原核表达步骤
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大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。
2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。
可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。
3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。
4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。
5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。
6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。
在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。
原核表达步骤
பைடு நூலகம்
重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及 SDS-PAGE 分析 挑测序正确的单克隆接种到 3mLLB（50 μg·mL-1Kan）培养基中，振 荡培养 12h 后，将菌液按 1﹕100 的比例加入到 300 mL LB（50 μ g·mL-1Kan）培养基中 200 r/min 37℃振荡培养至 OD600 为 0.5 —0.6 时，加入 IPTG（使终浓度为 1 mmol·L-1）进行诱导表达， 分 别 在 37 ℃ 诱 导 4h ， 4 ℃ 保 存 备 用 。 未 加 IPTG 诱 导 的 pET-28a-CsFOMT 收集作为阴性对照。诱导全部完成后，各取 50 mL 菌液离心收集细菌，加入 SDS 上样缓冲液，悬浮混匀，100℃ 3 min， 12 000 r/min 离心 1 min，取上清 4℃保存备用。另取 50 mL 菌 液离心收集菌体后用 1×PBS （PH7.4）将沉菌悬起，经过超声波细 胞破碎（20 mm 的变幅杆，400 W，超声 2 s，间隔 5 s，重复 60 次），10 000 r/min 离心 10 min 分离上清和沉淀，上清和沉淀样 品中分别加入 SDS 上样缓冲液，混匀，沸水浴，取上清和沉淀分别 进行 SDS-PAGE（5 %浓缩胶，12%分离胶），然后分析蛋白表达结果
1. 将已经成功转有重组表达载体 pET-28a-CYP83A1 的表达菌 E. coli. BL21 (DE3)在 LB 固体培养基（50μg/mL Kan）上划线接种培 2. 挑取单菌落，接种于 5 mL 的 LB 液体培养基(50μg/mL Kan) 中，37℃，180 r/min 振荡培养过夜。 3. 取 500 μL 过夜培养的菌液转接入 100 mL 新的 LB 液体培养基 (50μ g/mL Kan) 中 ， 37 ℃ ， 190 r/min 振 荡 培 养 到 菌 液 OD 600 =0.6~0.8。 4. 分组培养：实验组加入终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG，对照组不 加 IPTG， 37℃，190 r/min 诱导培养 6 h。 5. 8000 r/min 离心 2 min，收集细菌，用 1×PBS(0.01 mol/L) 缓冲液悬浮。 6. 冰上超声波破碎，功率 30 w，工作 5 s，间歇 5 s，总时间 2 min。 7. 4℃、12 000 r/min 离心 10 min，分离上清与沉淀，取 100 μL 上清与等体积的 2×上样缓冲液混合；用 200 μL 1×上样缓 冲液悬浮沉淀，沸水浴 5 min 后，对上清和沉淀进行 SDS-PAGE 检 测。
重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及 SDS-PAGE 分析 挑测序正确的单克隆接种到 3mLLB（50 μg·mL-1Kan）培养基中，振 荡培养 12h 后，将菌液按 1﹕100 的比例加入到 300 mL LB（50 μ g·mL-1Kan）培养基中 200 r/min 37℃振荡培养至 OD600 为 0.5 —0.6 时，加入 IPTG（使终浓度为 1 mmol·L-1）进行诱导表达， 分 别 在 37 ℃ 诱 导 4h ， 4 ℃ 保 存 备 用 。 未 加 IPTG 诱 导 的 pET-28a-CsFOMT 收集作为阴性对照。诱导全部完成后，各取 50 mL 菌液离心收集细菌，加入 SDS 上样缓冲液，悬浮混匀，100℃ 3 min， 12 000 r/min 离心 1 min，取上清 4℃保存备用。另取 50 mL 菌 液离心收集菌体后用 1×PBS （PH7.4）将沉菌悬起，经过超声波细 胞破碎（20 mm 的变幅杆，400 W，超声 2 s，间隔 5 s，重复 60 次），10 000 r/min 离心 10 min 分离上清和沉淀，上清和沉淀样 品中分别加入 SDS 上样缓冲液，混匀，沸水浴，取上清和沉淀分别 进行 SDS-PAGE（5 %浓缩胶，12%分离胶），然后分析蛋白表达结果
