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青霉素结合蛋白研究进展青霉素结合蛋白(PBPs)是广泛存在于细菌表面的一种膜蛋白，是β_内酞胺类抗生素的主要作用靶位。
不同细菌其种类及含量均不相同。
但各种菌种的PBPs又有许多类似的结构与功能，在细菌生长、繁殖中发挥重要作用。
PBPs结构与数量的改变是产生细菌耐的一个重要机制。
现今，各类抗生素虽种类繁多，但在耐药菌的治疗中仍缺乏有效手段。
因此近年来围绕PBPs开展了大量的研究工作，试图从分子结构与基因水平认识PBPs，探求细菌耐药的机制，企图获得更有效的治疗手段。
1 PBPs研究简史及基本概念尽管上很早就开始应用青霉素，但到20世纪50年代，人们才认识到青霉素是通过干扰细菌的表面结构而起作用的。
60年代，细菌细胞壁的结构被阐明，为人们认识青霉素作用机制及PBPs奠定了基础。
1972年Suginak . Blumberg和Stro minge:发现青霉素结合蛋白，用放射性同位素标记的青霉素可以标出细菌表面的PBPs，但后来的研究发现并非所有PBP均是青霉素作用的致命靶位。
所有细菌都含有多种青霉素结合蛋白，不同菌属其PBPs含量、种类各不相同，不同的抗生素通过与不同的PBP蛋白结合而产生不同的抗菌活性。
因此，与不同PBP结合的抗生素可联合应用，往往产生协同作用。
每个菌种都有一套特异的PBPs，称PBPs谱。
在一种菌种中PBPs按分子量大小排序，分别称PBPI,PBP2,PBP3......。
PBPl为分子量最大的一种。
不同菌属PBPs的生理功能很相近，而且分子结构上也有其相关及相似性。
PBPs含量很少，仅占细胞膜蛋白总量的1%，不同PBP含量变化很大，如大肠杆菌中高分子的PBPI,PBP2和PBP3量很少，而低分子PBPS和PBP6却占PBPs量的70%—90%。
各种PBP与抗生素亲和力相差亦很大。
亲和力大小一般用。
表示; 指使-青霉素G结合减少50%时该抗生素浓度，其值越高，示药物亲和力越小。
研究PBPs的方法与技术不断地发展。
浅议青霉素结合蛋白测定技术青霉素是一种广泛使用的抗生素，它在治疗感染性疾病时起着非常重要的作用。
然而，对于一些患者来说，它可能会引起过敏反应，这是因为患者对青霉素结合蛋白（PBP）产生了免疫反应。
因此，测定青霉素结合蛋白浓度可以帮助医生更好地诊断和治疗患者。
青霉素结合蛋白测定技术的原理青霉素结合蛋白测定技术是一种免疫测定方法，主要基于抗体-抗原反应原理。
它利用特定的抗体来检测血液或尿液中的青霉素结合蛋白。
首先，制备针对青霉素结合蛋白的抗体。
这些抗体会与青霉素结合蛋白特异性结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，将一定量的抗体和未知浓度的样品混合。
当存在青霉素结合蛋白时，它会与抗体结合，形成更多的抗原-抗体复合物。
测定最终复合物的浓度，可以计算出青霉素结合蛋白的浓度。
青霉素结合蛋白测定技术的优势青霉素结合蛋白测定技术有许多优势，具体如下：1. 高度特异性由于它是基于抗体-抗原反应原理，所以只能识别青霉素结合蛋白。
这种高度特异性保证了检测结果的准确性和可靠性。
2. 灵敏度高青霉素结合蛋白测定技术的灵敏度很高，可以检测到非常微小的青霉素结合蛋白浓度。
这与其他测定方法相比具有明显的优势。
3. 操作简便与其他测定方法相比，青霉素结合蛋白测定技术需要较少的样本处理步骤，操作简便。
青霉素结合蛋白测定技术的应用青霉素结合蛋白测定技术可以应用于以下几个方面：1. 诊断过敏反应青霉素结合蛋白浓度的检测可以帮助医生诊断患者是否对青霉素过敏。
如果患者的青霉素结合蛋白浓度高，他们可能会对青霉素产生免疫反应，这需要注意和及时处理。
2. 监测青霉素治疗在患者接受青霉素治疗过程中，青霉素结合蛋白浓度的监测可以帮助医生了解患者在治疗中的反应情况。
