第一章DNA重组技术讨论4个问题：⏹1.什么是基因工程——基因工程的概念。
⏹2.为什么能进行基因工程——基因工程的原理和技术。
（包括3大理论和3大技术准备）⏹3.怎样进行基因工程——3大步骤（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理）⏹4.基因工程的应用和前景——对于医学来说即生产基因工程产品、开展基因治疗等。
第一节概述一.现代科学技术发展的特点（一）科学技术加速发展和急剧变革1.当代科学发展成指数增长趋势，全世界发表科技论文6000－8000/天，平均1篇/10.8秒问世。
2.人类科技知识在19世纪半衰期是50年，现在是3－5年（终身教育学习）。
3.1973年，Cohen Group第一次实现了细菌遗传性状的转移ter r+ne r s r→ter r ne r，导致基因工程技术诞生，至今不到30年，人类已经拥有了克隆羊、猪等等的技术，可以复制一个生命体。
（克隆羊多利1997－2003，体细胞克隆，胚胎细胞克隆）Psclol tet r Rb-3ne rs rtet rne r tet r ne r O tet r ne rCohen Group 第一次实现了细菌遗传性状转移示意图一.现代科学技术发展的特点(二)科学技术发展的综合化1.19世纪中叶，科学和技术是二者分离的，它们各有独自文化传统，它们的发展往往是脱节的。
2.科学回答“是什么”“为什么”，技术回答“做什么”“怎么做”。
当今科技发展已经密不可分，科学里包含技术，技术里体现科学。
3.当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融合。
突破是线性的，即从研究开发新一代的科技成果取代原有一代科技成果。
融合是非线性的，即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品，造成革命性市场，它们是互补和合作的结果。
二．基因工程的概念（一）基因（gene）：从化学上来说，指的是一段DNA或RNA顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），可以由于突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正常和突变基因）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。
（二）基因工程（genetic engineering）：在体外通过人工剪、接，将不同来源的DNA分子组成一个杂合DNA分子(DNA分子重组体)，然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。
因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。
由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。
二．基因工程的概念1.“基因剪刀”：剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”。
2.“缝纫针”：连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起。
3.“交通工具”：使用载体好比一辆车子。
4.“乘客”：有用基因如IL好比使乘客，车子把乘客送2进宿主细胞中去繁衍生息，生产我们需要的产品或开展/LAK→抗癌）。
基因治疗（IL2我们应该记住他们——1.第一个实现DNA重组的人－Berg1972年，Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA，经过连接组成重组的DNA分子。
Berg是第一个实现DNA重组的人。
SV40λ phagePaul Berg我们应该记住他们——2.第一个取得基因工程成功的人－Cohen1973年，Cohen Group将E.coli的tet r质粒psclol和ne r s r R6-3质粒体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了ter r Ne r，实现了细菌遗传性状的转移。
这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年。
Stanley Cohen 和Herbert Boyer三．基因工程克隆技术――人类对自然的干预（一）“多利”羊的诞生“多利”羊诞生的技术路维尔穆特和克隆羊“多利”在一克隆羊“多利”起三．基因工程克隆技术――人类对自然的干预（二）胚胎细胞克隆和体细胞克隆的比较项目胚胎细胞克隆体细胞克隆供体细胞胚胎细胞（核）体细胞（核）受体细胞去核未受精的卵细胞去核未受精的卵细胞发育场所母体宫腔母体宫腔关键区别克隆的是子代（多生了一个）复制的是自己（复制了一个）（三）克隆技术是一把双刃剑用克隆技术复制人类的假想图四．基因工程三大理论，三大技术准备（一）理论上的三大发现1.20世纪40年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是DNA。
超越时代的科学成就往往不易被人们接受，Avery当时并未赢得阵阵掌声，他的论文事隔10年以后才公开发表。
2.20世纪50年代，Watson-crick提出了DNA结构的双螺旋结构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制。
3.20世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：DNA→RNA→Pr,破译了全部遗传密码，43。
（二）技术上的三大发明1．“基因剪刀”－限制性内切酶的发明1970年，Smith和Wilcox在流感嗜血杆菌（Haemophilus inffuenzae）分离纯化了HindⅡ，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。
2．载体(“交通工具车子”)直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。
这是基因工程的第二个技术准备。