1. 将已经成功转有重组表达载体 pET-28a-CYP83A1 的表达菌 E. coli. BL21 (DE3)在 LB 固体培养基（50μg/mL Kan）上划线接种培 2. 挑取单菌落，接种于 5 mL 的 LB 液体培养基(50μg/mL Kan) 中，37℃，180 r/min 振荡培养过夜。 3. 取 500 μL 过夜培养的菌液转接入 100 mL 新的 LB 液体培养基 (50μ g/mL Kan) 中 ， 37 ℃ ， 190 r/min 振 荡 培 养 到 菌 液 OD 600 =0.6~0.8。 4. 分组培养：实验组加入终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG，对照组不 加 IPTG， 37℃，190 r/min 诱导培养 6 h。 5. 8000 r/min 离心 2 min，收集细菌，用 1×PBS(0.01 mol/L) 缓冲液悬浮。 6. 冰上超声波破碎，功率 30 w，工作 5 s，间歇 5 s，总时间 2 min。 7. 4℃、12 000 r/min 离心 10 min，分离上清与沉淀，取 100 μL 上清与等体积的 2×上样缓冲液混合；用 200 μL 1×上样缓 冲液悬浮沉淀，沸水浴 5 min 后，对上清和沉淀进行 SDS-PAGE 检 测。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核表达步骤
原核表达步骤原核表达是指在原核生物体内将基因转录成RNA，再将RNA翻译成蛋白质的过程。
本文将详细介绍原核表达的步骤。
1. 转录DNA的双链结构被酶RNA聚合酶解开，从而形成mRNA链。
RNA聚合酶沿着DNA模板链移动，将mRNA链合成在一起。
在这个过程中，RNA聚合酶根据DNA模板链上的碱基序列，选择正确的核苷酸，将其加入到正在合成的mRNA链上。
2. 剪接在细胞核内，mRNA链是在原核生物上转录的。
这些mRNA链可能包含顺式调节区域（UTR）和内含子区域。
在剪接过程中，内含子被剪除，UTR被保留下来。
这个过程由小核RNA（snRNA）和蛋白质共同完成。
3. 翻译翻译是将mRNA链转化为氨基酸序列的过程。
翻译是在核糖体中完成的。
核糖体是由rRNA和蛋白质组成的复合体。
核糖体通过识别mRNA上的起始密码子来开始翻译过程。
起始密码子是AUG。
核糖体将氨基酸连接在一起，直到遇到终止密码子。
终止密码子分别是UAA，UAG和UGA。
翻译完成后，成品蛋白被释放出来。
4. 后翻译修饰在翻译完成后，蛋白质可能需要进行后翻译修饰。
这些修饰可以包括磷酸化，甲基化，硫化，酰化和糖基化等。
这些修饰可以改变蛋白质的结构和功能，从而影响其生物学活性。
5. 折叠蛋白质被合成后，需要进一步折叠成其最终形态。
这个过程由分子伴侣和蛋白酶等分子机器完成。
分子伴侣可以协助蛋白质正确地折叠。
蛋白酶可以降解不正确折叠的蛋白质，防止它们对细胞造成损害。
6. 定位在折叠完成后，蛋白质需要被定位到其最终的位置。
这个过程由信号肽和其他分子机器完成。
信号肽是一段氨基酸序列，可以将蛋白质定位到细胞膜，内质网，线粒体等亚细胞结构中。
原核表达是一个复杂的过程，包括转录，剪接，翻译，后翻译修饰，折叠和定位。
这些步骤需要各种不同的分子机器和分子信号来协同完成。
理解原核表达的步骤可以帮助我们更好地理解生物学过程，从而为生命科学的研究和应用提供基础。
原核表达详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达步骤总结
原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋⽩，然后进⾏蛋⽩纯化。
本实验⽅案的前提是，⽬的基因已克隆到载体，并已转进⼊JM109菌株中。
1．鉴定⽬的蛋⽩是否在⼤肠杆菌JM109或BL21中⼤量表达（1）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加⼊0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1：50⽐例（200ul），将活化的过夜培养物加⼊10mL LB液体培养基中，加⼊10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min 摇床扩⼤培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使⼤肠杆菌处于最适合表达外源蛋⽩的⽣长状态。
(⼀般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第⼀次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩⼤培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空⽩对照（CK），其余7ml菌液加⼊7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。
以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离⼼2min收集菌体，倾倒上清，每个离⼼管收集3ml培养物。
5. 加⼊1ml dH2O，将管底沉淀⽤振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离⼼2min，倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离⼼管中的⽔倒⼲净。
（⼆）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加⼊200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，⼀般200ul⽐较合适)。
⽤漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。
样品凉后，12000r/min离⼼3min，取每管的上清点样。
原核表达实验流程
８）防止其它杂菌污染。