如果青霉素结合蛋白浓度下降较慢，可能需要考虑是否要更换抗生素或增加青霉素剂量。
3. 研究青霉素结合蛋白青霉素结合蛋白浓度的测定还可以应用于研究青霉素结合蛋白。
通过测定不同样本中的青霉素结合蛋白浓度，可以了解其变化规律，并探索其功能和作用。
青霉素结合蛋白PBP 2b基因的克隆与表达覃鸿妮;俞苏敏【摘要】在已知基因序列但缺乏DNA模版的情况下,人工设计合成多条引物,采用重叠PCR技术体外人工合成编码青霉素结合蛋白的基因PBP 2b.将合成的PBP 2b 基因连接到载体pet-30a上,并将重组表达载体（pet-30a）/PBP2b-tiger转入T7 expression E.coli表达菌株中.重组工程菌经IPTG诱导,用SDS-PAGE鉴定,发现青霉素结合蛋白（PBPs）成功表达.本研究构建了高表达青霉素结合蛋白（PBPs）的原核表达系统,制备出青霉素结合蛋白,从而为进一步从基因水平认识青霉素结合蛋白（PBPs）奠定基础,为了解细菌耐药的机制提供依据.【期刊名称】《生物技术世界》【年(卷),期】2016(000)002【总页数】2页(P11-12)【关键词】青霉素结合蛋白 PBP 2b基因克隆表达【作者】覃鸿妮;俞苏敏【作者单位】苏州工业园区服务外包职业学院,江苏苏州215123【正文语种】中文【中图分类】Q75青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins， PBPs）是细菌表面的一种微小蛋白质，PBPs由Suginaka 等于1972年第一次报道，能和青霉素共价结合，使青霉素具有完全的抗原性［1］。
PBPs是一类在肽聚糖合成中起着重要作用酶类，当外源青霉素或其它β-内酰胺类抗生素作为青霉素结合蛋白底物（细胞正常代谢过程中，本应与青霉素结合蛋白反应结合的物质）的结构类似物，竞争性地与青霉素结合蛋白共价结合，就可以引起细菌细胞壁合成相关酶的缺乏，从而干扰细菌细胞壁的合成，以达到杀灭细菌的作用［2］。
一旦青霉素结合蛋白的数量、种类或者与抗生素的亲和力发生变化将会影响细菌的形态或细菌对抗生素的敏感性。
细菌青霉素结合蛋白改变引起的细菌对抗生素的耐药性是现研究的热点之一，其对抗生素的改造、新抗生素的设计均有指导意义［3，4，5，6］。
青霉素与细菌体内的青霉素结合蛋白，抑制细菌细胞壁的合成，菌体失去渗透屏障而膨胀、裂解，同时借助细菌的自溶酶溶解而产生抗菌作用。
青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。
青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。
但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄，主要对革兰氏阳性菌有效。
青霉素G有钾盐、钠盐之分，钾盐不仅不能直接静注，静脉滴注时，也要仔细计算钾离子量，以免注入人体形成高血钾而抑制心脏功能，造成死亡。
【适应症】青霉素适用于敏感细菌所致各种感染，如脓肿、菌血症、肺炎和心内膜炎等。
其中青霉素为以下感染的道选药物。
1.溶血性链球菌感染，如咽炎、扁桃体炎、猩红热、丹毒、蜂窝织炎和产褥热等。
2.肺炎链球菌感染如肺炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症等。
3.不产青霉素酶葡萄球菌感染。
4.炭疽。
5.破伤风、气性球疽等梭状芽孢杆菌感6.梅毒（包括先天性梅毒）。
7.钩端螺旋体病。
8.回归热。
9.白喉。
10.青霉素与氨基糖苷灯药物联合用于治疗草绿色链球菌心内膜炎。
青霉素亦可用于治疗：1.流行性脑脊髓膜炎。
2.放线菌病。
3.淋病。
4.奋森咽峡炎。
5.莱姆病。
6.鼠咬热。
7.李斯特菌感染。
8.除脆弱拟杆菌以外的许多厌氧菌感染。
