作物种子DNA的提取及分子标记分析_葛建鎔

一种适用于高通量基因分型的水稻种子切片DNA制备技术作者：林旻杨绍华林艳王月胡太蛟宋亚娜潘雷博陈在杰来源：《福建农业科技》2023年第10期摘要：建立一種高质量、低成本的水稻种子切片DNA制备方法，用于育种群体的高通量基因分型。

通过对比TPS法提取水稻叶片DNA及96孔板结合磁珠法提取切片种子DNA的纯度和浓度，进一步采用STARP（Semi-thermal asymmetric PCR）标记检测验证96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA的质量。

结果表明：96孔板结合磁珠法提取水稻种子切片的DNA质量和纯度优于TPS法提取水稻叶片的DNA质量；STARP标记检测验证结果显示96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA可适用于GS3、Wx的STARP标记基因分型，其鉴定结果与测序结果一致。

研究显示96孔板结合磁珠法可以从微量水稻种子切片中提出高回收率、高纯度、高完整度、无PCR抑制物的DNA用于高通量STATP法基因单倍型分析，可获得一种96孔板结合磁珠法提取DNA的高通量基因分型操作流程。

关键词：水稻种子切片；96孔板结合磁珠法；高通量基因分型；STARP技术中图分类号：S 511 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2023）10-0040-08DOI： 10.13651/ki.fjnykj.2023.10.007Preparation Technique of DNA Extracted from the Slices of Rice Seeds Suitablefor the High-throughput GenotypingLIN Min1， YANG Shao-hua1， LIN Yan1， WANG Yue1， HU Tai-jiao1，SONG Ya-na1， PAN Lei-bo2， CHEN Zai-jie1*（1. Institute of Biotechnology， Fujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Key Laboratory ofAgricultural Genetic Engineering， Fuzhou， Fujian 350003， China; 2. College of Life Sciences，Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）Abstract： The preparation method of DNA with high quality and low cost extracted from the slices of rice seeds was established for the high-throughput genotyping of breeding populations. The degree of purity and concentration of DNA extracted from the leaves of rice by TPS method and those of DNA extracted from the slices of rice seeds by using the method of 96-well plates combined with magnetic beads were compared in this paper. Then， the quality of DNA extracted from the slices of rice seeds by using the method of 96-well plates combined with magnetic beads was further verified by STARP （Semi-thermal asymmetric PCR） marker detection. The results showed that the quality and the degree of purity of DNA extracted from the slices of rice seeds by using the method of 96-well plates combined with magnetic beads were better than those of DNA extracted from the leaves of rice by TPS method. The verification results of STARP marker detection showed that the method of 96-well plates combined with magnetic beads to extract the DNA from the slices of rice seeds could be applied to the STARP marker genotyping of GS3 and Wx， and the identification results were consistent with the sequencing results. The results showed that the method of 96-well plates combined with magnetic beads could be used to extract the DNA with high recovery rate， high purity， high integrity and no PCR inhibitors from the trace slices of rice seeds for the analysis of gene haplotype with the high-throughput STATP method. Therefore， the operation flow of high-throughput genotyping for the DNA extraction by using the method of 96-well plates combined with magnetic beads could be obtained.Key words： Slices of rice seeds； Method of 96-well plates combined with magnetic beads；High-throughput genotyping； STARP （Semi-thermal asymmetric PCR） technology得益于生物信息學、基因组学、表型组学、芯片技术等发展，水稻迎来了智能育种4.0时代。

河南农业2023年第10期
二、芥菜DNA 分子标记研究
分子标记法作为对遗传多样性进行检测的主要方法，可为研究人员提供与DNA 水平相关的信息，进而确定各种质实际进化水平、亲缘关系。

（一）遗传多样性
芥菜遗传育种的关键是遗传多样性与芥菜遗传情况、实际价值密切相关。

近几年，具有分布广、稳定和高效等优点的分子标记，在分析植物品种、种属关系的领域大放异彩。

早在2008年，林碧英等学者便利用PARD 引物展开了研究，指出将遗传距离控制在0.38 cM 左右时，既有笋子芥可以聚集成4类。

2014—2019年，国内学者数次利用分子标记法对芥菜进行研究，并得出了以下结论：首先，遗传相似系数达到0.584时，芥菜可被分成5类，这说明芥菜拥有丰富的遗传多样性。