二．DＮA连接和转化
基本原理
Ｔ4ＤNA连接酶最初分离于T4噬菌体感染的大肠杆菌，可催化DＮA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。在本试验中,将克隆载体pGEM-Ｔ与外源DNA片段用T4连接酶连接，可将外源DNA片段插入ｐGＥM-T质粒中，构建外源DNA的克隆载体。
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
(６)４℃用JＡ转头(或与之相当的转头)以2500rpｍ／ｍiｎ离心2０miｎ,以回收细胞。倒去培养液,用2５mＬ冰冷的10%甘油重悬沉淀。(甘油有保存细胞的作用)
（7）4℃用ＪA转头（或与之相当的转头)以2500rpm／ｍin离心20ｍiｎ，以回收细胞。倒去培养液，用1mL冰冷的１0％甘油重悬沉淀。(倾倒培养液时要小心，１0%甘油中的细菌沉淀附着力降低。)
(阳性）转化细胞１
酶切，获取目的基因
Peｔa／DH5a载体
重组
重组载体２
第二步
重组载体2DＨ5a感受态细胞
转化
转化细胞2
抽取质粒进行电泳
酶切验证检验阳性
(阳性）转化重组载体３
BL21感受态细胞
转化细胞３
诱导表达
蛋白质提取
SDＳ-ＰAＧＥ电泳检测呈阳性
目的蛋白
一.感受细胞的制备
体外连接的ＤNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源ＤNA的能力,提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CａCl２ 法将外源ＤＮA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaＣl2感受态细胞。本实验制备的是电转化感受态细胞。
二．DＮA连接和转化
基本原理
Ｔ4ＤNA连接酶最初分离于T4噬菌体感染的大肠杆菌，可催化DＮA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。在本试验中,将克隆载体pGEM-Ｔ与外源DNA片段用T4连接酶连接，可将外源DNA片段插入ｐGＥM-T质粒中，构建外源DNA的克隆载体。
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
(６)４℃用JＡ转头(或与之相当的转头)以2500rpｍ／ｍiｎ离心2０miｎ,以回收细胞。倒去培养液,用2５mＬ冰冷的10%甘油重悬沉淀。(甘油有保存细胞的作用)
（7）4℃用ＪA转头（或与之相当的转头)以2500rpm／ｍin离心20ｍiｎ，以回收细胞。倒去培养液，用1mL冰冷的１0％甘油重悬沉淀。(倾倒培养液时要小心，１0%甘油中的细菌沉淀附着力降低。)
(阳性）转化细胞１
酶切，获取目的基因
Peｔa／DH5a载体
重组
重组载体２
第二步
重组载体2DＨ5a感受态细胞
转化
转化细胞2
抽取质粒进行电泳
酶切验证检验阳性
(阳性）转化重组载体３
BL21感受态细胞
转化细胞３
诱导表达
蛋白质提取
SDＳ-ＰAＧＥ电泳检测呈阳性
目的蛋白
一.感受细胞的制备
体外连接的ＤNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源ＤNA的能力,提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CａCl２ 法将外源ＤＮA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaＣl2感受态细胞。本实验制备的是电转化感受态细胞。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核表达实验流程
原核表达流程： 第一步
pGEM-T载体
目的基因获取 PCR扩增
重组载体1 转化
DH5a感受态制备 DH5a感受态细胞
第二步
转化细胞1 抽取质粒进行电泳 酶切验证检验阳性
（阳性）转化细胞1 酶切，获取目的基因
Pet28a/DH5a载体 重组
重组载体2
重组载体2 转化
DH5a感受态细胞
转化细胞2 抽取质粒进行电泳 酶切验证检验阳性
(6) 4℃用JA转头（或与之相当的转头） 以2500rpm/min离心20min，以回收 细胞。倒去培养液，用25mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（甘油有保存 细胞的作用）
(7) 4℃用JA转头（或与之相当的转头） 以2500rpm/min离心20min，以回收 细胞。倒去培养液，用1mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（倾倒培养液时 要小心，10%甘油中的细菌沉淀附着力降低。）
3 ．方法
1 ）0.8%琼脂凝胶板的配制：取 0.6g 琼脂糖加80ml TAE（1 × ），
20ml水，微波炉加热融化3 分
(8) 将细胞按40μL等份装入微量离心管，直接使用或-80℃保存
(9) 感受态细胞的检测：取感受态细胞分别涂布含有氨苄青霉素和卡那 霉素抗性的LB平板，
37℃培养12－16小时，观察感受态细菌是否有污染；
(10) 取 1μ g 超螺旋质粒转化制备的感受态，检测转化效率(一般情况下，没 有必要精确计算，可用根据经验估计)。
电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿 孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于 DNA 等大分子进 入。同时 DNA 在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要 的。 实验材料