风湿性心脏病或先天心脏病患者进行口腔、牙科、胃肠道或泌尿生殖道手术和操作前，可用青霉素预防感染性心内膜炎发生。
【用法用量】青霉素由肌内注射或静脉滴注给药。
1.成人：肌内注射，一日80万～200万单位，分3～4次给药；青脉滴注，一日200万～2000万单位，分2～4次给药。
青霉素结合蛋白与革兰阴性细菌耐药性的研究进展王欣慧;蒋燕群【摘要】青霉素结合蛋白(PBPs)的改变与β-内酰胺类抗生素的亲和力降低是革兰阳性球菌获得抗生素耐药性的重要机制之一,而在革兰阴性细菌中因PBPs的改变导致耐药的出现却十分少见,这一观点忽视了革兰阴性细菌中PBPs在β-内酰胺类抗生素耐药机制中的作用.文章对PBPs的结构、功能、检测方法及与革兰阴性细菌耐药性的关系等方面的研究进展作一综述.%It has been identified that the modification of penicillin-binding proteins ( PBPs) and the reduction of affinity for β-lactams are important mechanisms by which Gram-positive cocci acquire antibiotic resistance. However, among Gram-negative bacteria, the resistance caused by the modification of PBPs has been considered unusual, which neglects the role of PBPs in β-lactams resistance in Gram-negative bacteria. In this paper, the structure, function and research method of PBPs, and the relationship between PBPs and Gram-negative bacterial resistance are reviewed.【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2012(032)006【总页数】4页(P820-822,封3)【关键词】青霉素结合蛋白;革兰阴性细菌;耐药性【作者】王欣慧;蒋燕群【作者单位】上海交通大学附属第六人民医院检验科,上海200233;上海交通大学附属第六人民医院检验科,上海200233【正文语种】中文【中图分类】Q513青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins, PBPs)是细菌细胞内膜上一种特殊的膜蛋白，因其可特异地与β-内酰胺类抗生素共价结合作为β-内酰胺类抗生素的作用靶蛋白而得名。
大肠杆菌的青霉素结合蛋白位点大肠杆菌的青霉素结合蛋白位点大肠杆菌是常见的肠道细菌之一，它具有广泛的抗药性和致病能力。
而青霉素结合蛋白是大肠杆菌细菌的一种重要抗药机制。
在细菌界中，这是一种普遍存在的保护机制，能够使细菌耐受青霉素这类β-内酰胺类抗生素。
而这一机制的精细调控和位点特性的研究将有助于我们更有效地对抗细菌感染。
1. 青霉素结合蛋白的功能和意义青霉素结合蛋白(Binding Proteins)是细菌细胞壁的关键组成部分。
它们通过结合和降解青霉素类抗生素，以减弱这些药物对细菌的杀菌作用。
这些蛋白质通过竞争化学键结合位点上的青霉素类抗生素，从而最大限度地降低其在细胞壁中的浓度，从而防止药物对细菌的杀伤作用。
通过调整细菌表面的结合蛋白的表达水平，细菌可以调控对抗生素的敏感性及其致病性，对抗生素耐药性的产生起到重要作用。
2. 青霉素结合蛋白的结构和作用机制据目前研究发现，青霉素结合蛋白与细菌细胞壁上的β-lactam类抗生素之间存在一种特定的化学键结合，这种化学键结合可以减轻抗生素的杀伤作用。