其
对常见芥菜种质进行了扩增，分析结果表明，不同种质芥菜可以食用的部分通常分属于不同发育群，这表示其遗传背景、地理来源均有所不同，芥菜具有遗传多样化的特点。

2019年，以张东锁为首的国内学者，先后利用SRAP、ISJ 及SSR 法，对随机选取的100份材料进行研究，发现所选取材料类型和来源完全一致。

由此可见，芥菜类型、来源均会影响其遗传背景。

三、结论
通过分析可知，现有芥菜品种多采用常规育种法培育，先进技术的使用频率相对较低。

未来，有关人员应对芥菜基因组学进行更加深入的研究，将基因编辑与资源创新相结合，真正做到在压缩品种选育时间的前提下，使市场提出的多元化需求得到最大程度的满足。

（责任编辑 程丽红）
LIANGZHONG LIANGFA
良种良法
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收稿日期:2017-07-24基金项目:上海市科技兴农项目[沪农科攻字(2012)第2-1号㊁沪农科种字(2015)第4号㊁沪农科种字(2015)第5号]作者简介:姚丹青(1984 ),女,硕士,农艺师,研究方向:分子植物育种和种子质量检验㊂E-mail:ydq_726@ ㊀∗通信作者,E-mail:1256140879@上海农业学报㊀2018,34(4):11-15Acta Agriculturae ShanghaiDOI:10.15955∕j.issn1000-3924.2018.04.03文章编号:1000-3924(2018)04-011-05上海地区玉米品种DNA 指纹图谱采集及数据分析姚丹青1,楼坚锋1,顾芹芹1,刘㊀建1,张㊀琪2,夏建明1∗(1上海市种子管理总站,上海201103;2上海交通大学农业与生物学院,上海200240)摘㊀要:基于毛细管电泳检测平台,利用筛选的25对玉米SSR 引物,采集了上海地区32个玉米品种的DNA 指纹图谱,并运用UPGMA 法进行遗传多样性分析㊂结果表明:32个玉米品种的遗传相似系数在0.4600.900;相似系数为0.53时,可将32个玉米品种分为三大类群㊂该研究可为当地玉米种子市场的品种管理提供一种快速㊁有效的鉴定方法㊂关键词:DNA 指纹图谱;SSR;分子标记;玉米品种中图分类号:S513.023㊀㊀文献标识码:ADNA fingerprints collection and data analysis of maize varietiesin ShanghaiYAO Dan-qing 1,LOU Jian-feng 1,GU Qin-qin 1,LIU Jian 1,ZHANG Qi 2,XIA Jian-ming 1∗(1Shanghai Seed Management Station ,Shanghai 201103,China ;2School of Agriculture &Biology ,Shanghai Jiao Tong University ,Shanghai 200240,China )Abstract :Based on the capillary electrophoresis testing platform,25pairs of maize SSR primers were screened and the DNA fingerprints of 32maize varieties in Shanghai were collected,and the genetic diversity was analyzed by UPGMA method.The results showed that the genetic similarity coefficient of the 32maize varieties was 0.460 0.900,when the similarity coefficient was 0.53,32maize varieties could be divided into 3groups.This study could provide an rapid and effective identification method for the variety management of local maize seed market.Key words :DNA fingerprint;SSR;Molecular marker;Maize variety简单序列重复(Simple sequence repeat,SSR)标记是建立在PCR(Polymerase chain reaction)反应基础之上的一种遗传标记,相比其他常用技术具有稳定性好㊁准确性高等优点,已经被广泛运用于农作物品种鉴定中㊂辛景树[1]从DNA 快速提取㊁引物筛选等技术环节进行系统研究,建立了完整的SSR 技术体系,制作了国内192个玉米主推品种及亲本的DNA 指纹图谱,并开展了玉米种子纯度与品种真实性鉴定的推广应用㊂随着社会经济的发展,鲜食玉米如糯玉米㊁甜玉米等的遗传改良及新品种选育工作得到高度重视,新品种不断涌现,种子市场异常活跃㊂近年来,鲜食玉米遗传育种及生产应用发展迅速,但分子标记技术在种质鉴定中的应用与普通玉米相比仍显落后㊂本试验利用DNA 指纹图谱技术,通过选用一系列鲜食玉米SSR 引物,对上海地区的32个鲜食玉米品种进行指纹标记,以期为当地玉米种子市场的品种管理提供一种快速㊁有效的鉴定方法㊂1　材料与方法1.1㊀试验材料选用上海市2013年㊁2014年和2015年审定和生产上应用的鲜食玉米品种,共计32份(表1)㊂21姚丹青,等:上海地区玉米品种DNA指纹图谱采集及数据分析表1㊀上海市鲜食玉米品种材料及来源Table1㊀The materials and sources of32maize varieties in Shanghai序号品种来源序号品种来源1 金银898 沪农品审玉米2014第005号17 苏玉糯6号 国审玉20030672 蜜脆王 2014年上海市玉米区试试验品种18 