质粒DNA，pGEM-T载体或PET表达载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液 10×
pGEM-T载体
目的基因获取 PCR扩增
重组载体1 转化
DH5a感受态制备 DH5a感受态细胞
第二步
转化细胞1 抽取质粒进行电泳 酶切验证检验阳性
（阳性）转化细胞1 酶切，获取目的基因
Pet28a/DH5a载体 重组
重组载体2
重组载体2 转化
DH5a感受态细胞
转化细胞2 抽取质粒进行电泳 酶切验证检验阳性
(6) 4℃用JA转头（或与之相当的转头） 以2500rpm/min离心20min，以回收 细胞。倒去培养液，用25mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（甘油有保存 细胞的作用）
(7) 4℃用JA转头（或与之相当的转头） 以2500rpm/min离心20min，以回收 细胞。倒去培养液，用1mL冰冷的10%甘油重悬沉淀。（倾倒培养液时 要小心，10%甘油中的细菌沉淀附着力降低。）
3 ．方法
1 ）0.8%琼脂凝胶板的配制：取 0.6g 琼脂糖加80ml TAE（1 × ），
20ml水，微波炉加热融化3 分
(8) 将细胞按40μL等份装入微量离心管，直接使用或-80℃保存
(9) 感受态细胞的检测：取感受态细胞分别涂布含有氨苄青霉素和卡那 霉素抗性的LB平板，
37℃培养12－16小时，观察感受态细菌是否有污染；
(10) 取 1μ g 超螺旋质粒转化制备的感受态，检测转化效率(一般情况下，没 有必要精确计算，可用根据经验估计)。
电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿 孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于 DNA 等大分子进 入。同时 DNA 在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要 的。 实验材料
质粒DNA，pGEM-T载体或PET表达载体，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液 10×
原核表达步骤
２、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体,而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
CCＹ的IPＴG是1M的,用时进行１０00倍稀释。ﻫ二、操作步骤ﻫ（一)获得目的基因
1、通过PCＲ方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PＣR循环获得所需基因片段。ﻫ2、通过RT-ＰCR方法:用TＲIｚoｌ法从细胞或组织中提取总ＲNA，以mＲNA为模板，逆转录形成cDNＡ第一链,以逆转录产物为模板进行PＣＲ循环获得产物。
1２、用３mｌ 含40０ｍM咪唑洗脱目的蛋白。
１3、镍柱用20%的乙醇适量，4℃保存。
1４、SDS-ＰAGＥ电泳检测蛋白纯化效果（上柱前样本,上柱后样本，杂蛋白，目的蛋白，未诱导蛋白）
附相关试剂配制：
50mＭ ＰBS
NａＨ2PO4.2H2O 1．48g
Na2ＨＰO４.１2Ｈ２Ｏ 14.５046g
NａＣL 29.3g
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件:ﻫ(1）选择标志的编码序列；
(2）可控转录的启动子；ﻫ（3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);
(４）一个多限制酶切位点接头;ﻫ(5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中(测序验证）-转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测,其中包括：ﻫ一、试剂准备ﻫ(1）ＬB培养基。ﻫ(2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）:2.３8g ＩPTG溶于１０ml ｄｄH2Ｏ中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。
3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
CCＹ的IPＴG是1M的,用时进行１０00倍稀释。ﻫ二、操作步骤ﻫ（一)获得目的基因
1、通过PCＲ方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PＣR循环获得所需基因片段。ﻫ2、通过RT-ＰCR方法:用TＲIｚoｌ法从细胞或组织中提取总ＲNA，以mＲNA为模板，逆转录形成cDNＡ第一链,以逆转录产物为模板进行PＣＲ循环获得产物。
1２、用３mｌ 含40０ｍM咪唑洗脱目的蛋白。
１3、镍柱用20%的乙醇适量，4℃保存。
1４、SDS-ＰAGＥ电泳检测蛋白纯化效果（上柱前样本,上柱后样本，杂蛋白，目的蛋白，未诱导蛋白）
附相关试剂配制：
50mＭ ＰBS
NａＨ2PO4.2H2O 1．48g
Na2ＨＰO４.１2Ｈ２Ｏ 14.５046g
NａＣL 29.3g
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件:ﻫ(1）选择标志的编码序列；
(2）可控转录的启动子；ﻫ（3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);
