环肿瘤细 胞，还定量瘤负荷。通过分析，可以对癌症患者进 行个性化治疗。该法的优点是能进行形态学分析， 缺点是检测的细胞量少，敏感性不高，约 1 /105 ～ 10 6［14］。因此，单 一 的 免 疫 细 胞 化 学 法 对 循 环 肿 瘤 细胞的检测没法达到临床的需要，需要结合其他方 法（ 如免疫磁珠技术） 共同检测。 2. 1. 2 CellSearch TM系统 是惟一被美国食品和 药物管理局（ FDA） 批准应用于临床检测患者外周 血中 CTCs［15］的方法，是目前国际上最为稳定和可 靠 的 CTC 检 测 系 统。 CellSearchTM 系 统 主 要 由 AutoPrep 系统 和 Analyzer 系 统 组 成。前 者 处 理 血 样，后者扫描和分析样本。AutoPrep 系统能够实现 复杂样本处理流程的自动化和标准化。Analyzer 系 统是一种荧光光学系统，可对经过免疫磁性分选式 呈现 备 选 的 荧 光 检 测 图 像，最 终 将 细 胞 CD45 － 、 CK + EpCAM + 、细胞直径大、细胞核形状不规则、呈 颗粒或点状不均一染色、核仁大或多个核仁改变者 认定为 CTCs。该 方 法 的 缺 点 是 低 表 达 或 不 表 达
首先用 ISET 法，基于 CTCs 与血细胞物理特性 的差异，分离出 CTCs，以提高检测的敏感性［23］； 然 后用 CellsearchTM系统（ 基于免疫磁珠分离的方法） ， 通过与上皮细胞黏附因子结合富集 CTCs［9，10］，以提 高检测的特异性； 最后将两种方法分离富集的 CTCs 计数后，用免疫组化的方法加以评定，以排除假阳性 的干扰，使检测结果更为准确。免疫组化常用的标 记物为细胞角蛋白、Ki-67 等［34］。这样联合检测确 定的 CTCs 数目，可作为肺癌诊断和预后评估的一 个有效的独立标记物（ 表 1） 。
1 肺癌循环肿瘤细胞概述 循环肿瘤细胞（ circulating tumor cells，CTCs） 定
义为转移性癌症患者外周血中存在的与原发肿瘤类 似的 细 胞［7］，由 Ashworth 于 1896 年 首 次 发 现［8］。 这些 转 移 的 CTC 与 原 发 灶 的 肿 瘤 细 胞 相 似，故 CTCs 可以代表原发灶，作为“液态活检标本”实时、 无创地评估病情，制定相应的治疗方案。
肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一［1］， 其发病率 和 死 亡 率 呈 逐 年 上 升 趋 势［2］。 肺 癌 的 传 统诊断主要依赖于常规病理组织学检查和影像学手 段（ X 线片、CT、B 超等） 。影像学的方法只能发现 直径≥1 cm（ 约 1 g，109 个癌细胞） 的结节，而存在 于循环血液中的癌细胞和其他器官中的微小转移灶 则不能检测。由于诊断手段的限制，肺癌的 5 年生 存率不容乐观（ 仅为 15% ） ［3，4］，大多数患者确诊时 已发展到 中、晚 期，有 创 检 查 则 会 造 成 伤 害［5］。 如 果肺癌在发生早期就能诊断并完全切除，5 年生存 率将会提高到 67%［6］。因此，亟需一种实时、有效、 无创的检测手段，进行肺癌的早期诊断和预后评估。