天贵糯162 桂审玉2016027号3 苏玉糯102 沪农品审玉米2006第002号19 苏科糯3号 苏审玉2010064 彩糯二号 沪农品审玉米2005第005号20 荆恒一号 2014年上海市玉米区试试验品种5 金银818 沪农品审玉米2004第007号21 苏珍甜糯5号 2014年上海市玉米区试试验品种6 天彩二号 沪农品审玉米2008第008号22 沪五彩花甜糯1号 沪农品审玉米2014第002号7 佳糯26 沪农品审玉米2013第006号23 连玉糯1号 沪审玉20150058 万彩糯3号 沪农品审玉米2013第007号24 华耘白甜糯601 沪审玉20150029 沪玉糯5号 沪农品审玉米2013第001号25 沪甜1301 沪审玉201501010 申科糯1号 沪农品审玉米2013第002号26 先甜5号 沪审玉201501211 申科甜1号 沪农品审玉米2013第008号27 圣甜1号 沪审玉201500812 苏珍花糯2012 沪农品审玉米2013第005号28 先甜90号 沪审玉201501313 申糯6号 沪农品审玉米2012第004号29 沪甜1号 沪审玉201501114 华耘202 沪农品审玉米2011第004号30 金银208 沪审玉201500915 天糯一号 沪农品审玉米2007第001号31 华耘301 沪审玉201501416 华耘黑糯501 沪农品审玉米2013第003号32 金珠甜脆 沪审玉20150071.2㊀DNA提取和SSR引物筛选所有试验材料均采集幼苗或叶片,使用北京天根生化公司植物新型基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取,并在1.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳,检测DNA质量,电泳缓冲液为1ˑTAE,电压100V; DNA纯度和浓度利用NanoDrop2000c紫外可见光谱仪(Thermo公司)进行测定,稀释至50ng∕μL的工作液备用,4ħ冰箱储藏㊂SSR引物来源于2个方面:参考国内外发表的文献,选择具有多态性的引物;自行设计,根据数据库提供的SSR位点序列,利用引物设计软件PRIMER5.0设计㊂初步确定40对引物用于初筛分析㊂所有引物由上海生工有限公司合成㊂PCR反应体系:HotStart Mix2ˑ10μL,Coralload10ˑ2μL,上下游引物各0.6μL,50ng∕μL模板1μL,ddH2O5.8μL,总体积为20μL㊂PCR反应程序:94ħ预变性5min;94ħ变性40s,55 60ħ退火35s,72ħ延伸45s,36个循环;72ħ延伸10min,扩增产物4ħ保存㊂1.3㊀DNA指纹图谱的采集及数据分析所有数据分析基于QIAxcel ScreenGel1.4版软件,通过软件系统自动对指纹的原始数据进行分析,确定每个位点的等位基因㊂采用NTSYS-pcv2.11软件进行聚类分析,构建分子系统树㊂2㊀结果与分析2.1㊀引物初筛取表型差异较大的20个玉米品种作为引物初筛材料,对扩增产物进行电泳分析,根据电泳谱带分析结果(图1),筛选出具有一定多态性㊁扩增容易㊁扩增带型清晰且稳定的引物进行复筛㊂2.2㊀引物复筛以收集的所有玉米品种为材料,采用毛细管电泳系统对扩增产物进行检测分析㊂一是分析产物的峰型,淘汰一些连续多峰且主峰不稳定㊁高低峰不明㊁杂峰多等不容易分析的引物,保留较好峰形的引物(图2);二是统计每个位点等位基因数,并根据等位基因的频率计算位点的多态性信息含量(PIC),保留PIC 大于0.5的引物;三是考虑引物染色体均匀分布,确保每条染色体上有1个位点㊂品种鉴定引物组合须满足3个要求:鉴别能力强(满足海量品种的鉴别),数量适宜(经济方便),染色体分布均匀(不连锁)㊂按照候选引物的PIC值以及所在的染色体进行排序,取每个染色体上PIC最高的引物作为组合基数,通过遗传聚类分析组合的鉴别能力,将收集的品种进行有效区分,最终确定适合玉米品种鉴定的候选引物25对(表2)㊂上㊀海㊀农㊀业㊀学㊀报1.00.80.60.40.20峰值大小/b p600400250150752550030020010050150.90.70.50.30.1相对移动时间/m i n图1㊀利用毛细管电泳系统检测引物多态性Fig.1㊀Detection of primer polymorphism by capillary electrophoresis2468绝对迁移时间/m i n0.270.220.170.120.070.02-0.03相对荧光单位15b p235b p600b p1012图2㊀复筛引物P15的峰型和等位基因分析Fig.2㊀Peak type and allele analysis of rescreened primer P15表2㊀适合玉米品种鉴定的候选引物的确定Table 2㊀Determination of candidate primers suitable for identification of maize varieties序号编号引物名称染色体位置片段大小∕bp 引物序列1P02umc1335y5 1.06238 246上游:CCTCGTTACGGTTACGCTGCTG 下游:GATGACCCCGCTTACTTCGTTTATG 2P03umc2007y4 2.04250 273上游:TTACACAACGCAACACGAGGC 下游:GCTATAGGCCGTAGCTTGGTAGACAC 3P05umc2105k3 3.00297 342上游:GAAGGGCAATGAATAGAGCCATGAG 下游:ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCG 4P10bnlg2305k4 5.07262 279上游:CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG 下游:CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTG 5P14umc1125y37.04156 180上游:GGATGATGGCGAGGATGATGTC 下游:CCACCAACCCATACCCATACCAG 6P15bnlg240k18.06221 243上游:GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC 下游:GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATAC 7P16phi080k158.08216 235上游:TGAACCACCCGATGCAACTTG 下游:TTGATGGGCACGATCTCGTAGTC 8P17phi065k99.03400 419上游:CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCC 下游:GGACCCAGACCAGGTTCCACC9P18umc1492y139.04260 303上游:GCGGAAGAGTAGTCGTAGGGCTAGTGTAG 下游:AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGG 10P19umc1432y610.02222 242上游:GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATC 下游:GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGC 11P20umc1506k1210.05171 193上游:GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG 下游:TTCAGTCGAGCGCCCAACAC 12P21umc1147y4 1.07151 170上游:AAGAACAGGACTACATGAGGTGCGATAC 下游:GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGC 13P22bnlg1671y17 1.10179 200上游:CCCGACACCTGAGTTGACCTG 下游:CTGGAGGGTGAAACAAGAGCAATG 14P23phi96100y1 2.00263 289上游:TTTTGCACGAGCCATCGTATAACG 下游:CCATCTGCTGATCCGAATACCC 15P26umc1489y3 3.07239 262上游:GCTACCCGCAACCAAGAACTCTTC 下游:GCCTACTCTTGCCGTTTTACTCCTGT 16P27bnlg490y4 4.04280 338上游:GGTGTTGGAGTCGCTGGGAAAG 下游:TTCTCAGCCAGTGCCAGCTCTTATTA 17P28umc1999y3 4.09179 201上游:GGCCACGTTATTGCTCATTTGC 下游:GCAACAACAAATGGGATCTCCG 18P29umc2115k3 5.02247 296上游:GCACTGGCAACTGTACCCATCG 下游:GGGTTTCACCAACGGGGATAGG 19P30umc1429y7 5.03129 131上游:CTTCTCCTCGGCATCATCCAAAC 下游:GGTGGCCCTGTTAATCCTCATCTG 20P31bnlg249k2 6.01266 295上游:GGCAACGGCAATAATCCACAAG 下游:CATCGGCGTTGATTTCGTCAG 21P33umc2160k37.01216 262上游:TCATTCCCAGAGTGCCTTAACACTG 下游:CTGTGCTCGTGCTTCTCTCTGAGTATT 22P34umc1936k47.03163 194上游:GCTTGAGGCGGTTGAGGTATGAG 下游:TGCACAGAATAAACATAGGTAGGTCAGGTC 23P38umc1231k49.05267 284上游:ACAGAGGAACGACGGGACCAAT 下游:GGCACTCAGCAAAGAGCCAAATTC 24P39phi041y610.00301 316上游:CAGCGCCGCAAACTTGGTT 下游:TGGACGCGAACCAGAAACAGAC 25P40umc2163w310.04303 350上游:CAAGCGGGAATCTGAATCTTTGTTC 下游:CTTCGTACCATCTTCCCTACTTCATTGC31姚丹青,等:上海地区玉米品种DNA 指纹图谱采集及数据分析2.3㊀DNA 数字指纹建立以多态性高㊁重复性好㊁带型易区分统计的原则[2],确定了25对核心引物,将SSR-PCR 扩增产物特征谱带进行0㊁1数字化,建立数据库㊂表3㊀上海地区32个玉米品种DNA 指纹数据Table 3㊀DNA fingerprintdata of 32maize varieties in Shanghai序号品种引物编号P02P03P05P10P14P15P16P17P18P19P20P21P22P23P26P27P28P29P30P31P33P34P38P39P401 金银898 00100011110101000101001002 蜜脆王 00100011110101100101000103 苏玉糯102 00101111001101101101000004 彩糯二号 01010110101001100101001005 金银818 01111110000001001101000106 天彩二号 01100010001001000001000007 佳糯26 10010110101001111101101018 万彩糯3号 11001110010101111111111119 沪玉糯5号 011000101101111111111111010 