(４）一个多限制酶切位点接头;ﻫ(5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中(测序验证）-转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测,其中包括：ﻫ一、试剂准备ﻫ(1）ＬB培养基。ﻫ(2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）:2.３8g ＩPTG溶于１０ml ｄｄH2Ｏ中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。
原核表达步骤总结
原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。
本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。
一．鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达（一）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp （100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。
(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。
以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。
5. 加入1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离心管中的水倒干净。
（二）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。
用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。
样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。
原核表达步骤
原核表达步骤一、转录（Transcription）转录是指DNA转录为RNA的过程，即DNA的信息通过RNA的合成而表达出来。
转录是生物体中基因表达的第一步，也是生物体合成蛋白质的关键步骤之一。
在原核生物中，转录过程分为三个阶段：启动、延伸和终止。
启动阶段是指RNA聚合酶（RNA polymerase）与DNA的结合，并在DNA上找到起始转录位点。
延伸阶段是指RNA聚合酶沿DNA模板链向下滑动，并合成RNA链。
终止阶段是指RNA聚合酶在遇到终止信号时停止转录，释放出合成的RNA链。
二、剪接（Splicing）剪接是指在转录过程中，将RNA前体分子中的内含子（intron）剪切除去，将外显子（exon）连接起来的过程。
原核生物中的剪接方式相对简单，通常是直接将外显子连接起来，形成成熟的RNA分子。
剪接的主要作用是消除内含子的干扰，使RNA分子能够直接参与翻译过程。
通过剪接，原核生物能够快速生成成熟的RNA分子，提高基因表达效率。
三、翻译（Translation）翻译是指将RNA的信息翻译成蛋白质的过程。
在原核生物中，翻译过程发生在核糖体（ribosome）中，涉及到mRNA、tRNA和rRNA等多种分子。
翻译分为三个主要步骤：启动、延伸和终止。
启动阶段是指核糖体与mRNA的结合，并识别起始密码子（AUG）位置。
延伸阶段是指核糖体沿mRNA滑动，将氨基酸依次加入正在合成的多肽链中。
终止阶段是指核糖体在遇到终止密码子（UAA、UAG、UGA）时停止翻译，释放合成的多肽链。
四、调控（Regulation）调控是指控制基因表达水平的过程，包括转录调控和翻译调控两个方面。
原核生物通过调控转录和翻译过程中的各个环节来实现基因表达的精确调控。
转录调控主要通过转录因子（transcription factor）和启动子（promoter）之间的相互作用来实现。
转录因子能够结合到启动子上，促进或抑制RNA聚合酶的结合，从而调控基因的转录水平。
原核表达实验技术
TAKARA DNA凝胶回收试剂盒1. 切胶：先用酒精灯消毒手术刀，在酶切仪中切胶，把片段放入1.5ml管中，用枪头搅碎。
2. 加GM试剂溶胶：加入700--800ul左右的GM，放进45℃水浴锅中溶胶。
3. 拿新的过滤柱和离心管，转移溶胶后液体进过滤柱，12000rpm.1min离心，把滤液重新倒进过滤柱，同样离心，后弃滤液。
4. 加WB（加乙醇）清洗：向过滤柱中心加700ulWB，同样条件下离心两次，弃滤液，最后空离30s。
5. 换新的1.5ml离心管，把柱子放入，加30ul的Elution Buffer/DDH2O.（注意要加在中央，不要碰壁）6. 离心1min，把滤液重新加入到过滤柱中，再离心，得到溶解的DNA液体，弃柱子。
7. 保存：-20℃LB培养液制备（1000ml）1. 称量：10g胰蛋白胨粉，5g酵母提取物，10gNacl于玻璃瓶，加DDH2O 1000ml。
2. 灭菌：把盖子拧松，高压蒸汽灭菌121℃，20min。
3. 置室温降温，后放4℃保存。
LB固体培养基制备1. 向100ml的液培中加入1.5g琼脂粉，高压灭菌20min。
2. 抗生素贮存液：卡那霉素（Kan）贮存液50 mg/ml、氨苄西林（Amp）贮存液100 mg/ml (均经过0.22µm 滤膜过滤除菌），-20℃储存，使用浓度卡那（k+）0.05mg/ml，氨苄（A+）0.1mg/ml。
3. 取出培养液，待其温度降至45—50℃时（不烫手），按照1:1000比例加入抗生素，充分混匀。
4. 倒入6cm一次性培养皿中，静置30—60min（等待平板冷却）。
5. 封口胶封口，倒置保存在4℃，期限为30D。