青霉素结合蛋白通常由一个或多个结构域组成，这些结构域具有特定的结合位点，能与青霉素类抗生素形成稳定的络合物。
研究人员通过晶体学分析青霉素结合蛋白与抗生素的结合结构，发现这些蛋白在位点上存在特殊的氨基酸残基，这些残基能与青霉素类抗生素发生特定的相互作用，从而保护细菌免受抗生素的杀伤。
3. 青霉素结合蛋白与抗生素耐药性的关系青霉素结合蛋白的高水平表达能够明显降低细菌对抗生素的敏感性。
当细菌感受到周围环境中存在抗生素时，青霉素结合蛋白的表达水平会显著上调，这使得细菌能够更好地补充和维持细胞壁的完整性。
在此过程中，抗生素与青霉素结合蛋白形成络合物，从而无法发挥抗菌作用，使得细菌能够在抗生素应激下得以生存和繁殖。
4. 青霉素结合蛋白的研究进展近年来，关于青霉素结合蛋白的研究取得了长足进展。
研究人员通过基因工程技术和结构生物学手段，对青霉素结合蛋白进行序列分析、异源表达和晶体学解析等工作，已经解析了一些结合位点的结构和特征。
青霉素结合蛋白测定技术
【中图分类号】r917 【文献标识码】a 【文章编号】1672-3783（2011）02-0198-01
【摘要】当前,细菌耐药性问题日趋严重,给临床治疗带来困难,对β-内酰胺类抗生素而言,某些菌青霉素结合蛋白(pbps)改变造成的耐药性,是β-内酰胺类抗生素的特点。
【关键词】青霉素;结合蛋白;测定技术
当前,细菌耐药性问题日趋严重,给临床治疗带来困难,对卜内酞胺类抗生素而言,某些菌青霉素结合蛋白(pbps)改变造成的耐药性,是卜内酞胺类抗生素的特点。
一般细菌的pbps均为胞浆膜上的蛋白质,是细菌致死的靶位。
它的数目、位置、亲和力的变化造成与卜内酞胺类抗生素不易结合而产生耐药性。
人们常采用sds聚丙烯酞胺凝胶电泳和放射自显影的方法研究pbps图谱,以便了解敏感菌和耐药菌的区别。
所以,pbps测定技术是研究压内酸胺类耐药性的重要手段。
的穿透力弱,用一般放射自显影法不能获得pbps图谱,需采用荧光闪烁剂增效的“荧光放射自显影法”。
国内有关pbps测定技术报道甚少,以3h标记者更少,本文介绍这一技术。
1 材料与方法
1.1 材料:菌种肺炎链球菌31003,30301(北京药品生物制品检定所;pen08.r6本室保存菌种。
培养基c+y培养基。
仪器及药品
垂直板凝胶电泳槽(吴县科研仪器厂);ng-1型真空凝胶干燥器(太仓电视机厂);tgll-1a型台式高速冷冻离心机(中科院上海生物化学研究所);8438-超低温冰箱(formasclentifi。
,美国);电泳仪dy-1型(上海医用分析仪器厂);丙烯酞胺(aerylamide,上海制药厂产);甲撑双丙烯酞胺.(big;瑞士产品);n,n,n,n-四甲基乙二胺(temed,上海前进农场制剂厂);3h标记青霉素乙酞呱陡盐(newengiandnuclear,美国);x光底片(天津感光材料
厂;kodakdiangnostiefilmx-omatar13x18em);2,5-二苯基嗯哇(ppo,闪烁纯,上海试剂一厂);月桂酞肌氨酸钠(sarkosyl,sigma);十二烷基硫酸钠(sds,上海新华化工厂);二甲基亚矾(dmso,北京旭东化工厂)。
1.2 方法:肺炎链球菌pbps样品的制备将肺炎链球菌按种c+y 培养基37℃过夜培养,次日再移种新鲜培养基中,37℃培养2~3h至对数生长期,菌数约为个/ml(cfu/ml),菌液分装试管,每管lml于冰浴中加入不同浓度的氖标记青霉素37℃保温10min,在冰浴中加入5非标记青霉素g钠盐20万单位/ml,冷冻离心5000:/minlom仇,弃去上清,菌体沉淀用50以磷酸缓冲液(ph6.8)做成菌悬液,然后加入5-10拼-20%sarkosyl,37℃保温10min使细胞溶解,加入30协一样品缓冲液,煮沸3min,置室温备用。
聚丙烯鱿胺凝胶电泳采用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(sdspage)方法。