申科糯1号 111001101000010110010101011 申科甜1号 111111110111111111111101112 苏珍花糯2012 111111101111111011011001013 申糯6号 100000111010010101011111014 华耘202 000000100000011101010001115 天糯一号 110001100000000101010100016 华耕黑糯501 110001101100010110001101017 苏玉糯6号 111111011101011111110101118 天贵糯162 100011010100000010001111119 苏科糯3号 10011111110011111011101020 荆恒一号 11011111010001011011101021 苏珍甜糯5号 110111110110000001011100022 沪五彩花甜糯1号 000111100110011101011111023 连玉糯1号 100010111100011001010111024 华耘白甜糯601 100111111110011111111111025 沪甜1301 100110101110011111111101126 先甜5号 111011001111111111111101027 圣甜1号 00001011011001100111100128 先甜90号 000010100100011111111101129 沪甜1号 000111011110011111111100030 金银208 000010000100000000000000031 华耘301 000011111011011001011100032金珠甜脆00001001010010111111101112331132347561481117122691924252922272832101615202118301230.460.570.680.790.90C o i f f i c i e n t图3㊀32个玉米品种25对引物组合的遗传聚类图Fig.3㊀Clustering map of 25markers on 32maize varieties2.4㊀遗传多样性分析根据25对SSR 引物的扩增结果进行遗传多样性分析,32个玉米品种的相似系数为0.460 0.900,在遗传相似系数为0.53时,可将32个玉米品种分为三大类群(图3)㊂其中,8( 万彩糯3号 )㊁12( 苏珍4151上㊀海㊀农㊀业㊀学㊀报花糯2012 )㊁19( 苏科糯3号 )㊁21( 苏珍甜糯5号 )㊁22( 沪五彩花甜糯 )聚类到第2类群,籽粒颜色都为花色相间㊂在遗传相似系数为0.64时,可将第2聚类群分为3组,第2组中的25( 沪甜1301 )㊁26( 先甜5号 )㊁27( 圣甜1号 )㊁28( 先甜90 )㊁29( 沪甜1号 )㊁32( 金珠甜脆 )均为黄色籽粒㊁穗轴白色㊁花丝绿色;第3组中的10( 申科糯1号 )㊁16( 华耘黑糯501 )㊁15( 天糯一号 )㊁20( 荆恒一号 )㊁21( 苏珍甜糯5号 )均为糯玉米㊂3㊀讨论主要农作物品种审定登记制度实施以来,审定品种的数量呈逐年增多趋势,截至2013年底,玉米审定品种数量达到6291个[3],给品种高效管理带来了挑战;随着玉米品种资源遗传基础日趋狭窄及少数骨干亲本被集中应用,出现了一批在原品种基础上仅做细微改良的派生品种,对品种鉴定技术提出了更高的要求;市场上出现标签名称与实际包装的种子不符等品种真实性问题,增加了种子市场监管的难度[4]㊂目前,SSR标记技术在玉米㊁水稻等农作物中已有广泛运用㊂李新海等[5]利用SSR标记研究了21个玉米自交系的遗传变异㊂刘杰等[6]采用SSR标记和杂种优势聚类方法分析了中国15个玉米自交系的遗传变异,初步对杂种优势类群进行划分;刘世建等[7]对四川地方玉米种质资源进行SSR聚类分析,研究了28个玉米自交系的遗传变异㊂乔志军等[8]对180份玉米自交系亲缘关系进行了分子评价㊂传统育种多由表现型间接对基因型进行选择和分类,存在很大的随机性和盲目性㊂分子标记技术的发展为评价玉米种质资源基础及杂种优势利用提供了新技术和手段,同时也为构建玉米品种指纹数据库提供了良好的基础㊂本研究选定2013年㊁2014年和2015年上海审定和生产应用的主要鲜食玉米品种,基于标准化的建库程序和毛细管电泳检测平台的运用,利用SSR标记技术进行指纹图谱采集,经过对引物初筛,最终选用了25对玉米SSR引物对32个玉米品种进行了指纹数据分析,并构建了DNA指纹图谱数据库,为当地玉米品种㊁真实性鉴定奠定了快速检测的基础,为政府的品种管理㊁企业的品种维权㊁农民的利益维护提供强有力的技术支撑,有利于保护新品种知识产权和生产者利益,促进鲜食玉米研究及种子市场的健康发展㊂参㊀考㊀文㊀献[1]辛景树.杂交一米品种DNA指纹图谱[M].北京:中国农业科学技术出版社,2004.[2]王凤格,赵久然,郭景伦.中国玉米新品种标准DNA指纹库构建研究的几点思考[J].植物学通报,2005,22(1):121-128.[3]杨扬,王凤格,赵久然,等.中国玉米品种审定现状分析[J].中国农业科学,2014,47(22):4360-4370.[4]赵久然,王凤格,易红梅,等.我国玉米品种标准DNA指纹图谱构建及应用进展[J].作物杂志,2015(2):1-6.[5]李新海,傅骏骅,张世煌,等.利用SSR标记研究玉米自交系的遗传变异[J].中国农业科学,2000,33(2):1-9.[6]刘杰,陈刚.SSR标记用于玉米自交系遗传变异与优势类群划分的研究[J].西北植物学报,2002,22(4):741-750.[7]刘世建,荣廷昭,杨俊品,等.四川玉米地方种质的SSR聚类分析[J].作物学报,2004,30(3):221-226.[8]乔志军,刘龙龙,南晓洁,等.180份玉米自交系亲缘关系的分子评价[J].植物遗传资源学报,2011,12(2):211-215.(责任编辑:闫其涛)。