纯化PCR 产物（胶回收）（天根试剂盒）1. 在紫外灯下准确切取含有目的DNA片段的凝胶（体积尽可能小），放入干净的1.5 ml EP 管（预先称取空管重量）中，称取凝胶的重量。
2. 按每0.1 g凝胶加入100 ul PC溶液的比例往EP管中加入溶液PC，50℃水浴放置约10 min，期间不断温和晃动，确保凝胶完全溶解，此时溶液呈现黄色。
原核表达步骤
1.引物的设计及合成2.基因的克隆: PCR反应PCR产物的回收和纯化PCR产物的酶切3.质粒pET-32a的扩增、提取及酶切接种含有pET-32a空质粒的DH5α的菌株至LB (含有Amp l00ug/mL)中，37℃培养过夜。
取5mL菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒，酶切提取出的质粒，-20℃保存。
4.重组原核表达质粒的构建：4.1重组质粒的连接4.2感受态细胞的制备和转化：参照《分子克隆实验指南》的方法进行BL21感受态细胞的制备[16]。
在平板上挑取新鲜的BL21菌落，接种到5mLLB培养基中，37℃振荡培养2~5h，OD600达到0.35～0.5之间，取l～2mL菌液于无菌离心管中，冰上放置至0℃，4℃、5000 rpm离心5min，弃上清，用200uL CaCl2(0.1M)重悬，冰上放置30min，4℃、5000 rpm离心5min，弃上清，0.1M CaC12100uL重悬，4℃放置备用。
4.3重组质粒转化感受态细胞：将10uL重组原核表达质粒加入到100uL的BL21感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min，将离心管放入42℃水浴中热休克90s，立即将离心管冰浴5~10min，每管加入800uL的LB培养基，然后放入37℃摇床中100rpm培养45min，取出离心管5000rpm离心5min，弃去600uL上清，将沉淀的细菌混匀并涂布氨卞抗性的LB平板，涂布后正置30min后倒置于37℃培养箱中，培养12~16h。
4.4 重组质粒的鉴定4.4.1 PCR鉴定：挑取抗性LB平板上长出的BL21重组菌，并接种LB培养基中(含Amp100ug/mL)，37℃、200rpm摇振培养3~5h，PCR鉴定。
4.4.2 酶切鉴定：应用限制性内切酶对提取的质粒进行双酶切鉴定，通过双酶切鉴定目的基因有无插入及大小是否正确。
酶切结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下观察并拍照记录。
4.4.3重组质粒基因序列测定：挑选PCR检测条带亮，酶切鉴定正确的菌株测序。
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项原核表达操作步骤及注意事项发布时间： 2019-06-03 新闻来源：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点) ；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB 培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR 方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR 循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR 方法：用TRIzol 法从细胞或组织中提取总RNA ，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR 循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit 或冻融法回收载体大片段。
2、PCR 产物双酶切后回收，在T4DNA 连接酶作用下连接入载体。
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Chi l 原核表达基本试验步骤
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标志的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；
（4）一个多限制酶切位点接头；
（5）宿主体自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括：
一、试剂准备
（1）LB培养基。
（2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O
中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。
二、操作步骤
（一）获得目的基因
1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体
1、载体酶切：将表达质粒用限制性切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
我们用Soultion I连接。
（三）获得含重组表达质粒的表达菌种
1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
（四）诱导表达
1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含kana 50μg/ml）中37℃过夜培养。
2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将2ml菌加入到含200mlLB培养基培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3h-4h。