制备凝胶薄片(厚0.2cm),凝胶配方:分离胶(10%):aerylamide:bis(30:0.5)6.7ml,tris(ph8.8,1.5ml/
l)5ml,10%sds 0.2ml,蒸馏水8.1ml,真空搅拌10-15min除去气体,再加入temed,浓缩胶(5%):按上述配方依次为1.7ml,2.5ml,0.1而,5.6ml,7.5,和150。
先配制分离胶,灌注直立式电泳槽后,使凝胶凝固。
次日加入浓缩凝胶,放入加样梳,静置2h。
在加样槽内依次分别加入pbps样品。
接通电流,第一小时维持电压在60v,至染料前沿到达分离胶和浓缩胶交界处调高电压至120v,走完全程约需3-4h,用考马斯蓝r250染色30-45min,过夜脱色。
关光放射自显影方法凝胶片用二甲基亚矾(dmso)处理30min,再用新鲜dmso再次处理30而n,20%即。
处理2-3h,l%甘油和1%乙酸处理lh,将凝胶片贴附在厚滤纸上,使用凝胶真空干燥器进行真空干燥,将凝胶片和x光底片贴紧,置于x光射线暗匣内,放超低温冰箱-70℃使曝光1~zwr,将x光底片显影,定影,冲洗得到pbps的放射自显影图谱。
x光底片预曝光条件:(1)国产x光底片用照相闪光灯红色滤光片,加6层红色玻璃纸滤过,x光底片上覆盖6层红色玻璃纸,距离50cm,闪光灯闪二次;(2)进口x光底片预曝光用x光机最小功率100ma40kv,距离40em,每张x光底片曝光004s。
竟争性结合试验定量菌液中分别加入不同浓度的甲氧西林保温37℃ 10min,然后加入饱和量的氛标记青霉素,37℃保温10min,再按上述方法继续进行实验。
2 结果与讨论
本法测定肺炎链球菌全细胞中pbps的含量,首先需要分离菌体蛋白,为使菌体蛋白浓度维持在一定的水平上,必须控制菌龄和菌
液浓度。
菌液浓度约cfu/ml。
肺炎链球菌破碎细胞的方法以采用离子型去污剂sarkosyl为宜,它能选择性地作用于胞浆膜(3),使胞浆膜破裂,菌体蛋白释放出来,与此同时,已经与青霉素结合的膜蛋白pbps也一起释放出来。
样品制备完毕,煮沸3min,以便除去某些蛋白质的干扰,青霉素与pbps结合较牢固,不会被破坏。
本实验采用sds一page方法,sds在分离胶与浓缩胶中的终浓度均为0.1%。
分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%。
氖标记物穿透力较弱,用一般放射自显影方法不能得出图象,本实验采用荧光放射自显影法(fluoro,aphy),检测聚丙烯酞胺凝胶片上3h标记的蛋白质,有一定的优点。
ppo是荧光增效剂,其作用原理不是直接依赖sh放射出来的日射线,而是藉助3h上的日粒子与ppo相互作用发射出的光,造成x光底片的局部发黑得到深浅不同的暗线,从而获得青霉素结合蛋白的图谱。
肺炎链球菌的pbps图谱上可见有三条区带,即p即;(a,b),pbpz和pbp3。
一般情况下,青霉素浓度越大,亲和力越强,颜色越深,在竞争性试验中,甲氧西林浓度越大,亲和力越强,颜色越浅。
据报道,x光底片预曝光可增加荧光放射自显影法的灵敏度,.因为预曝光可以纠正样品放射性和x光底片图象吸收值之间的非线性关系,所以,经预曝光的x光底片上所得到的图象可以正确反映出样品的放射性分布情况。
用国产x光底片不经预曝光时,无图象出现,经预曝光则有图象出现,用进口x光底片未经预曝光者,图象的暗线区别不大。
预曝光
后的x光底片显示出暗线深浅不同的正确图象。
国产x光底片与进口x光底片比较,国产片敏感性较低,预曝后的x光底片上出现的暗线普遍较浅且细,pbpi。
不可见。
参考文献
[1] 钱海伦.细菌对卜内酞胺类抗生素耐药性的研究进展.中国
药科大学学报,1989;20(3):188
[2] 钱海伦,李静.肺炎球菌生长培养基和菌种保存方法的研究.
徽生物学通报,1989;16(1):15。