分子标记技术在植物学研究中的应用辛业芸【期刊名称】《湖南农业科学》【年(卷),期】2002(000)004【摘要】分子标记与形态标记、细胞学标记和生化标记三类遗传标记技术相比,具有因直接以DNA的形式表现而在植物的任何生长阶段都可检测、遍布整个基因组、多态性高、检测手段简单迅速、无基因多效性、能够明确辨别等位基因、实验重复性好等优点.目前最常用的分子标记技术主要有限制性片段长度多态性技术(restriction fragment length polymor-phism,简称RFLP)、随机扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphic DNA,简称RAPD),微卫星DNA技术(Simple Sequence Repeat,简称SSR)、扩增片段长度多态性技术(Amplified Fragment Length Poymorphism,简称AFLP)等.分子标记技术在植物学研究中得到了广泛的应用,在植物分类学及遗传多样性、种质资源保护、遗传图谱的建立、基因定位与辅助选择育种、指纹图谱应用于作物品种鉴定等研究方面均取得较好的应用效果.这项技术的发展具有巨大的应用潜力和广阔的应用前景.【总页数】4页(P9-12)【作者】辛业芸【作者单位】国家杂交水稻工程技术研究中心,湖南长沙,410125【正文语种】中文【中图分类】S184:S188.1【相关文献】1.AFLP分子标记技术的新进展及其在法医植物学中的应用 [J], 李成涛;李莉2.DNA分子标记技术在法医植物学中的应用 [J], 张娴;李婧琳;张翔宇3.试论DNA分子标记技术在植物学科上的研究进展与应用前景 [J], 庄丽;彭子模;穆培源4.rDNA ITS区序列分子标记技术在植物学研究中的应用 [J], 牛宪立;姬可平;吴群;吕国庆5.分子标记技术在灵长类繁殖行为研究中的应用——应用 [J], 张树义;王晓燕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