我用3.5h，有0.66-0.69）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂作为实验组，终浓度为1mM,两组继续37℃震荡培养3hr。
nsp2诱导4小时，比较好，3小时表达量较低。
4、离心4500g×30min收获沉淀。
5、加25ml 50 mM PBS（pH 7.4）洗1次
6、转到50ml离心管 8000rpm 10min。
7、加入1/10体积的50 mM PBS（不可溶细菌加8M尿素50 mM PBS）重悬细菌。
超声破碎（300W 4 S/4S,99次）。
超声后液体变清澈。
超声时探头离管底一定距离，防止管破裂。
8、12000g，10min，取上清作为待纯化的样品。
9、混匀镍柱，根据培养物及表达水平装柱2ml（加膜防镍柱漏）,用三个柱床体积50 mM PBS（不可溶细菌加8M尿素50 mM PBS）平衡柱子10、在柱中加入样品，找打开开关使液体流出（1滴/10S），样品反复上样3次
样品可以上样前调整pH至8.0
11、用3个柱床体积的50mM 咪唑的洗涤液洗涤柱子，除去杂蛋白
12、用3ml 含400mM 咪唑洗脱目的蛋白。
13、镍柱用20%的乙醇适量，4℃保存。
14、SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化效果（上柱前样本，上柱后样本，杂蛋白，目的蛋白，未诱导蛋白）
附相关试剂配制：
50mM PBS
NaH2PO4.2H2O 1.48g
Na2HPO4.12H2O 14.5046g
NaCL 29.3g
H2O 至 1000ml
8M 尿素PBS：尿素240.24g，加上述PBS 至500 ml
50mM咪唑:咪唑0.3404g, 50mM PBS100ml
60 mM咪唑:咪唑0.4084, 50mM PBS100ml
200mM咪唑：咪唑1.3616g，50mM PBS100ml
300 mM咪唑：咪唑2.042g，50mM PBS100ml
400mM咪唑: 咪唑2.7232g, 50mM PBS100ml
用浓盐酸调pH至7.4
三、注意事项
（1）选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。
如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。
（2）融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。
Rosetta 有两套质粒，做表达时，先将质粒转入DH5a,测序，酶切正确后再转入Rosetta;
Pet30a通过酶切可保留C端HIS，通过终止密码子可保留N端密码子。
包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。
包涵体表达的有利因素：
1、可溶性蛋白在细胞容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。
分离：
1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
2、过滤或萃取方法：
洗涤：
由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
溶解：
常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。
其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。
去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白。
问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。
极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。
如有人在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。
有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。
这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0。
有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。
增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。
还原剂：
由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。
还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。
在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。
还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。
对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。
复性：
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。
对于
盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。
复性中常采用的方法有：
稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。