（二）技术上的三大发明3．逆转录酶1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。
真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。
即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。
经过逆转录mRNA→cDNA(complementory DNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。
以上理论和技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。
五．与基因工程相关的概念（一）克隆（clone,cloning）1.原意是指单细胞纯系无性繁殖。
2.现代概念是将实验得到的人们所需的微量基因结构，引入适当的宿主细胞中去。
在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需要的基因结构，并进行表达。
由于整个操作在分子水平上进行，所以称为分子克隆（molecular cloning）。
五．与基因工程相关的概念（一）克隆（clone,cloning）3.这个术语的几种含义：（1）作为名词①带有相同插入顺序的重组DNA分子的1个群体。
②基因型（genetype）相同的细胞或生物体的一个群体。
③最常用的是描述一个微生物的一个菌落，这些微生物带有插入了特定DNA片断的载体分子。
（2）作为动词，是“去克隆”，即利用体外DNA重组技术将一个特定的基因或DNA顺序插入一个载体分子。
（二）重组DNA技术(DNA recombination technique)重组DNA技术是用酶学的方法将不同来源的DNA在体外切割，连接组成一个杂合的DNA分子的技术。
基因工程包括DNA 重组技术。
（三）生物工程（Biologic engineering）生物工程是更大范围内生产及产品的工程技术，是现代生物学中一切工程技术的总称，包括：1.遗传工程：基因工程，物理化学诱变；细胞融合；花粉培育；有性杂交等。
2．发酵工程3．酶学工程4．细胞工程①DNA重组；②DNA体外诱变；③体外基因操作；④基因化学合成基因工程第二节基因工程的酶学基础Enzymes第二节基因工程的酶学基础常用的工具酶（tool enzymes）：1.限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease)2.DNA连接酶（DNA ligase,ligase)3.逆转录酶(reverse transcriptase)4.DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)5.核酸酶(nuclease)6.末端转移酶(terminal transferase)7.碱性磷酸酶(BAP或CIP)以1和2最为常用，最为重要。
工具酶现已商品化。
第二节基因工程的酶学基础1.限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
来源于原核生物，属于核酸内切酶，即在核酸分子链的内部制造切口的酶。
1.1限制与修饰现象细菌的限制和修饰系统（R/M体系），是细菌的一种自我保护作用。
（1）限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断（2）修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
①Dam甲基化酶：G A TC 腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶：C C AGG或C C TGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基1.2限制性内切酶的类型1.2.1 I 型限制性内切酶首先由M. Meselson 和R. Yuan 在1968年从大肠杆菌B 株和K 株分离的，如Eco B 和Eco K 。
（1）识别位点序列：未甲基化修饰的特异序列。
EcoB ：TGA(N)8TGCTEcoK ：AAC(N)6GTGCI 型限制性内切酶II 类限制性内切酶III 类限制性内切酶第二节基因工程的酶学基础第二节基因工程的酶学基础（2）切割位点：在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链。
Recognize site cut1-1.5kb（3）作用机理：需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
1.2.2 II类限制性内切酶首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。
分离的第一个酶是Hind Ⅱ。
（1）识别位点序列：未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），与DNA的来源无关。
（2）切割位点：识别位点处。
切开双链DNA，形成粘性末端（sticky end）或平末端（blunt end）。
EcoR I5’-G AATTC-3’3’-CTTAA G-5’Pst I5’-CTGCA G-3’3’-G ACGTC-5’产生粘性末端EcoR V5’-GAT ATC-3’3’-CTA TAG-5’产生平末端（3）粘性末端：含有几个核苷酸单链的末端。
G AATTC CTTAA GG AATTC CTTAA G 5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’5’端凸出（如EcoR I 切点）CTGCA G 3’端凸出（如Pst I 切点）G ACGTC 5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCA G G ACGTC第二节基因工程的酶学基础第二节基因工程的酶学基础（4）粘性末端的意义①连接便利i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接，这比连接两个平齐末端容易的多。