文章编号!!""#$"%"&’(""#)"($""!&$"(适用于!!"分子标记的玉米单粒种子#$%快速提取新方法郭景伦!赵久然!王凤格’北京市农林科学院玉米研究中心"北京!"""*%)摘要!研究了玉米单粒种子+,-的提取新方法"利用该方法提取+,-"液氮#研磨#离心#沉淀#.+.#/0-1及氯仿都不用"一个工作人员提取!""粒种子’!个检测样品2+,-只需3"456左右"一天可以提取!&""粒种子7!&个检测样品2的+,-"并且提取的+,-分子量大"不降解"完全可以满足利用..8分子标记进行+,-指纹分析的需要"为+,-指纹技术在玉米种子纯度及真伪快速鉴定中的广泛应用解决了关键性技术难题$关键词!玉米%单粒种子%+,-提取%..8分子标记中图分类号!.#!39"3#93文献标识码!-%&’(")*+,#&%-./0)1/+234’/52,60274)+8’!+39:’;0<!’’,!=+/)>:’620!!"?3):<@+@:;<=56>$?@6A BC-<=5@$DE6A F-,:GH6>$>H7!"#$%&%’%"()*+%,-%(./%#0#,12)"3%456721(#)89-8("9",3:6(%’-(5;)#%,)%’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’<(20,@J[E5SH\+DU THHM\+,-HNODEPO5Q6\..8E6E?UT5T+,-指纹技术的诞生"对于玉米种子纯度和真伪鉴定来说"是一场技术革命"解决了过去一些玉米品种利用同工酶和蛋白质电泳技术无法进行纯度鉴定的难题$然而+,-指纹技术能否得到普及和推广"+,-快速提取技术是关键"因此国内外学者一直没有停止对+,-快速提取方法的研究$但是目前应用的方法提取时间仍然偏长"不能适应玉米种子纯度快速鉴定的需要$因此"本文尝试研究出一种新的玉米单粒种子+,-提取方法"不仅能进一步提高+,-的提取速度"而且提取的+,-又能完全满足..8分子标记的需要"解决+,-指纹技术在玉米种子纯度快速鉴定中应用存在的关键性技术难题$收稿日期!(""]$!!$!"作者简介!郭景伦’!%&*$2"男"山东苍山人"硕士"副研究员"主要从事分子标记辅助玉米遗传育种科研工作$0H?!"!"$#!#"3##*^$4E5?!>_?&‘!"!*a!(&9PQ4!材料与方法7!2实验材料$京科!#种子!"粒"母本%*#3种子#粒"父本1-种子#粒$7(2+,-提取$将每一粒干种子的胚取下"分别放入%&孔深孔板中"每孔加入!#"!b提取液7"9![ ,E<C""9!c溴酚蓝2"盖上封口膜"沸水加热#456"然后每孔分别加入!#"!b0^缓冲液7LC(9"2"放在]d冰箱保存备用$利用!9"e琼脂糖凝胶电泳"溴乙锭染色"紫外灯下观察照相"检测+,-质量$732引物$本试验采用的..8引物由上海生工合成$7]2..8反应体系$("!b反应液中包括!!"44Q?f b0D5T$C/?"#"44Q?f b g/?""9""!e:H?EO56"(9#44Q?f b[>/?(""9!&44Q?f b]M,0h""9(#!4Q?f b..8引物"!单位0EW+,-聚合酶"(!b+,-模板$玉米科学(""#A!3&(’!!&i!‘"(#=Q@D6E?QR[E5SH.P5H6PHT!"#$$%反应程序!&’%扩增在&(’)*++&’%仪,-.%/0/1234#上进行!反应程序为"5"6预变性789:#一个循环$5;6变性;+0#""6退火<"0#=76延伸;"0#共<+个循环$最后在=76延伸=89:%!>#电泳!&’%产物变性后在;?"@测序胶上分离!预电泳A"B &7+89:$电泳A+B &7+89:%,=#银染%*+@冰醋酸固定<89:$双蒸水快速漂洗*次&不超过*+0$+?7@CDEF <溶液染色"89:$显影液,<@E1FG &+?"@甲醛#显影$*+@冰醋酸定影%7结果与分析!"#$%&质量每管吸取*"!H IEC &分别加入"!H 溴酚蓝&用*@琼脂糖电泳检测IEC 质量,图*#%从图*中可以看出&虽然用快速提取方法在提取IEC 的过程中&没有用液氮碾磨&没有用氯仿’$I$等试剂&没有离心&没有沉淀&但是提取出来的IEC 却没有降解!*J "号为母本5A"<的IEC &>J *"为京科*"的IEC &*>J 7+为父本KC 的IEC图’用快速方法提取的$%&质量!"!(()分析结果将上述IEC 一起进行$$%分析,图7#&尽管用快速方法提取的IEC 中含有多种杂质&如多糖’蛋白质’叶绿素等&但是并不影响&’%扩增&即对$$%分析结果没有影响!从图7上可以看出&京科*"母本5A"<和父本KC 都只有一条带&母本带分子量大&父本带分子量小&而京科*"的带型为父母本互补&有两条带&带型清晰!因此&用快速方法提取的IEC 质量完全可以满足利用$$%分子标记进行IEC 指纹分析的需要!*J "号为母本5A"<的指纹&>J *"为京科*"的指纹&*>J 7+为父本KC 的指纹图!利用新方法提取的$%&(()分析结果<讨论利用本文介绍的玉米单粒种子IEC 提取新方法&提取的IEC 仍然能够满足$$%分析的需要&最关键的是速度快&一个人提取*++粒种子的IEC 只需<+89:左右&一人一个工作日可以提取*>++粒种子,*>个种子样品#的IEC !因此&经过改进IEC 提取方法&优化&’%反应程序&简化银染技术&要分析一个玉米种子样品,*++粒种子#的纯度&从IEC 提取&到&’%扩增&经过电泳&染色&到最后统计出结果&总共只需;4左右!与目前普遍应用的同工酶和蛋白质电泳技术相比&IEC 指纹技术已经成为室内检测玉米种子纯度的最快方法!虽然利用快速提取新方法提取的IEC 没有降解&但是由于存在多糖’蛋白质’叶绿素等细胞内含物杂质以及E1L ’(290)G’M ’NI(C 等化学物质&因此扩增时IEC 用量不宜过多&7J <!H 比较合适&如果IEC 用量过大&容易造成反应体系中杂质过多&影响扩增&容易发生有些管扩增不出来的现象&并且IEC 用量越大&缺管数量就越多!参考文献"O*P 王玉民&庄丙昌&等?玉米半粒种子IEC 提取及%C&I 分析O.P ?玉米科学&*55>&;!<Q "7=)7A ?O7P 郭景伦&赵久然&尉德铭&等?玉米单粒种子IEC 提取新方法O.P ?北京农业科学&*55=&*"!7Q "*)7?!下转第"#页$7期*=郭景伦等"适用于$$%分子标记的玉米单粒种子IEC 快速提取新方法!上接第"#页$!"#高文伟!李晓辉!李新海!等$玉米单粒和单叶片%&’快速提取及(()标记分析!*#$玉米科学!+,,-!.+/+0"...1.."$!-234%567839$%&’:;<=>4<?56@=5A8=B C::8C@5=)’D%>6>7BC?C?6E>=?:<>7?8:6<?@?4><?56C<F8?:C$(::8(4?:64:>68G:4H6575IBJ.KK-J++L.M.1.MN$!O2PH:6%QJ)56>78D P$’=>R?8%&’A?6?R=:R>=><?56A:<H58CF?<S >T7:@5=’UVD>685<H:=DP)>RR7?4><?56C$D7>6<357:4F7>=9?575IB ):R5=<:=J.KKKJ.ML O"1OM$WN2PC>?X7Y3J9>C<?>6QJ9=:<<C4H6:?8:=)J:<>7$P5AR>=><?E:>6>7BC?C 5@8?@@:=:6<%&’:;<=>4<?56R=5<5457CL’@>C<J F6?E:=C>7A>;?1R=:R>S =><?565@H?IH ZF>7?<B R7>6<%&’@5=I:6:<?4:E>7F><?56>68RHB75I:S 6:<?4C<F8?:C$D7>6<357:4F7>=9?575IB):R5=<:=J.KK[J.NL NK1[N$!M2(<:?6&J Q:==:6\>68]:77:=9$’6:^%&’:;<=>4<?56A:<H58@5= H?IH1<H5FIRF<A>=X:=>6>7BC?C?6>7>=I:1I:65A:CR:4?:C CF4H>C G=?<?4FA>:C<?EFA$D7>6<9=::8?6IJ+,,.J.+,L"O-1"ON$W[2杜何为!黄敏!张袒新$玉米%&’的小量快速提取W*2$玉米科学!+,,-!.+/+_"..-1..O$。

dna分子标记技术在甘薯遗传育种研究中的应用DNA分子标记技术在甘薯遗传育种研究中的应用一、DNA分子标记技术的介绍DNA分子标记技术是一种在分子水平上识别和区分生物个体之间差异的技术。

它可以帮助科研人员更深入地了解生物的遗传变异和遗传演化，对于植物育种研究尤为重要。

DNA分子标记技术主要包括随机扩增多态性DNA标记 (RAPD)、简单重复序列(SSR)标记、单核苷酸多态性(SNP)标记等。

这些技术具有快速、准确和高效的特点，为甘薯遗传育种研究提供了重要的分子工具。

二、甘薯遗传育种研究中DNA分子标记技术的应用在甘薯遗传育种研究中，DNA分子标记技术被广泛应用于种质资源鉴定、遗传多样性分析、基因定位和分子标记辅助选择等方面。

种质资源是育种研究的重要基础，通过DNA分子标记技术可以准确地鉴定甘薯品种之间的遗传差异，为育种新品种提供了更多选择。

利用DNA分子标记技术进行遗传多样性分析，可以全面了解甘薯种质资源的遗传多样性和遗传结构，为合理利用种质资源提供了科学依据。

DNA分子标记技术还可以帮助科研人员在甘薯中定位关键性状的基因，探索其遗传规律和分子机制。

通过基因定位，可以加速甘薯育种过程，提高选择效率和育种精度。

更重要的是，DNA分子标记技术的应用还可以实现分子标记辅助选择，即在育种材料中直接以分子标记来选择目标性状，大大加快了育种进程。

三、个人观点和理解从我个人的角度来看，DNA分子标记技术在甘薯遗传育种研究中的应用极大地丰富和拓展了育种研究的手段和方法。

它提供了更加准确、快速和高效的分子工具，为甘薯新品种的培育提供了科学依据和技术支持。

这些技术的广泛应用也为甘薯遗传育种研究注入了新的活力和动力，加快了育种进程，促进了甘薯产业的发展和壮大。

四、总结回顾DNA分子标记技术在甘薯遗传育种研究中的应用，极大地促进了甘薯育种研究的深度和广度。

它为甘薯遗传多样性的鉴定、关键性状的基因定位和分子标记辅助选择等方面提供了重要支持，成为育种研究的得力助手。

⼀个新的⽔稻C2H2型锌指蛋⽩cDNA的克隆与序列分析⼀个新的⽔稻C2H 2型锌指蛋⽩cD NA 的克隆与序列分析黄骥1,张红⽣13,曹雅君1,王东1,王建飞1,杨⾦⽔2(1南京农业⼤学作物遗传与种质创新国家重点实验室,江苏南京210095;2复旦⼤学遗传所,上海200433)中图分类号:S60314 ⽂献标识码:A ⽂章编号:1000Ο2030(2002)02Ο0110Ο03Cloning and sequence analysis of a ne w novel C2H 2zincfinger cD NA from rice (Oryza sativa L.)H UANGJi 1,ZH ANG H ong 2sheng 13,C AO Y a 2jun 1,W ANG Dong 1,W ANGJian 2fei 1,Y ANGJin 2shui 2(1.National K ey Lab of Crop G enetics and G erm plasm Enhancement ,Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China ; 2.Institute of G enetics ,Fudan Univ ,Shanghai 200433,China )锌指蛋⽩(zinc finger protein )是⼀类具有“⼿指状”结构域的转录因⼦,负责调控基因的表达。

锌指蛋⽩主要通过与核酸的相互作⽤,显⽰出不同的功能,如促进转录、抑制转录、单链DNA 结合、RNA 结合或RNA/DNA 双向结合[1]等。

Cys2/His2型锌指(也称TF ⅢA 型)是真核⽣物的转录因⼦中结构描述的最为清楚的转录因⼦,其锌指区为CX 2-4CX 3FX 5LX 2HX 3-5H 的结构[2]。

植物中⽬前已经克隆了⼀些C2H2型锌指蛋⽩基因,其中很多锌指区具有QA LGGH 的保守区,如与拟南芥花发育相关的S U2PERM AN [3],与⼩麦组蛋⽩H3与H4基因启动⼦区域专⼀性结合的WZF1[4],拟南芥和棉花中报道的耐盐锌指蛋⽩STZ [5]和CSTZ [6],⼤⾖中报道的冷诱导蛋⽩SC OF 21[7]等。